不同來(lái)源精子應(yīng)用于ICSI治療的早期臨床結(jié)局

湯友苗 王興玲 婁華 喬玉蓮 杜明澤

【摘要】 目的：比較不同來(lái)源精子應(yīng)用于卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射（ICSI）治療的胚胎發(fā)育及早期臨床結(jié)局。方法：回顧性分析2014年1月-2016年6月因男性因素在鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院生殖中心行ICSI治療的1 732個(gè)新鮮移植周期。根據(jù)精子來(lái)源分為：A組射精組（n=1 253），B組經(jīng)皮附睪精子抽吸（PESA）組（n=418），C組經(jīng)皮睪丸精子取精（TESA）組（n=61）。比較三組正常受精率、正常卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、臨床妊娠率、異位妊娠率、流產(chǎn)率、活產(chǎn)率及早產(chǎn)率。結(jié)果：C組的正常受精率、正常卵裂率均低于A組和B組（P<0.05），B組優(yōu)質(zhì)胚胎率高于A組和C組（P<0.05），B組臨床妊娠率高于A組（P<0.05），三組異位妊娠率、流產(chǎn)率、活產(chǎn)率及早產(chǎn)率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論：PESA和TESA均可以用于梗阻性無(wú)精子癥患者的助孕，但就早期胚胎質(zhì)量和臨床妊娠率綜合考慮，經(jīng)皮附睪取精行卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射術(shù)更優(yōu)。

【關(guān)鍵詞】 卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射； 精子來(lái)源； 經(jīng)皮附睪精子抽吸術(shù)； 經(jīng)皮睪丸精子取精術(shù)；妊娠結(jié)局

【Abstract】 Objective：To compare the embryonic development and early clinical outcomes of intracytoplasmic sperm injection（ICSI） with sperm from different sources.Method：The date of 1 732 cases received ICSI from January 2014 to June 2016 in Reproductive Medicine Center of the Third Affiliated Hospital of Zhengzhou University was analyzed retrospectively.According to the source of sperm，all cases were divided into group A（ejaculation group，n=1 253），group B[percutaneous epididymal sperm aspiration（PESA），n=418]，group C[testicular sperm extraction（TESA），n=61].The embryonic development and pregnancy outcomes among three groups were compared.Result：The rate of normal fertilization and cleavage in group C were significantly lower than those in group A and group B（P<0.05）.Group B had more good-quality embryo than those of group A and group C（P<0.05）.The clinical pregnancy rate in group B was higher than that in group A（P<0.05）.There were no significant differences in ectopic pregnancy rate，abortion rate，live birth rate and premature delivery rate among three groups（P>0.05）.Conclusion：PESA and TESA can be used in patients with obstructive azoospermia.However，considering the early embryonic quality and clinical pregnancy rate，PESA-ICSI is better.

【Key words】 Intracytoplasmic sperm injection； Sperm source； Percutaneous epididymal sperm aspiration； Testicular sperm extraction； Pregnancy outcome

First-authors address：The Third Affiliated Hospital of Zhengzhou University，Zhengzhou 450052，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.05.006

近年來(lái)，不孕不育發(fā)病率大幅上升，有資料顯示全球不孕不育夫婦比例占15%，其中男性因素約占50%[1]。自Palermo等[2]首次用卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射術(shù)（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）使體外受精（in-vitro fertilisation，IVF）或者透明帶下人工授精（subzonal insemination，SUZI）不能妊娠的女性成功生育后，該技術(shù)便受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注和研究。ICSI技術(shù)是借助顯微操作系統(tǒng)將單個(gè)精子直接注射入卵母細(xì)胞質(zhì)內(nèi)使其受精，它對(duì)精子數(shù)量和質(zhì)量的要求大大降低，這對(duì)重度少弱精以及因梗阻性無(wú)精子癥需要睪丸或者附睪取精的男性不育癥患者具有重大意義。目前應(yīng)用于ICSI治療的精子來(lái)源主要有三種：一種是射出精子，另外兩種是經(jīng)皮附睪精子抽吸術(shù)（percutaneous epididymal sperm aspiration，PESA）和經(jīng)皮睪丸精子取精術(shù)（testicular sperm extraction，TESA）獲得的精子[3]。不同來(lái)源的精子在結(jié)構(gòu)、成熟度、活動(dòng)力等方面均存在差異，而這種差異是否會(huì)影響早期胚胎質(zhì)量和妊娠結(jié)局，國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)結(jié)果不一，值得進(jìn)一步研究。本研究回顧性分析因男性因素在鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院進(jìn)行ICSI治療的臨床病例，旨在比較不同精子來(lái)源應(yīng)用于ICSI治療的胚胎發(fā)育情況及早期臨床結(jié)局，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性分析2014年1月-2016年6月因男性因素在鄭大三附院行ICSI治療的1 732個(gè)新鮮移植周期。根據(jù)精子來(lái)源分為射精組（A組）、PESA組（B組）及TESA組（C組）。男方為單純性的重度少弱精子癥（精子濃度<5×106/mL和/或b+c級(jí)<30%，a級(jí)為0）患者入選為A組，共1 253個(gè)周期；男方為梗阻性無(wú)精子癥（至少三次精液常規(guī)檢查并離心沉淀鏡檢未發(fā)現(xiàn)精子，睪丸或附睪穿刺證實(shí)有精子）患者入選為B組，共418個(gè)周期；經(jīng)PESA未獲得精子的梗阻性無(wú)精子癥患者入選為C組，共61個(gè)周期。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）男女雙方染色體均正常；（2）女方年齡<40歲；（3）不孕年限≤15年；（4）女方基礎(chǔ)卵泡刺激素（FSH）<10 mIU/mL；（5）女方體重指數(shù)（body mass index，BMI）介于18～25 kg/m2。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）女方患子宮內(nèi)膜異位、子宮畸形、子宮多發(fā)性息肉及全身性疾病（如高血壓、糖尿?。?；（2）獲卵總數(shù)<3個(gè)；（3）免疫性不孕；（4）數(shù)據(jù)資料不完整者。該研究已經(jīng)倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 控制性超促排卵與取卵 根據(jù)患者個(gè)人情況采用本中心常規(guī)長(zhǎng)方案/短方案/微刺激方案進(jìn)行促排卵，當(dāng)有2個(gè)以上優(yōu)勢(shì)卵泡直徑≥18～20 mm時(shí)，皮下注射重組人絨促性素注射液250 μg，36～40 h后在陰道超聲引導(dǎo)下行陰道后穹隆穿刺取卵術(shù)，取卵2 h后用透明質(zhì)酸酶進(jìn)行脫顆粒處理，然后置于G1培養(yǎng)液中備用，選取成熟卵子（MⅡ期）待行ICSI注射。

1.2.2 精子獲取與處理 A組患者取精前禁欲3～7 d，取卵當(dāng)天采用手淫方式留取精液標(biāo)本，然后采用Puresperm密度梯度離心法處理精液，選擇活動(dòng)精子行ICSI。B組患者取仰臥位，常規(guī)消毒鋪巾后選擇穿刺點(diǎn)，將2%利多卡因注射在陰囊部精索內(nèi)，阻滯麻醉精索神經(jīng)。注射器連接頭皮靜脈針，術(shù)者左手將附睪固定于陰囊皮下，將針頭直接經(jīng)皮刺入附睪頭，助手持注射器抽吸附睪液，抽出淡黃色渾濁附睪液，于倒置顯微鏡下觀察有無(wú)活動(dòng)精子，如果有則采用密度梯度離心法處理標(biāo)本，如果無(wú)則行對(duì)側(cè)附睪抽吸。結(jié)束后稍壓迫穿刺點(diǎn)至無(wú)出血，無(wú)菌敷料覆蓋。C組患者體位、消毒、麻醉同B組，術(shù)者左手固定睪丸，選擇無(wú)血管區(qū)域，持注射器直接經(jīng)皮刺入睪丸（有落空感）進(jìn)行睪丸穿刺，將取得的標(biāo)本放于倒置顯微鏡下觀察有無(wú)活動(dòng)精子，若有吹打混勻后采用直接離心法處理標(biāo)本。結(jié)束后稍壓迫穿刺點(diǎn)至無(wú)出血，無(wú)菌敷料覆蓋。

1.2.3 受精、胚胎發(fā)育及妊娠評(píng)估 ICSI 16～18 h后觀察卵母細(xì)胞的受精情況，觀察到雌雄兩原核（2PN，pronucleus）者為正常受精，第2、3天觀察胚胎卵裂情況，根據(jù)卵裂球的數(shù)目、均一性、胞漿及碎片比例進(jìn)行評(píng)分，第3天根據(jù)患者情況和胚胎質(zhì)量進(jìn)行移植，移植后給予常規(guī)黃體支持。移植后14 d進(jìn)行尿hCG和血β-hCG檢測(cè)，移植后35 d進(jìn)行超聲檢查可見(jiàn)妊娠囊及原始心管搏動(dòng)定義為臨床妊娠，受精卵在子宮腔外著床定義為異位妊娠，妊娠不足28周、胎兒體重不足1 000 g而終止者定義為流產(chǎn)，妊娠滿(mǎn)28周至不足37周（196～258 d）間分娩者定義為早產(chǎn)。

1.3 觀察指標(biāo) 分析三組正常受精率、正常卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、臨床妊娠率、異位妊娠率、流產(chǎn)率、活產(chǎn)率、早產(chǎn)率。2PN受精率=2PN卵子數(shù)/ICSI患者的成熟卵子數(shù)×100%，2PN卵裂率=2PN卵裂數(shù)/2PN卵子數(shù)×100%，優(yōu)質(zhì)胚胎率=優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)/2PN卵裂數(shù)×100%，臨床妊娠率=臨床妊娠數(shù)/移植周期數(shù)×100%，異位妊娠率=異位妊娠數(shù)/臨床妊娠數(shù)×100%，流產(chǎn)率=流產(chǎn)數(shù)/臨床妊娠數(shù)×100%，活產(chǎn)率=有活產(chǎn)嬰兒出生的分娩次數(shù)/移植周期數(shù)×100%，早產(chǎn)率=早產(chǎn)數(shù)/臨床妊娠數(shù)×100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 20.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，比較采用單因素方差分析；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較采用行×列 字2檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組一般資料比較 三組女方年齡、男方年齡、女方BMI、不孕年限、基礎(chǔ)FSH、基礎(chǔ)雌二醇（E2）、基礎(chǔ)促黃體生成素（LH）、移植日內(nèi)膜厚度、獲卵總數(shù)及成熟卵子數(shù)比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性，見(jiàn)表1。

2.2 三組胚胎發(fā)育情況比較 C組2PN受精率和2PN卵裂率均低于A組與B組，B組優(yōu)質(zhì)胚胎率高于A組和C組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表2。

2.3 三組妊娠結(jié)局比較 B組臨床妊娠率高于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；三組異位妊娠率、流產(chǎn)率、活產(chǎn)率、早產(chǎn)率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。見(jiàn)表3。

3 討論

近年來(lái)，由于受社會(huì)與生活環(huán)境、家庭與工作壓力、不良生活習(xí)慣等諸多因素的綜合影響，男性生育力呈現(xiàn)逐年下降的趨勢(shì)，男性不育已成為嚴(yán)重影響社會(huì)安全、家庭質(zhì)量的公共健康問(wèn)題。重度少弱精及梗阻性無(wú)精子癥是男性不育病因中的兩種，對(duì)于梗阻性無(wú)精子癥的治療可以通過(guò)外科手術(shù)獲得自然妊娠，也可以通過(guò)PESA或TESA結(jié)合ICSI獲得自己的后代。本文主要探討通過(guò)PESA、TESA取精結(jié)合ICSI和重度少弱精行ICSI所產(chǎn)生的早期胚胎發(fā)育及妊娠結(jié)局。

對(duì)于不同來(lái)源精子行ICSI的胚胎發(fā)育情況來(lái)說(shuō)，文獻(xiàn)[4-6]指出ICSI中使用不同來(lái)源精子可獲得相似的受精率，卵裂率和優(yōu)質(zhì)胚胎率。本研究結(jié)果顯示三組2PN受精率，2PN卵裂率及優(yōu)質(zhì)胚胎率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），這與國(guó)內(nèi)外一些學(xué)者的結(jié)果相似[7-10]。本研究中C組2PN受精率和卵裂率均顯著低于A組與B組，B組優(yōu)質(zhì)胚胎率高于A組和C組，得出睪丸精子與射出精子和附睪精子行ICSI相比，受精能力降低，胚胎質(zhì)量較差。正常情況下，精子在睪丸精曲小管形成后，生理上還不成熟，不能活動(dòng)或活動(dòng)能力很弱，無(wú)受精能力，只有經(jīng)過(guò)附睪，在附睪內(nèi)（14 d左右）從周?chē)崭鞣N物質(zhì)，發(fā)生一系列形態(tài)、生理和生化方面的變化，從而完成成熟過(guò)程，具備受精能力；Huang等[11]研究指出睪丸精子與射出精子相比，成熟度降低，濃度和活力下降，畸形率升高，染色體異常的比例也增加，這些原因可能導(dǎo)致睪丸精子受精率低、胚胎質(zhì)量下降。

對(duì)于不同來(lái)源精子行ICSI的早期臨床妊娠結(jié)局來(lái)說(shuō)，本研究結(jié)果顯示PESA組臨床妊娠率高于射精組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），這與于洪君等[9]結(jié)果相似，董瑞娜等[8]對(duì)3 106個(gè)不同來(lái)源精子ICSI周期進(jìn)行分析，也得出PESA組臨床妊娠率顯著高于射出組。早前就有研究顯示對(duì)于同一個(gè)體來(lái)說(shuō)，射出精子可能缺少細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)支持，加劇氧化應(yīng)激對(duì)精子細(xì)胞成分的影響，導(dǎo)致它的DNA斷裂相應(yīng)增加，妊娠率明顯降低[11]，國(guó)外文獻(xiàn)[12-14]也報(bào)道精子在通過(guò)男性生殖道時(shí)可能會(huì)受到損傷，就DNA的完整性而言精子質(zhì)量會(huì)降低。本研究中射精組為重度少弱精患者，此類(lèi)患者受精過(guò)程多因基因、內(nèi)分泌、免疫等因素而引起異常，從而導(dǎo)致精子數(shù)量、形態(tài)、活動(dòng)能力和功能的異常；相比而言，PESA組患者不孕原因多為輸精管梗阻，自身生精功能無(wú)明顯異常，這方面也可能是導(dǎo)致PESA組患者妊娠率高于射出組的原因。本研究結(jié)果還顯示，三組異位妊娠率、流產(chǎn)率、活產(chǎn)率及早產(chǎn)率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），這與大多數(shù)學(xué)者研究結(jié)果一致[8-9，15-16]，認(rèn)為妊娠后胎兒發(fā)育情況與精子的來(lái)源關(guān)系不大。

綜上所述，重度少弱精及PESA、TESA取精結(jié)合ICSI均可以用于男性不育患者的助孕手段，就早期胚胎發(fā)育和臨床妊娠率綜合方面考慮，經(jīng)皮附睪精子抽吸術(shù)行ICSI可能結(jié)果更令人滿(mǎn)意。但I(xiàn)CSI技術(shù)人為地將精子注射入卵母細(xì)胞內(nèi)，可能存在表觀遺傳學(xué)的改變，這就增加了子代安全性的風(fēng)險(xiǎn)。所以臨床上行ICSI治療的患者均應(yīng)該進(jìn)行染色體檢查，遺傳學(xué)評(píng)估，以提高子代安全性。此外由于本研究樣本量小，局限于胚胎早期發(fā)育和臨床妊娠方面，缺少對(duì)后期結(jié)局和子代安全性的觀察，所以仍需要大樣本、長(zhǎng)期隨訪(fǎng)。

參考文獻(xiàn)

[1] Lee L K，F(xiàn)oo K Y.Recent insights on the significance of transcriptomic and metabolomic analysis of male factorinfertility[J].Clin Biochem，2014，47（10-11）：973-982.

[2] Palermo G，Joris H，Devroey P，et al.Pregnancies after intracytoplasmic injection of single spermatozoon into an oocyte[J].The Lancet，1992，340（8810）：17-18.

[3] Esteves S C，Miyaoka R，Agarwal A.Sperm retrieval techniques for assisted reproduction[J].Int Braz J Urol，2011，37（5）：570-583.

[4] Buffat C，Patrat C，Merlet F，et al.ICSI outcoes in obstructive azoospermia：influence of the origin of surgically retrieved spermatozoa and the cause of obstruction[J].Hum Reprod，2006，21（4）：1018-1024.

[5] Berger D S，Abdelhafez F，Russell H，et al.Severe teratozoospermia and its influence on pronuclear morphology，embryonic cleavage and compaction[J].Reprod Biol Endocrinol，2011，9：37.

[6] Amirjannati N，Heidari-Vala H，Akhondi M A，et al.Comparison of intracytoplasmic sperm injection outcomes between spermatozoa retrieved from testicular-biopsy and from ejaculation in cryptozoospermic men[J].Andrologia，2012，44（s1）：704-709.

[7] Hameed，Ozturk O.Testicular versus epididymal spermatozoa in intracytoplasmic sperm injection treatment cycles[J].Ayub Med Coll Abbottabad，2012，22（4）：159-163.

[8]董瑞娜，郭藝紅，孫瑩璞，等.3106個(gè)不同來(lái)源精子ICSI周期臨床妊娠結(jié)局分析[J].生殖與避孕，2013，33（4）：233-238.

[9]于洪君，許蓬，孫曉玲，等.不同來(lái)源精子ICSI妊娠結(jié)局的初步探討[J].中國(guó)性科學(xué)，2015，24（7）：71-73.

[10]陳潤(rùn)強(qiáng)，冼英杰，張昭，等.不同來(lái)源精子對(duì)卵胞內(nèi)單精子注射術(shù)妊娠結(jié)局的影響[J/OL].中華臨床醫(yī)師雜志：電子版，2016，10（10）：1491-1493.

[11] Huang Y，Liu Y H，Chen Y，et al.Peripheral nerve lesion induces an up-regulation of Spy1 in rat spinal cord[J].Cell Mol Neurobiol，2009，29（3）：403-411.

[12] Greco E，Scarselli F，Iacobelli M，et al.Efficient treatment of infertility due to sperm DNA damage by ICSI with testicular spermatozoa[J].Hum Reprod，2005，20（1）：226-230.

[13] Ketabchi A A.Intracytoplasmic sperm injection outcomes with freshly ejacuated sperms and testicular or epididymal sperm extraction in patients with idiopathic cryptozoospermia[J].Nephrourol Mon，2016，8（6）：e41375.

[14] Palermo G D，Neri Q V，Schlegel P N，et al.Intracytoplasmic sperm injection（ICSI） in extreme cases of male infertility[J].PLoS One，2014，9（12）：e113671.

[15] Abhyankar N，Kathrins M，Niederberger C.Use of testicular versus ejaculated sperm for intracytoplasmic sperm injection among men with cryptozoospermia：a meta-analysis[J].Fertil steril，2016，105（6）：1469-1475.

[16]倪曉蓓，王珊珊，徐志鵬，等.父方年齡及精子來(lái)源對(duì)ICSI周期臨床結(jié)局的影響[J].生殖醫(yī)學(xué)雜志，2017，26（1）：29-33.