lncRNA MIAT通過(guò)miR-203調(diào)控NPAS4促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移的機(jī)制研究

劉丹，吳瑾，周紅鳳，劉東輝，胡曉薇

【提要】目的 本研究通過(guò)體外培養(yǎng)胃癌細(xì)胞HGC-27，探究lncRNA MIAT能否通過(guò)靶向miR-203調(diào)控神經(jīng)元PAS結(jié)構(gòu)域蛋白4(NPAS4)促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移。方法 體外培養(yǎng)HGC-27與GES-1細(xì)胞，qRT-PCR法檢測(cè)各細(xì)胞中l(wèi)ncRNA MIAT、miR-203、NAPS4 mRNA表達(dá)。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證lncRNA MIAT與miR-203、miR-203與NPAS4之間的靶向關(guān)系。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HGC-27細(xì)胞分組并進(jìn)行轉(zhuǎn)染：對(duì)照組、si-NC組(轉(zhuǎn)染si-NC)、si-MIAT組(轉(zhuǎn)染si-MIAT)、miR-NC組(轉(zhuǎn)染miR-NC)、miR-203組(轉(zhuǎn)染miR-203)、anti-miR-NC組(轉(zhuǎn)染anti-miR-NC)、anti-miR-203組(轉(zhuǎn)染anti-miR-203)、si-MIAT+anti-miR-NC組(轉(zhuǎn)染si-MIAT+anti-miR-NC)、si-MIAT+anti-miR-203組(轉(zhuǎn)染si-MIAT+anti-miR-203)、pc-NC組(轉(zhuǎn)染pc-NC)、pc-NAPS4組(轉(zhuǎn)染pc-NAPS4)、pc-NAPS4+miR-NC組(轉(zhuǎn)染pc-NAPS4+miR-NC)、pc-NAPS4+miR-203組(轉(zhuǎn)染pc-NAPS4+miR-203)，qRT-PCR法檢測(cè)lncRNA MIAT、miR-203、NPAS4 mRNA表達(dá)；MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活力；Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移與侵襲能力；Western blot法檢測(cè)MMP-3、MMP-9、CyclinD1、NPAS4蛋白表達(dá)。結(jié)果 與GES-1細(xì)胞比較，胃癌細(xì)胞HGC-27中l(wèi)ncRNA MIAT、NAPS4 mRNA表達(dá)顯著升高，miR-203表達(dá)顯著降低(P<0.05)。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)，lncRNA MIAT能夠靶向miR-203調(diào)控NAPS4(P<0.05)。沉默lncRNA MIAT可顯著降低細(xì)胞活力以及遷移與侵襲能力，下調(diào)MMP-3、MMP-9、CyclinD1蛋白表達(dá)，降低NAPS4 mRNA和蛋白表達(dá)(P<0.05)；過(guò)表達(dá)miR-203可顯著降低NAPS4 mRNA和蛋白表達(dá)，降低細(xì)胞活力以及遷移與侵襲能力，下調(diào)MMP-3、MMP-9、CyclinD1蛋白表達(dá)(P<0.05)；而抑制miR-203表達(dá)則與miR-203過(guò)表達(dá)作用相反，且抑制miR-203表達(dá)可顯著逆轉(zhuǎn)沉默lncRNA MIAT對(duì)細(xì)胞活力以及遷移與侵襲能力的抑制作用(P<0.05)；過(guò)表達(dá)NAPS4可顯著促進(jìn)HGC-27細(xì)胞增殖、遷移與侵襲，上調(diào)MMP-3、MMP-9、CyclinD1蛋白表達(dá)(P<0.05)，同時(shí)其對(duì)細(xì)胞惡性行為的促進(jìn)作用可被miR-203過(guò)表達(dá)削弱(P<0.05)。結(jié)論 沉默lncRNA MIAT可通過(guò)靶向miR-203調(diào)控NAPS4表達(dá)，減弱胃癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移等細(xì)胞生物學(xué)行為過(guò)程。

胃癌是一種常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，其發(fā)病率與致死率均較高，嚴(yán)重威脅患者生命健康，增加家庭與社會(huì)負(fù)擔(dān)[1]。我國(guó)胃癌的發(fā)病率遠(yuǎn)高于其他國(guó)家，盡管胃癌的治療取得了快速進(jìn)展，但由于放、化療等治療手段的副作用，導(dǎo)致患者預(yù)后極差，生存率仍然很低[2-3]。研究發(fā)現(xiàn)，胃癌細(xì)胞發(fā)生惡性增殖、侵襲與轉(zhuǎn)移是造成治療失敗、患者死亡的主要原因之一[4]，但其潛在機(jī)制尚未發(fā)現(xiàn)。因此，探究胃癌細(xì)胞惡性行為學(xué)的發(fā)生機(jī)制對(duì)于胃癌患者治療與預(yù)后具有非常重要的意義。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, lncRNA)可在多種腫瘤細(xì)胞中表達(dá)異常，并參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲與遷移等惡性生物學(xué)行為，與腫瘤的發(fā)生與發(fā)展存在密切聯(lián)系[5-6]。據(jù)研究報(bào)道，多種lncRNA在胃癌中異常表達(dá)，調(diào)控細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程[7-8]，可能與胃癌的發(fā)生與發(fā)展有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，血清外泌體來(lái)源lncRNA MIAT在胃癌患者體內(nèi)高表達(dá)，可作為胃癌診斷與預(yù)后生物標(biāo)志物[9]。另外，lncRNA MIAT在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中呈高表達(dá)，敲低其表達(dá)能顯著減少細(xì)胞增殖，抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等細(xì)胞過(guò)程[10]。近年來(lái)，微小RNA(microRNA, miRNA)在腫瘤中異常表達(dá)，參與腫瘤進(jìn)展，且多種miRNA參與胃癌的發(fā)生、發(fā)展[11]，其中miR-203在胃癌中低表達(dá)，影響胃癌細(xì)胞分化、轉(zhuǎn)移，是胃癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一[12]。神經(jīng)元PAS結(jié)構(gòu)域蛋白4(neuronal Per-ArntSim domain protein 4，NPAS4)是一種與神經(jīng)元興奮相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，幾乎僅表達(dá)于神經(jīng)系統(tǒng)，參與調(diào)節(jié)學(xué)習(xí)行為與記憶形成[13]。有研究稱(chēng)，NPAS4過(guò)表達(dá)對(duì)LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡與炎癥反應(yīng)具有密切聯(lián)系[14]，但其在胃癌細(xì)胞表達(dá)情況以及對(duì)胃癌細(xì)胞行為學(xué)的影響尚不清楚。本研究通過(guò)體外培養(yǎng)胃癌細(xì)胞HGC-27，探究lncRNA MIAT能否通過(guò)靶向miR-203調(diào)控NPAS4促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移。

1 材料

1.1 細(xì)胞株與主要試劑

胃癌細(xì)胞HGC-27、正常胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)；胎牛血清(abs9*)購(gòu)自愛(ài)必信(上海)生物科技有限公司；青鏈雙抗溶液(03-031-5B)購(gòu)自以色列Bioind公司；RPMI1640培養(yǎng)基(PM150110)購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司；TRIzol試劑(SH-2366)購(gòu)自北京凱詩(shī)源生物科技有限公司；si-MIAT、miR-203模擬物(miR-203)、anti-miR-203、pc-NAPS4及其陰性對(duì)照物均購(gòu)自上海吉瑪制藥有限公司；MTT細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒(M8180-1)購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；Transwell小室(3413)購(gòu)自美國(guó)Corning公司；Matrigel基底膠(SJ-JC15426)購(gòu)自上海機(jī)純實(shí)業(yè)有限公司；MMP-3抗體(ab52915)、MMP-9抗體(ab76003)、CyclinD1抗體(ab16663)、NPAS4抗體(ab242003)、HRP標(biāo)記羊抗兔二抗(ab205718)均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

1.2 主要儀器

正置智能型顯微鏡DM4B購(gòu)自徠卡顯微系統(tǒng)(上海)貿(mào)易有限公司；MyGo Pro二代全光譜便攜式實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)自英國(guó)IT-IS公司；ELx808酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Lonza公司；IX70熒光倒置顯微鏡購(gòu)自日本奧林巴斯公司；Corning?Axygen?凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Corning公司。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將HGC-27細(xì)胞與GES-1細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清、1%青鏈雙抗的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5%CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2天更換一次培養(yǎng)基，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，待細(xì)胞融合至80%以上時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 qRT-PCR法檢測(cè)lncRNA MIAT、miR-203、NPAS4 mRNA的表達(dá)

收集各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HGC-27、GES-1細(xì)胞，采用TRIzol試劑提取總RNA并逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共45個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算lncRNA MIAT、miR-203、NPAS4 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。qRT-PCR反應(yīng)所需引物序列為：lncRNA MIAT上游引物5′-CATCTTACAACAGACCAGAA-3′，下游引物5′-ACAGTCC-ACAGAACATCCAT-3′；miR-203上游引物5′-GCATGCAGT-ATGTCTATCAG-3′，下游引物5′-ACTAGACTAGATAGTCAG-3′；NPAS4上游引物5′-CAGGATGACTCACACTGACAGT-ATTTTTAG-3′，下游引物5′-GTGGGAGAAGAGCTATTTAT-ATCACCAG-3′；GAPDH上游引物5′-AGAAGGCTGGGGC-TATTG-3′；下游引物5′-GCAGGAGGCATTGCTGATGAT-3′。所需引物均購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與實(shí)驗(yàn)分組

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HGC-27細(xì)胞，稀釋細(xì)胞密度為2×105個(gè)/孔，接種于6孔板，待細(xì)胞融合至80%以上時(shí)，將細(xì)胞分組：對(duì)照組、si-NC組、si-MIAT組、miR-NC組、miR-203組、anti-miR-NC組、anti-miR-203組、si-MIAT+anti-miR-NC組、si-MIAT+anti-miR-203組、pc-NC組、pc-NAPS4組、pc-NAPS4+miR-NC組、pc-NAPS4+miR-203組。采用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒將si-NC、si-MIAT、miR-NC、miR-203、anti-miR-NC、anti-miR-203、pc-NC、pc-NAPS4按照分組進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48 h后，先采用qRT-PCR法進(jìn)行轉(zhuǎn)染效果的檢測(cè)，再進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖

收集轉(zhuǎn)染成功的各組HGC-27細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×104個(gè)/mL，按照每孔100 μL細(xì)胞懸液接種于96孔板中，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，置于常規(guī)培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，每孔中加入20 μL的MTT溶液，置于常規(guī)培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h，采用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔490 nm處OD值。重復(fù)測(cè)定三次，計(jì)算平均值作為細(xì)胞活力。

2.5 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移與侵襲

遷移實(shí)驗(yàn)：收集各組HGC-27細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)/mL，取100 μL細(xì)胞懸液加入Transwell小室的上室，下室中加入常規(guī)培養(yǎng)基，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，采用多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色，置于倒置顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)。

侵襲實(shí)驗(yàn)：于Transwell小室的上室鋪上Matrigel基底膠，加入100 μL細(xì)胞懸液，下室加入常規(guī)培養(yǎng)基，其余操作同遷移實(shí)驗(yàn)。

2.6 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)

通過(guò)生物信息學(xué)網(wǎng)站預(yù)測(cè)可知，lncRNA MIAT與miR-203存在靶向關(guān)系，miR-203與NPAS4存在靶向關(guān)系。將lncRNA MIAT野生型報(bào)告基因載體(MIAT-WT)、突變型載體(MIAT-MUT)以及NPAS4野生型載體(NPAS4-WT)、突變型載體(NPAS4-MUT)分別與miR-NC、miR-203共轉(zhuǎn)染至對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的HGC-27細(xì)胞中，6 h后收集細(xì)胞，采用熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)螢火蟲(chóng)熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性，以?xún)烧弑戎底鳛槟康幕驘晒馑孛富钚浴?/p>

2.7 Western blot法檢測(cè)細(xì)胞中MMP-3、MMP-9、CyclinD1、NPAS4蛋白表達(dá)

收集各組HGC-27細(xì)胞提取總蛋白，BCA法定量，取適量蛋白樣品進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜，于5%脫脂奶粉中封閉2 h，加入MMP-3、MMP-9、CyclinD1、NPAS4一抗，4 ℃孵育過(guò)夜，加入二抗，37 ℃孵育2 h，DAB顯色，凝膠成像系統(tǒng)分析條帶灰度值，以GAPDH為內(nèi)參蛋白，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 lncRNA MIAT、miR-203、NAPS4在正常胃黏膜上皮細(xì)胞和胃癌細(xì)胞中的表達(dá)

qRT-PCR結(jié)果顯示，與正常胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1比較，胃癌細(xì)胞HGC-27中l(wèi)ncRNA MIAT表達(dá)顯著升高(P<0.05)，miR-203表達(dá)顯著降低(P<0.05)，NAPS4 mRNA表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05),見(jiàn)表1。

表1 lncRNA MIAT、miR-203、NAPS4在正常胃黏膜上皮細(xì)胞和胃癌細(xì)胞中的表達(dá)

3.2 沉默lncRNA MIAT對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

Western blot法與Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，si-NC組HGC-27細(xì)胞活力與侵襲、遷移能力以及MMP-3、MMP-9、CyclinD1蛋白表達(dá)均無(wú)顯著差異(P>0.05)；與si-NC組比較，si-MIAT組lncRNA MIAT表達(dá)顯著降低(P<0.05)，提示沉默lncRNA MIAT表達(dá)的HGC-27細(xì)胞構(gòu)建成功，HGC-27細(xì)胞活力顯著降低(P<0.05)，細(xì)胞遷移與侵襲能力下降(P<0.05)，MMP-3、MMP-9、CyclinD1蛋白表達(dá)均顯著降低(P<0.05)。結(jié)果見(jiàn)圖1、2和表2、3。

圖1 各組HGC-27細(xì)胞侵襲與遷移情況(×400)

表2 各組HGC-27細(xì)胞lncRNA MIAT表達(dá)以及細(xì)胞活力、侵襲與遷移個(gè)數(shù)的比較

圖2 各組HGC-27細(xì)胞中MMP-3、MMP-9、CyclinD1蛋白表達(dá)

表3 各組HGC-27細(xì)胞中MMP-3、MMP-9、CyclinD1蛋白表達(dá)的比較

3.3 lncRNA MIAT靶向調(diào)控miR-203的表達(dá)

生物信息學(xué)網(wǎng)站StarBase(https://starbase.sysu.edu.cn/)預(yù)測(cè)可知，lncRNA MIAT與miR-203之間均存在連續(xù)的互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，見(jiàn)圖3。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，MIAT-WT和miR-203共轉(zhuǎn)染與MIAT-WT和miR-NC共轉(zhuǎn)染比較，熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)；MIAT-MUT和miR-203共轉(zhuǎn)染與MIAT-MUT和miR-NC共轉(zhuǎn)染比較，熒光素酶活性無(wú)顯著差異(P>0.05)，結(jié)果見(jiàn)表4。qRT-PCR結(jié)果顯示，si-MIAT組(1.75±0.17)HGC-27細(xì)胞中miR-203表達(dá)顯著高于si-NC組(0.95±0.07)(P<0.05)。

圖3 lncRNA MIAT與miR-203的靶向結(jié)合位點(diǎn)

表4 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果

3.4 lncRNA MIAT靶向miR-203調(diào)控NPAS4的表達(dá)

生物信息學(xué)網(wǎng)站TargetScan(https://www.targetscan.org/vert_71/)預(yù)測(cè)可知，NPAS4與miR-203之間存在連續(xù)的互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，見(jiàn)圖4。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，NPAS4-WT和miR-203共轉(zhuǎn)染與NPAS4-WT和miR-NC共轉(zhuǎn)染比較，熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)，NPAS4-MUT和miR-203共轉(zhuǎn)染與NPAS4-MUT和miR-NC共轉(zhuǎn)染比較，熒光素酶活性無(wú)顯著差異(P>0.05)，結(jié)果見(jiàn)表5。qRT-PCR與Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，miR-203組HGC-27細(xì)胞中NPAS4 mRNA及蛋白表達(dá)顯著低于miR-NC組(P<0.05)，anti-miR-203組HGC-27細(xì)胞中NPAS4 mRNA及蛋白表達(dá)顯著高于anti-miR-NC組(P<0.05)，另外si-MIAT組HGC-27細(xì)胞中NPAS4 mRNA及蛋白表達(dá)顯著低于si-NC組(P<0.05)，si-MIAT+anti-miR-203組HGC-27細(xì)胞中NPAS4 mRNA及蛋白表達(dá)顯著高于si-MIAT+anti-miR-NC組(P<0.05)，結(jié)果見(jiàn)圖5、表6。

圖4 NPAS4與miR-203的靶向結(jié)合位點(diǎn)

表5 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果

圖5 各組HGC-27細(xì)胞中NAPS4蛋白表達(dá)

3.5 過(guò)表達(dá)miR-203或抑制miR-203表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、遷移與侵襲的影響

Western blot法與Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與miR-NC組比較，miR-203組miR-203表達(dá)顯著升高(P<0.05)，細(xì)胞活力以及遷移與侵襲能力下降(P<0.05)，MMP-3、MMP-9、CyclinD1蛋白表達(dá)均顯著降低(P<0.05)；與anti-miR-NC組比較，anti-miR-NC組miR-203表達(dá)顯著降低(P<0.05)，細(xì)胞活力以及細(xì)胞遷移與侵襲能力顯著升高(P<0.05)，MMP-3、MMP-9、CyclinD1蛋白表達(dá)均顯著上調(diào)(P<0.05)；此外，與si-MIAT+anti-miR-NC組比較，si-MIAT+anti-miR-203組miR-203表達(dá)顯著降低(P<0.05)，細(xì)胞活力以及細(xì)胞遷移與侵襲能力顯著升高(P<0.05)，MMP-3、MMP-9、CyclinD1蛋白表達(dá)均顯著上調(diào)(P<0.05)。結(jié)果見(jiàn)圖6、7和表7、8。

表6 各組HGC-27細(xì)胞中NAPS4 mRNA、蛋白表達(dá)的比較

圖6 各組HGC-27細(xì)胞侵襲與遷移情況(×400)

表7 各組HGC-27細(xì)胞中miR-203表達(dá)與細(xì)胞活力、侵襲與遷移個(gè)數(shù)的比較

圖7 各組HGC-27細(xì)胞中MMP-3、MMP-9、CyclinD1蛋白表達(dá)

3.6 過(guò)表達(dá)NAPS4對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、遷移與侵襲的影響

Western blot法與Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與pc-NC組比較，pc-NAPS4組NAPS4 mRNA和蛋白表達(dá)均顯著上調(diào)(P<0.05)，與細(xì)胞活力以及細(xì)胞遷移與侵襲能力顯著升高(P<0.05)，MMP-3、MMP-9、CyclinD1蛋白表達(dá)均顯著上調(diào)(P<0.05)；此外，與pc-NAPS4+miR-NC組比較pc-NAPS4+miR-203組NAPS4 mRNA和蛋白表達(dá)均顯著降低(P<0.05)，細(xì)胞活力以及細(xì)胞遷移與侵襲能力顯著降低(P<0.05)，MMP-3、MMP-9、CyclinD1蛋白表達(dá)均顯著下調(diào)(P<0.05)。結(jié)果見(jiàn)圖8、9和表9、10。

表8 各組HGC-27細(xì)胞中MMP-3、MMP-9、CyclinD1蛋白表達(dá)的比較

圖8 各組HGC-27細(xì)胞侵襲與遷移情況(×400)

表9 各組HGC-27細(xì)胞中NAPS4 mRNA表達(dá)與細(xì)胞活力、侵襲與遷移個(gè)數(shù)的比較

圖9 各組HGC-27細(xì)胞中MMP-3、MMP-9、CyclinD1蛋白表達(dá)

表10 各組HGC-27細(xì)胞中MMP-3、MMP-9、CyclinD1蛋白表達(dá)的比較

4 討論

胃癌是我國(guó)多發(fā)的一種常見(jiàn)消化系統(tǒng)惡性腫瘤，死亡率占全國(guó)癌癥相關(guān)死亡第二名[15]。目前胃癌的根治方法主要是徹底清除原發(fā)腫瘤以及轉(zhuǎn)移浸潤(rùn)的癌旁組織，并減少?gòu)?fù)發(fā)，提高預(yù)后生存率，但由于胃癌發(fā)展過(guò)程涉及多種因素和機(jī)制，對(duì)于其診斷、治療、預(yù)后都帶來(lái)了極大的挑戰(zhàn)[16]。lncRNAs在腫瘤中異常表達(dá)，參與腫瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲與凋亡等惡性行為過(guò)程，可用作腫瘤治療的新型靶點(diǎn)[17-18]。對(duì)于lncRNA MIAT在胃癌中的表達(dá)與作用，已有學(xué)者研究報(bào)道[19-20]。本研究結(jié)果顯示，lncRNA MIAT在胃癌細(xì)胞中高表達(dá)，沉默lncRNA MIAT可顯著降低HGC-27細(xì)胞活力與侵襲、遷移能力，下調(diào)MMP-3、MMP-9、CyclinD1蛋白表達(dá)。

前期我們采用miRNA芯片技術(shù)(Exipon mercury LNA microRNA 16.0)篩選胃癌組織中表達(dá)異常的miRNA，本研究結(jié)果顯示，miR-203在胃癌細(xì)胞中表達(dá)顯著下調(diào)，抑制miR-203的表達(dá)可促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲等過(guò)程，而過(guò)表達(dá)miR-203可顯著抑制以上細(xì)胞行為，此結(jié)果與前人研究結(jié)果一致[21]。但miR-203在胃癌中的調(diào)控機(jī)制尚未闡明，我們采用TargetScan等生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)其靶基因，并通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，miR-203與lncRNA MIAT和NAPS4均具有靶向關(guān)系，且抑制miR-203表達(dá)可顯著逆轉(zhuǎn)沉默lncRNA MIAT對(duì)NAPS4表達(dá)、細(xì)胞活力以及遷移與侵襲能力的抑制作用，表明lncRNA MIAT可通過(guò)靶向miR-203調(diào)控NAPS4表達(dá)，在胃癌中發(fā)揮促癌作用。

NAPS4是存在于神經(jīng)系統(tǒng)中的一種轉(zhuǎn)錄因子，與學(xué)習(xí)行為建立和記憶形成存在密切聯(lián)系，但也有研究證明，其作用并未局限于神經(jīng)系統(tǒng)，在胰島β細(xì)胞毒性中也可發(fā)揮作用[22]。本研究結(jié)果顯示，胃癌細(xì)胞中NAPS4呈高表達(dá)，與lncRNA MIAT表達(dá)趨勢(shì)一致；過(guò)表達(dá)NAPS4可促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖、遷移與侵襲，同時(shí)上調(diào)MMP-3、MMP-9、CyclinD1蛋白表達(dá)；且miR-203過(guò)表達(dá)可顯著削弱NAPS4過(guò)表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞惡性行為學(xué)的促進(jìn)作用?；谝陨涎芯拷Y(jié)果，表明lncRNA MIAT可通過(guò)miR-203調(diào)控NAPS4促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移。

綜上所述，lncRNA MIAT可通過(guò)靶向miR-203調(diào)控NAPS4，促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖、遷移與侵襲，這為胃癌診斷提供了新靶點(diǎn)，為胃癌治療與預(yù)后提供了新的思路。但由于胃癌發(fā)生涉及基因表達(dá)多樣，lncRNA MIAT作用機(jī)制復(fù)雜，關(guān)于lncRNA MIAT參與胃癌發(fā)生的機(jī)制還需深入探索。