澤瀉對(duì)脾虛大鼠骨骼肌線粒體結(jié)構(gòu)的影響

張亞敏 林文津 徐小妹 徐榕青 劉鵬 孫鳳靈

【摘要】 目的：觀察澤瀉對(duì)脾虛大鼠骨骼肌線粒體結(jié)構(gòu)的影響。方法：采用小承氣湯建立脾虛大鼠模型，采用高、中、低三個(gè)不同劑量澤瀉提取物（6.0、3.0、1.5 g/kg）對(duì)脾虛大鼠進(jìn)行干預(yù)，陽性對(duì)照組灌飼四君子湯（10.5 g/kg），空白對(duì)照組灌飼等體積生理鹽水，每日1次連續(xù)灌飼2周后，迅速取骨骼肌，分別制作骨骼肌光鏡與電鏡切片，光鏡觀察骨骼肌組織、電鏡檢測(cè)骨骼肌線粒體超微結(jié)構(gòu)。結(jié)果：脾虛模型組大鼠骨骼肌細(xì)胞膜破裂變性，細(xì)胞邊界模糊，肌間間隔無法分辨，線粒體外膜溶解，內(nèi)嵴消失，周圍的糖原顆粒明顯減少；不同劑量澤瀉干預(yù)組大鼠骨骼肌細(xì)胞邊界有所恢復(fù)，肌間間隔也可以不同程度地分辨出來，線粒體外膜完整，內(nèi)嵴較為清晰，同時(shí)周圍有明顯的糖原顆粒，不同劑量澤瀉組對(duì)骨骼肌顯微結(jié)構(gòu)及線粒體結(jié)構(gòu)均有改善作用，且改善程度隨澤瀉劑量的提高而增強(qiáng)，呈劑量依賴性。結(jié)論：澤瀉對(duì)脾虛大鼠骨骼肌組織及線粒體結(jié)構(gòu)具有改善作用，為進(jìn)一步研究澤瀉養(yǎng)五臟、益氣力的作用機(jī)制奠定了科學(xué)基礎(chǔ)。

【關(guān)鍵詞】 澤瀉； 脾虛； 骨骼肌； 線粒體； 超微結(jié)構(gòu)

【Abstract】 Objective：To observe the effect of Rhizoma Alismatis Extract（RAE）on skeletal muscle mitochondrial structure of rats with spleen asthenia in vivo.Method：The rat model of spleen asthenia used Xiao Chengqi Decoction.Rhizoma Alismatis high，medium and low dose groups treated with RAE（6.0，3.0，

1.5 g/kg），the positive group treated with Sijunzi Decoction（10.5 g/kg），the normal control group dealt with same volume of saline，administration once daily，after two weeks，skeletal muscle were separated，slices of two tissue were prepared，skeletal muscle and mitochondrial ultrastructure were detected by light microscopy and electron microscopy.Result：In the spleen asthenia group，skeletal muscle membranolysis，cell boundary were obscure，interval were unable to distinguish，mitochondrial outer membrane dissolved，mitochondrial crista disappeared，the number of glycogenosome decreased.In the different doses RAE treated group，skeletal muscle cell boundary recovered，interval were able to distinguish，mitochondrial outer membrane were unbroken，crista were distinct，glycogenosome increased.Compared with the spleen asthenia group，RAE would improve the spleen asthenia rats mitochondrial structure and function，appeare dose-dependent manner tendency.Conclusion：RAE could improve skeletal muscle，mitochondrial ultrastructure of rats with spleen asthenia，which provide a theoretical foundation and scientific basis for further study the effect of “nourish the five internal organs and benefit the Qili” of Rhizoma Alismatis Extract.

【Key words】 Rhizoma Alismatis Extract； Spleen Asthenia； Skeletal muscle； Mitochondrial； Ultrastructure

First-authors address：Fujian Academy of Medical Sciences，F(xiàn)ujian Key Laboratory of Medical Measurement，F(xiàn)uzhou 350001，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.05.001

澤瀉為澤瀉科植物澤瀉Alisma orientalis（Sam.） Juzep.的干燥塊莖，性寒，味甘、淡，歸腎、膀胱經(jīng)，具有利水滲濕、泄熱、化濁降脂的功效[1]。始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品，具有養(yǎng)五臟、益氣力、肥健之功效[2-3]?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，中藥澤瀉具有利尿[4]、降血脂[5-7]、降血糖[8]、抗感染[9-10]、保肝[9，11-14]、抗動(dòng)脈粥樣硬化[15]、防治骨質(zhì)疏松[16-17]等作用。線粒體是細(xì)胞內(nèi)氧化磷酸化和形成腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）的主要場(chǎng)所，有細(xì)胞“動(dòng)力工廠”之稱。細(xì)胞損傷的自我修復(fù)、凋亡，糖脂代謝、腫瘤的發(fā)生以及衰老等多種病理生理過程都伴隨著線粒體的能量代謝[18]。文獻(xiàn)[19-21]從線粒體能量代謝角度探討脾虛及健脾藥效，前文筆者報(bào)道了不同澤瀉提取物及23-乙酰澤瀉醇B對(duì)細(xì)胞線粒體能量代謝的影響[22-23]，并發(fā)現(xiàn)了澤瀉湯對(duì)高脂血癥大鼠肝臟線粒體能量代謝影響的相關(guān)蛋白[24]。本文通過觀察澤瀉對(duì)脾虛大鼠骨骼肌及其線粒體結(jié)構(gòu)功能影響，為研究澤瀉養(yǎng)五臟，益氣力的作用機(jī)制提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 澤瀉藥材（批號(hào)：20150523）采集自福建省南平市建甌吉陽鎮(zhèn)，經(jīng)福建省建甌市吉陽鎮(zhèn)農(nóng)技站站長(zhǎng)葛培盛鑒定為澤瀉科植物澤瀉Alisma orientalis（Sam.）Juzep.的干燥塊莖。甲醛、乙醇、蘇木精染液、鹽酸、伊紅、二甲苯、中性樹膠、硬脂酸、石蠟等為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器 Synergy2多功能酶標(biāo)儀（BIO-TEK公司）、脫水機(jī)（湖北省孝感市亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司）、YB-6LF型生物組織石蠟包埋機(jī)（湖北省孝感市亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司）、BA-400型熒光雙目光學(xué)顯微鏡（加拿大Motic公司）；石蠟切片機(jī)、半薄切片機(jī)、光學(xué)顯微鏡、超薄切片機(jī)（德國(guó)徠卡儀器有限公司）、透射電鏡（日本日立電鏡有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)SD大鼠，由上海斯萊克公司提供，雌雄各半，平均體重（200±20）g，光/暗周期為12/12 h，光照時(shí)間7：00～19：00，溫度為（23.0±0.5）℃?？諝饬魍?，相對(duì)濕度在40%～50%間，大鼠可自由獲得飼料和飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后開始進(jìn)行造模實(shí)驗(yàn)。本院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（閩）2016-0004。

1.4 分組與給藥 SD大鼠60只，隨機(jī)分為六組（空白對(duì)照組、脾虛模型組、陽性對(duì)照組、澤瀉高劑量組、澤瀉中劑量組、澤瀉低劑量組），每組10只，雌雄各半。除空白對(duì)照組外，其余五組每日灌飼小承氣湯煎劑（大黃∶厚樸∶枳實(shí)=4∶5∶3），灌飼劑量為10 mL/kg，濃度為6 g生藥/mL，空白對(duì)照組灌飼等體積生理鹽水，隔日半量進(jìn)食，自由飲水。連續(xù)灌飼4周后，陽性對(duì)照組灌飼四君子湯（灌飼劑量10.5 g/kg），澤瀉高、中、低劑量組分別灌飼澤瀉提取物（灌飼劑量6.0、3.0、1.5 g/kg），空白對(duì)照組及脾虛模型組給等體積生理鹽水。每日1次連續(xù)灌飼2周后，采用水合氯醛麻醉，迅速對(duì)大鼠骨骼肌進(jìn)行取材。

1.5 肝臟組織形態(tài)學(xué)檢測(cè) 經(jīng)取材、固定、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、染色后觀察不同組大鼠骨骼肌切片顯微結(jié)構(gòu)。

1.6 肝臟組織超微結(jié)構(gòu)觀察 經(jīng)取材、前固定、漂洗、后固定、漂洗、脫水、浸透、包埋、聚合、切片、染色后觀察骨骼肌線粒體超微結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果

2.1 大鼠骨骼肌切片顯微結(jié)構(gòu)光鏡觀察結(jié)果 空白對(duì)照組骨骼肌肌細(xì)胞無明顯腫脹，細(xì)胞膜光滑完整，肌間間隔均勻且細(xì)胞邊界清晰可見，肌間隔有少量紅細(xì)胞，細(xì)胞核的含量較多；脾虛模型組大鼠的細(xì)胞膜已經(jīng)破裂變性，大部分細(xì)胞膜已經(jīng)溶解，細(xì)胞邊界非常模糊，肌間間隔分辨不出來；澤瀉低劑量組大鼠骨骼肌部分細(xì)胞可以看到細(xì)胞邊界，細(xì)胞膜也較為完整；澤瀉中劑量組大鼠骨骼肌的邊界大部分已經(jīng)可以清晰地分辨出來，細(xì)胞膜也很完整；澤瀉高劑量組大鼠骨骼肌細(xì)胞間的邊界明顯，細(xì)胞膜完整，同時(shí)有的肌間間隔很容易分辨，但是仍然有一部分細(xì)胞的肌間間隔不易分辨；陽性給藥組的大鼠骨骼肌細(xì)胞無明顯腫脹，細(xì)胞膜光滑完整，所有細(xì)胞肌間間隔均勻且細(xì)胞邊界清晰可見，細(xì)胞核的含量較多。各組大鼠骨骼肌切片顯微結(jié)構(gòu)，見圖1。

2.2 大鼠骨骼肌線粒體電鏡觀察結(jié)果 空白對(duì)照組骨骼肌在40 000倍透射電鏡下可以清晰地看到平行肌絲構(gòu)成的肌原纖維，肌絲的粗細(xì)非常清晰，并有明暗相間的橫紋，同時(shí)還可以看到，在明帶中央由電子密度較深的Z線，在暗帶中部有較明的H帶。肌原纖維之間橢圓形封閉的囊狀結(jié)構(gòu)為線粒體，線粒體外膜結(jié)構(gòu)完整，有內(nèi)外兩層，內(nèi)層結(jié)構(gòu)折疊形成嵴，線粒體排列較為整齊，同時(shí)還可以看到線粒體周邊存在大量的糖原顆粒。脾虛模型組骨骼肌在透射電鏡下雖然也可以看到平行肌絲構(gòu)成的肌原纖維，且粗絲、細(xì)絲結(jié)構(gòu)較為清晰，但是大多數(shù)的線粒體結(jié)構(gòu)已經(jīng)發(fā)生明顯變化，有的線粒體外膜已經(jīng)溶解，有的線粒體內(nèi)部的嵴已經(jīng)消失形成空泡，甚至發(fā)生腫脹，線粒體周圍的糖原顆粒也明顯減少；澤瀉低劑量組內(nèi)一部分線粒體結(jié)構(gòu)明顯發(fā)生變化，內(nèi)嵴消失空泡，甚至發(fā)生腫脹，但是依舊可以看到一部分細(xì)胞膜比較完整，能呈現(xiàn)出較為完整的線粒體結(jié)構(gòu)；澤瀉中劑量組可以明顯看到一些完整的線粒體結(jié)構(gòu)，外膜完整，未發(fā)生溶解，但是線粒體大小懸殊，一些線粒體外膜發(fā)生溶解，且糖原顆粒較少；高劑量組可見一些非常完整的線粒體，線粒體外膜結(jié)構(gòu)完整，內(nèi)層結(jié)構(gòu)折疊形成嵴也較為清晰，同時(shí)周圍有明顯的糖原顆粒；陽性給藥組線粒體外膜結(jié)構(gòu)完整，嵴清晰，周圍有較多明顯的糖原顆粒。各組大鼠骨骼肌切片電鏡照片，見圖2。

3 討論

目前脾虛動(dòng)物模型的研究較為全面，主要包括苦寒瀉下法、破氣耗氣法、飲食傷脾法、偏食五味法、勞倦傷脾法、理化因素?fù)p傷法、復(fù)合因素造模法等[25]。本研究采用的破氣耗氣法是依據(jù)脾虛忌下，長(zhǎng)期或過用廣豆根、檳榔、厚樸、枳實(shí)、厚樸等破氣降氣中藥，逆脾氣主升之性從而造成脾氣虛證。破氣耗氣法是由苦寒瀉下法演變而成，主要是為了延長(zhǎng)造模時(shí)間，避免傷陰、傷陽和導(dǎo)致中氣下陷。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，建立的脾虛模型大鼠體重增速明顯降低，活動(dòng)程度明顯下降，毛色差，糞便稀，符合中醫(yī)脾氣虛證相關(guān)指標(biāo)。

骨骼肌作為大鼠的主要運(yùn)動(dòng)組織，需要消耗大量的能量進(jìn)行伸縮活動(dòng)，內(nèi)含較多的線粒體，當(dāng)外部環(huán)境發(fā)生變化導(dǎo)致線粒體能量代謝發(fā)生障礙的時(shí)候，會(huì)影響骨骼肌線粒體的功能，在線粒體的結(jié)構(gòu)上亦可表現(xiàn)出來。光鏡與透射電鏡觀察結(jié)果表明，澤瀉各給藥組能改善脾虛大鼠骨骼肌及其線粒體超微結(jié)構(gòu)，而且澤瀉的作用隨著給藥劑量的增加而加強(qiáng)，呈現(xiàn)出劑量依賴性，另外實(shí)驗(yàn)過程中筆者還初步檢測(cè)了線粒體膜電位、ATP含量、琥珀酸脫氫酶（SDH）、活性氧簇（ROS）活性等指標(biāo)，初步結(jié)果也支持這一結(jié)論，與文獻(xiàn)[22-23]報(bào)道的研究結(jié)果一致。

試驗(yàn)設(shè)計(jì)過程中，筆者還選擇了胃黏膜組織進(jìn)行線粒體結(jié)構(gòu)和功能的檢測(cè)，但試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，胃黏膜上線粒體較少，線粒體功能指標(biāo)組內(nèi)差異較大，有可能是胃黏膜取樣時(shí)，取樣難度較大，花費(fèi)的時(shí)間較長(zhǎng)，此時(shí)線粒體已損傷，再檢測(cè)膜電位等指標(biāo)時(shí)，已不能反映體內(nèi)的實(shí)際情況，誤差較大，不適合作為脾虛治療效果好壞的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，骨骼肌相對(duì)來說線粒體含量較高，所以受實(shí)驗(yàn)操作的影響較小，可以部分線粒體活性指標(biāo)反映出線粒體能量代謝的情況。

清代醫(yī)學(xué)家陳修園在《神農(nóng)本草經(jīng)讀》中提到：“五臟主藏陰，而脾為五臟之原，一得水精之氣則能灌溉四旁，俾五臟循環(huán)而受益，不特肥健消水不饑，見本藏之功”。因此，筆者推測(cè)陳修園所謂澤瀉的“養(yǎng)五臟、益氣力”功效，其機(jī)制可能與澤瀉能夠改善骨骼肌線粒體能量代謝有關(guān)，其具體分子機(jī)制還有待于下一步研究。

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