柚皮素脂質(zhì)體的制備及體外釋放度的研究

王曉晨　陳　瑩　劉丁銘　王建筑

(泰山醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，山東 泰安　271016)

柚皮素(naringenin)是一種二氫黃酮類化合物，廣泛存在于蕓香科植物中。目前研究發(fā)現(xiàn)柚皮素具有抗腫瘤、抗病毒、保護(hù)肝功能等多種藥理活性[1]。但由于柚皮素分子結(jié)構(gòu)中含有的多個(gè)酚羥基易氧化變質(zhì)，并且由于該藥物水溶性低，所以并不適合直接制備成注射劑進(jìn)行給藥，并且由于其脂溶性也較差，所以口服給藥時(shí)胃腸道吸收差，其絕對(duì)生物利用率極低，所以也不適合直接制成口服制劑給藥，柚皮素的這些結(jié)構(gòu)性質(zhì)限制了其臨床應(yīng)用。脂質(zhì)體(liposome)是由磷脂、膽固醇等脂類材料分散于水中形成的一種封閉囊泡，具有與細(xì)胞膜相類似的磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)[2]，此結(jié)構(gòu)可使不同溶解性的藥物分布于雙分子層之間或內(nèi)水相[3]。20世紀(jì)70年代初，脂質(zhì)體開始作為藥物載體應(yīng)用于藥物傳遞[4]。脂質(zhì)體相比于其他給藥系統(tǒng)具有以下優(yōu)勢(shì)：能增強(qiáng)難溶性藥物的生物利用度，特別是水難溶性的藥物；能提高包載藥物的穩(wěn)定性，并且具有被動(dòng)靶向性，可以提高某些藥物的治療指數(shù)[5]；制備時(shí)所用材料有較好的細(xì)胞親和性和生物降解性。將柚皮素制備成脂質(zhì)體后進(jìn)行給藥，可以提高柚皮素的溶解性，使其體內(nèi)分布具有被動(dòng)靶向性，能夠達(dá)到更好的治療效果。本實(shí)驗(yàn)采用乙醇注入法制備柚皮素脂質(zhì)體混懸液，來(lái)提高藥物的生物利用度，延長(zhǎng)藥物的生物半衰期，并且有利于工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)[6]。

1　材料

柚皮素(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%)；大豆磷脂(上海艾韋特醫(yī)藥科技有限公司，PC含量>95%)；膽固醇(上海金穗生物科技有限公司)；十二烷基硫酸鈉(天津博迪化工股份有限公司)；葡聚糖凝膠G50(如吉生物科技)，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

高效液相色譜儀(UV230Ⅱ，大連依利特分析儀器有限公司)；馬爾文粒徑儀(馬爾文儀器公司(中國(guó)))；光學(xué)顯微鏡(NiKon E100,上海普赫光電科技有限公司)； GL-25M 型高速冷凍離心機(jī)( 長(zhǎng)沙駿逸實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)。

2　試驗(yàn)方法

2.1　柚皮素脂質(zhì)體的制備

用適量乙醇溶解處方量柚皮素、膽固醇和磷脂后，將此混合液通過(guò)蠕動(dòng)泵勻速(0.6 ml/min)緩慢的注入到純化水中，置于恒溫磁力攪拌器中，維持恒溫55℃攪拌一定時(shí)間，然后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀揮去乙醇，在室溫下繼續(xù)磁力攪拌30 min完全除去乙醇，將所得到的混懸液用純化水定容至10ml，即得脂質(zhì)體混懸液。同法制備不加藥物的空白脂質(zhì)體。

2.2　脂質(zhì)體包封率和載藥量的測(cè)定

2.2.1高效液相色譜條件

大連依利特BDSHYPERSILC18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈∶純化水(60∶40)；流速：1 ml/min；柱溫：室溫；檢測(cè)波長(zhǎng)：288 nm；進(jìn)樣量：20 μl。

2.2.2柚皮素標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密稱取10.01 mg柚皮素對(duì)照品，用甲醇溶解制成400 μg·ml-1的儲(chǔ)備液。用甲醇將上述儲(chǔ)備液分別稀釋成濃度為4 μg·ml-1、16 μg·ml-1、24 μg·ml-1、32 μg·ml-1、48 μg·ml-1、64 μg·ml-1、80 μg·ml-1的系列溶液，并分別取20 μl進(jìn)樣高效液相色譜系統(tǒng)，以峰面積(Y)對(duì)濃度(C)進(jìn)行線性回歸，得到濃度對(duì)峰面積的線性回歸方程為Y=48.386C+2.3763，r2=0.9993。結(jié)果表明，在4～80 μg·ml-1的范圍內(nèi)柚皮素的濃度與色譜峰面積線性關(guān)系良好，經(jīng)考察，精密度較好。

2.2.3脂質(zhì)體包封率和載藥量的測(cè)定

采用微柱離心法來(lái)分離柚皮素脂質(zhì)體及游離藥物柚皮素。精密量取脂質(zhì)體混懸液0.2 ml至凝膠微柱的頂端，1500 r·min-1離心3 min，重新加入0.5 ml純水再次以1500 r·min-1離心3 min，重復(fù)2次，收集3次的洗脫液，加甲醇破壞脂質(zhì)體后， 3000 r·min-1離心5 min，按“3.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，將峰面積帶入上述標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算藥物濃度，并計(jì)算藥物的包封率EE%和載藥量DL%。

2.3　脂質(zhì)體粒徑的測(cè)定和外觀形態(tài)觀察

取脂質(zhì)體適量，適當(dāng)稀釋后，用馬爾文激光粒度分析儀進(jìn)行測(cè)定其粒徑和多分散指數(shù)PDI。

取脂質(zhì)體適當(dāng)稀釋后，取少量滴加于銅網(wǎng)上，3%磷鎢酸鈉溶液負(fù)染后，透射電鏡觀察脂質(zhì)體的形態(tài)。

2.4　脂質(zhì)體穩(wěn)定性的測(cè)定

取上述份柚皮素脂質(zhì)體混懸液1000 r·min-1離心3 min，去除未包封的藥物結(jié)晶，將其放入37 ℃空氣浴震蕩器100 r·min-1下震搖，每隔兩小時(shí)取樣并1000 r·min-1離心并顯微鏡下觀察有無(wú)藥物滲漏形成藥物結(jié)晶(因柚皮素在水中的溶解度低，滲漏后易形成藥物的結(jié)晶)。

2.5　藥物體外釋放的測(cè)定

采用體外透析法來(lái)測(cè)定柚皮素脂質(zhì)體的體外釋放過(guò)程。分別取原料藥混懸液和脂質(zhì)體混懸液(均含柚皮素約0.5 mg)置于透析袋中，扎緊兩端，置錐形瓶中，以100 ml純化水為釋放介質(zhì)， 37 ℃水浴下100 r·min-1攪拌，分別于0.25 h、0.5 h、1 h、1.5 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h、8 h、10 h、24 h取樣3 ml，微孔濾膜過(guò)濾后取續(xù)濾液進(jìn)行測(cè)定，同時(shí)補(bǔ)加同溫同體積的釋放介質(zhì)。

3　實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

3.1　包封率和載藥量的測(cè)定

根據(jù)“2.2.3”項(xiàng)下方法，測(cè)得不同處方的柚皮素脂質(zhì)體包封率和載藥量如表1所示。

表1　脂質(zhì)體的包封率和載藥量

由表1數(shù)據(jù)可得，制備的柚皮素脂質(zhì)體包封率在55%～77.3%之間，藥物的載藥量在6.14%～7.8%之間，說(shuō)明制得的柚皮素脂質(zhì)體有較高的包封率和載藥量。

3.2　穩(wěn)定性的測(cè)定

將脂質(zhì)體置于37℃的空氣浴搖床中震搖。不同時(shí)間取出觀察其穩(wěn)定性，其中1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)震搖4h時(shí)即出現(xiàn)明顯藥物的針狀結(jié)晶，說(shuō)明未加膽固醇的脂質(zhì)體膜非常不穩(wěn)定，極易發(fā)生藥物的滲漏。7～9號(hào)脂質(zhì)體在10 h時(shí)開始出現(xiàn)少量的藥物結(jié)晶，而4～6號(hào)脂質(zhì)體24 h才出現(xiàn)少量結(jié)晶，說(shuō)明脂質(zhì)體中適量膽固醇的加入，有利于增加脂質(zhì)體膜的柔韌性和流動(dòng)性，使脂質(zhì)體的穩(wěn)定性增強(qiáng)，減少藥物的滲漏。

3.3　脂質(zhì)體粒徑的測(cè)定

測(cè)得脂質(zhì)體的粒徑為120.2 nm，多分散指數(shù)PDI為0.203。結(jié)果如下圖1所示

圖1　脂質(zhì)體的粒徑分布圖

3.4　藥物體外釋放的測(cè)定

根據(jù)“2.5藥物體外釋放的測(cè)定”項(xiàng)下方法，測(cè)定樣品溶液中柚皮素濃度后計(jì)算不同時(shí)間點(diǎn)柚皮素脂質(zhì)體中的柚皮素體外累積釋放百分率，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，柚皮素累積釋放百分率為縱坐標(biāo)，繪制柚皮素脂質(zhì)體的體外釋放曲線，如圖2。

圖2　柚皮素原料藥混懸液和脂質(zhì)體的體外釋放曲線

由圖2可知，柚皮素原料藥在5 h時(shí)釋放即達(dá)到90%以上，而柚皮素脂質(zhì)體12 h累積釋放量才接近80%，說(shuō)明柚皮素脂質(zhì)體具有明顯的緩釋效果。

4　結(jié)　論

在脂質(zhì)體眾多制備方法中，經(jīng)典的薄膜分散法適合于脂溶性藥物，但所制備的脂質(zhì)體粒徑往往較大[7]，且柚皮素脂溶性較差，并不適合用于柚皮素制備脂質(zhì)體。水溶性藥物制備脂質(zhì)體適合選擇逆向蒸發(fā)法，但制備過(guò)程往往需要使用氯仿等毒性較大的有機(jī)溶劑。柚皮素在醇中有較大的溶解度，并且乙醇注入法制備過(guò)程簡(jiǎn)單，操作條件溫和，有利于保持藥物穩(wěn)定性。柚皮素屬于二氫黃酮類化合物，溶解性較差，限制了其臨床應(yīng)用，將柚皮素采用乙醇注入法制備成脂質(zhì)體后，可以提高柚皮素的溶解性和生物利用度，增加療效[8]。

在測(cè)定包封率和載藥量時(shí)，分離脂質(zhì)體與游離性藥物是關(guān)鍵步驟。目前，常用的方法有離心法、超濾法、微柱離心法，透析法等。本實(shí)驗(yàn)采用微柱離心法是利用了微柱中的葡聚糖凝膠能夠吸附游離的柚皮素藥物，而其中的脂質(zhì)體則直接隨洗脫溶劑流出，因此可以有效地將游離藥物與脂質(zhì)體分離[9]。通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，采用SephadexG-50微柱，以純化水洗脫3次時(shí)，可以基本上將藥物和脂質(zhì)體分離，所以本實(shí)驗(yàn)選擇此法來(lái)測(cè)定柚皮素脂質(zhì)體包封率和載藥量。

制備過(guò)程中發(fā)現(xiàn)藥物濃度對(duì)柚皮素脂質(zhì)體的包封率影響較大，因此可采用適當(dāng)?shù)姆椒ㄟM(jìn)行優(yōu)化。試驗(yàn)結(jié)果表明，磷脂、藥物、膽固醇在7∶1∶1(w/w)時(shí),制備的脂質(zhì)體包封率最高，制備的柚皮素脂質(zhì)體粒徑在120 nm左右，粒徑分布均勻(PDI=0.203)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明乙醇注入法用于制備柚皮素脂質(zhì)體工藝方法簡(jiǎn)單可行，重現(xiàn)性好，制備過(guò)程中避免了使用氯仿等毒性大的有機(jī)溶劑，易于實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)；所制得的柚皮素脂質(zhì)體藥物包封率較高、粒徑較小且均勻、穩(wěn)定性高。

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