卵巢癌在代謝組學(xué)中的研究進(jìn)展

楊 帆，謝樹紅綜述，黃惠娟審校

0 引 言

眾所周知，基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)分別從基因和蛋白質(zhì)層面探尋生命活動，但實際上細(xì)胞內(nèi)許多生命活動是發(fā)生在代謝物層面的，因此代謝組學(xué)成為目前組學(xué)領(lǐng)域研究的熱點之一。代謝組學(xué)作為腫瘤學(xué)的研究方法之一，能從代謝的角度整體分析疾病，在惡性腫瘤早期診斷方面的研究已初顯優(yōu)勢，卵巢癌作為婦科惡性腫瘤致死率極高的疾病,一經(jīng)發(fā)現(xiàn)即晚期，急需一種可早期診斷該疾病的方法，代謝組學(xué)在卵巢癌中的應(yīng)用可為卵巢癌的診斷、鑒別診斷及預(yù)防提供思路 。

1 代謝組學(xué)的概念及發(fā)展進(jìn)展

代謝組學(xué)作為繼基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)之后的又一新興學(xué)科，近年來開始被發(fā)展并應(yīng)用。其概念于1999年由Nicholson等[1]首次提出，定義為研究生命體對病理生理刺激或基因遺傳修飾所產(chǎn)生的代謝物質(zhì)的定量測量。代謝組學(xué)是通過模式識別方法和生物信息學(xué)方法來檢測并追蹤代謝物質(zhì)在生物組織和體液中變化的分析工具[2]。

2 代謝組學(xué)研究方法

2.1樣品采集與制備代謝組學(xué)的研究可采用細(xì)胞、液體或組織進(jìn)行離體或在體的分析，血漿、血清、尿液、腹水、唾液、支氣管洗滌物、前列腺分泌物或糞便等便于獲取和保存，尤其是尿液和血液制品更是產(chǎn)量高且易于制備，因此研究中經(jīng)常應(yīng)用尿液和血液制品來進(jìn)行代謝組學(xué)分析。雖然從組織中提取代謝物更加直接，但是因組織標(biāo)本存在異質(zhì)性，導(dǎo)致取材需要更加仔細(xì)且也更加困難，另外組織周圍的上皮細(xì)胞也易被污染，因此可能導(dǎo)致研究結(jié)果有誤差[3]。

2.2代謝產(chǎn)物檢測、分析與鑒定代謝組學(xué)分析有著多種分析方法，每個分析方法均具有特定的優(yōu)勢和局限性，最顯著的是靈敏度，重復(fù)性和設(shè)備成本差異[4]。因此，分析方法的選擇將取決于分析的目的，樣品的性質(zhì)，被研究的化合物的性質(zhì)以及實驗室的資源[5-6]，其中最廣泛使用的方法是核磁共振技術(shù)(nuclear magnetic resonanc，NMR)、色譜和質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，最常用的是氣相色譜/質(zhì)譜(gas chromatography/mass spectrometry,GC/MS)和液相色譜/質(zhì)譜(liquid chromatography/mass spectrometry,LC/MS)聯(lián)用技術(shù)。隨著代謝組學(xué)技術(shù)中靈敏度和質(zhì)譜分辨率的改進(jìn)，極大程度上促進(jìn)了代謝組學(xué)相關(guān)技術(shù)的發(fā)展[3,7]。

2.2.1NMRSpectroscopyNMR光譜是一種非破壞性、非侵入性技術(shù)，能提供分子結(jié)構(gòu)的詳細(xì)信息，通過自旋松弛和分子擴散的性質(zhì)，NMR光譜也可探測代謝物的分子動力學(xué)和遷移率(如配體-蛋白結(jié)合)[8]。這項技術(shù)是根據(jù)原子核，主要是氫核(1H-NMR)的磁性以及在分子中的不同位置，通過共振頻率不同來識別不同的原子核[3,9]。NMR光譜法的主要優(yōu)點是高再生性(通常>98%)[9]，并且對于樣品制備無或僅有最低要求(樣品被保留在未被破壞的天然形式中)[9]。此外，NMR光譜具有分析液體(甚至復(fù)雜的混合物)或固體樣品的能力，能夠使用高分辨率魔角旋轉(zhuǎn)(HRMAS)技術(shù)分析完整的組織、細(xì)胞提取物和活生物體，并且在活體內(nèi)可使用局部磁共振波譜成像(MRSI)來分析[3,9]。然而，與MS技術(shù)相比，NMR敏感性稍弱，對于低豐度代謝物的檢測能力較差，因此需要大量樣品量或大量細(xì)胞來檢測，對于儀器方面要求也更加嚴(yán)格，更加昂貴[3]?；蛟S正因NMR光譜的低靈敏度促進(jìn)了代謝組學(xué)向MS技術(shù)的轉(zhuǎn)變[7,10]。

2.2.2質(zhì)譜MS是通過其離子化和碎片化對代謝物進(jìn)行識別。每個代謝產(chǎn)物均有其特定的碎裂模式，這意味著不同的和特征性的片段將相應(yīng)地形成和分離成其質(zhì)荷比(m/z)，為提高M(jìn)S儀器的分辨率、靈敏度、選擇性，并允許同位素代謝物的分化，MS通常與液相色譜(LC)和氣相色譜(GC)聯(lián)用，有助于減少質(zhì)譜代謝物分離的復(fù)雜性[3,9]。

2.3數(shù)據(jù)信息處理代謝組學(xué)的數(shù)據(jù)分析包括預(yù)處理和統(tǒng)計分析方法，多元統(tǒng)計分析方法主要分為兩大類: 非監(jiān)督和監(jiān)督方法，非監(jiān)督方法包括主成分分析、自組織投影和聚類分析等;監(jiān)督方法包括顯著性分析、偏最小二乘法(PLS)、偏最小二乘法-判別分析(PLS-DA)、人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)等， 其中應(yīng)用最廣泛的兩種技術(shù)分別是主成分分析和PLS-DA[11-12]。PCA和PLS回歸已經(jīng)成為用于探索分類差異和突出解釋代謝物的代謝分析中最流行的技術(shù)之一。

3 代謝組學(xué)在卵巢癌中的應(yīng)用

眾所周知，卵巢癌是致死性很高的一種癌癥，根據(jù)最新國際癌癥研究中心(IARC)公布的2016年全球癌癥數(shù)據(jù)庫資料顯示，卵巢癌占女性腫瘤5%，死亡率居婦科惡性腫瘤首位[13-14]。盡管該疾病早期的五年生存率>90%，但是晚期的五年生存率≤20%[15]。而早期卵巢癌通常無明顯癥狀，>50%的女性在初次確診時已經(jīng)是卵巢癌晚期(III或 IV期)甚至是轉(zhuǎn)移期[16]。目前為止，還無足夠精確的實驗來證明卵巢癌的早期診斷，正因為無系統(tǒng)、全面、準(zhǔn)確的臨床診斷，才導(dǎo)致了許多卵巢癌患者不能早期診斷，不能早期治療，由此可見，一個精準(zhǔn)的診斷是非常必要的，不僅可更好的治療疾病，且可提高患者預(yù)后。

目前，臨床中檢測卵巢癌的方法包括經(jīng)陰道超聲和鑒定血液中癌癥的特異性生物標(biāo)志物，如癌癥抗原125(CA-125)，癌胚抗原(CEA)和人附睪蛋白4(HE4)[17]，其中，CA-125是卵巢癌研究最廣泛的血清生物標(biāo)志物。然而，兩種類型的檢測方法均有各自的缺點。就經(jīng)陰道超聲來說，由于卵巢表面的動態(tài)性質(zhì)，可能會將絕經(jīng)前婦女的功能性囊腫誤認(rèn)為癌癥，這就造成了錯誤診斷。而對于CA-125來說，具有很高的假陽性率，可從很多種病癥中產(chǎn)生，包括子宮內(nèi)膜異位癥，子宮肌瘤，出血性卵巢囊腫，急性盆腔炎，月經(jīng)，妊娠早期和其他幾種類型的癌癥(胰腺，乳腺，膀胱，肝，肺)等[18]。此外，CA-125通常在早期卵巢癌中無法檢出[19]。因此，尋找一個能早期診斷卵巢癌的方法迫在眉睫。

近年來，代謝組學(xué)已成為許多領(lǐng)域的有力工具[20-22]。在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域也逐漸進(jìn)步，代謝組學(xué)的發(fā)展使得可鑒定出越來越多的代謝腫瘤標(biāo)志物，也在某些疾病的診斷、治療和預(yù)后等方面逐漸顯露出其獨有的臨床價值。

3.1卵巢癌潛在腫瘤標(biāo)志物篩選代謝產(chǎn)物可由于機體的病理生理變化而變化，因此對由疾病導(dǎo)致的代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析，有助于我們更全面的掌握機體病情變化過程以及體內(nèi)物質(zhì)的代謝途徑，從而使臨床診斷更準(zhǔn)確。Zhou等[23]從44個漿液乳頭狀卵巢癌(I-IV期)和50個健康女性或有良性疾病的女性中，用質(zhì)譜分析法從血清中發(fā)現(xiàn)組胺、嘌呤核苷酸、甘氨酸、絲氨酸、肌氨酸為差異代謝物，丙氨酸、絲氨酸，半胱氨酸、蘇氨酸、甘氨酸過度表達(dá)。Fong等[24]用氣相色譜質(zhì)譜和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法發(fā)現(xiàn)人卵巢代謝組織含有364種生物化學(xué)物質(zhì)，卵巢轉(zhuǎn)化能引起能量利用變化，從而引起糖酵解和脂肪酸(如肉堿，乙酰肉堿和丁酰肉堿)的β-氧化發(fā)生改變。Chen等[25]基于LC/MS聯(lián)用分析的非靶向代謝組學(xué)方法，分析了27名健康女性，28例良性卵巢腫瘤和29例上皮性卵巢癌的血清樣本，得出27-非-5β-膽甾烷-3,7,12,24,25戊糖葡糖苷酸，苯丙氨酸，甘氨膽酸，丙酰基肉堿等是上皮性卵巢癌潛在的生物標(biāo)志物候選物。

3.2卵巢癌的早期診斷Garcia等[26]用1H NMR法，從170個健康適齡的女性和182個卵巢癌I/II期患者的血清當(dāng)中，分析出丙氨酸，纈氨酸，磷脂膽堿等濃度降低，而β-羥基丁酸酯，丙酮和乙酰乙酸的濃度較高，這些可初步與其他基于NMR的代謝組學(xué)所研究的癌癥患者的血清標(biāo)本的濃度分布變化進(jìn)行定性比較。從而證明卵巢癌的早期診斷可顯著影響卵巢癌患者的臨床結(jié)局。 Chen等[25]運用LC/MS聯(lián)用分析、液相色譜選擇性離子監(jiān)測質(zhì)譜技術(shù)結(jié)合PCR等模式識別技術(shù)分析了27名健康女性，28例良性卵巢腫瘤和29例上皮性卵巢癌的血清樣本，研究發(fā)現(xiàn)27-非-5β-膽甾烷-3,7,12,24,25戊醇葡糖苷酸可用于上皮性卵巢癌的早期診斷之中。其在早期卵巢上皮性癌(I期)的血清中有升高。Gaul等[27]從46個早期(I/II)漿液性上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer,EOC)患者和49個年齡匹配的正常健康女性對照，運用超高效液相色譜，高分辨質(zhì)譜(UPLC-MS)和串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)方法發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)和脂肪酸中的16種代謝物對于早期卵巢癌患者診斷有 100%準(zhǔn)確性。

3.3卵巢癌的鑒別診斷及預(yù)后Cheng等[28]應(yīng)用親水作用液相色譜與串聯(lián)質(zhì)譜法對包括卵巢癌患者，卵巢良性腫瘤患者和健康對照者共58名婦女的血清進(jìn)行定量分析，其中8種內(nèi)源性碳水化合物在卵巢癌與健康對照組之間差異顯著，其中阿糖胞苷是區(qū)分卵巢癌的最具潛力的特異性生物標(biāo)志物，麥芽糖，麥芽三糖，棉子糖和甘露醇能夠區(qū)分卵巢癌與良性卵巢腫瘤對照組。FAN等[29]為了研究代謝組學(xué)在選擇EOC相關(guān)生物標(biāo)志物中的應(yīng)用，采用超高效液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜(UPLC/QTOF/MS)分析了173例血漿標(biāo)本(80例新診斷的EOC患者和93例正常人)，發(fā)現(xiàn)了8種差異代謝物，其中去甲基苯醌在卵巢癌患者中降低，神經(jīng)節(jié)苷脂，溶血磷脂，神經(jīng)酰胺，植物鞘氨醇，N-甲?；B嘌呤含量上升；實驗表明，單個生物標(biāo)志物在區(qū)分EOC和對照組方面具有良好的診斷準(zhǔn)確性。Chen等[30]應(yīng)用LC/MS聯(lián)用分析、液相色譜選擇性離子監(jiān)測質(zhì)譜技術(shù)結(jié)合PCR等模式識別技術(shù)分析卵巢上皮性癌、 卵巢良性腫物、 健康女性的血清代謝物，發(fā)現(xiàn)27-非-5β-膽甾烷-3,7,12,24,25戊糖葡糖苷酸在卵巢上皮性癌組織中的含量高于良性卵巢腫瘤組織；Chen等[31]用親水作用色譜法(HILIC) 和反相液相色譜法(RPLC)，對25名健康女性，29例良性卵巢腫瘤和22例卵巢癌患者的尿液以ESI +和ESI-檢測模式進(jìn)行親和和疏水性尿代謝分析，發(fā)現(xiàn)假尿嘧啶和馬尿酸等五種代謝物與卵巢癌有關(guān)，包括肌酸酐等10種代謝物與良性卵巢腫瘤和卵巢癌有關(guān)。Ke等[32]運用超高效液相色譜質(zhì)譜法進(jìn)行了與EOC相關(guān)的448例血漿樣本的代謝分析，發(fā)現(xiàn)53種代謝物被鑒定為EOC的特異性生物標(biāo)志物，其中胡椒堿，3-吲哚丙酸，5-羥基吲哚乙醛和羥基苯基乳酸酯第一次被發(fā)現(xiàn)作為EOC的代謝生物標(biāo)志物，研究表明可很好的區(qū)分EOC與卵巢交界性腫瘤(borderline ovarian tumors，BOT)和子宮肌瘤(uterine fibroid，UF)。Zhang等[33]從80例EOC患者和90例BOT患者的血漿樣品中使用超高效液相色譜質(zhì)譜(UPLC/MS)進(jìn)行血漿代謝組學(xué)分析。采用部分最小二乘法判別分析法對EOC和BOT進(jìn)行分類，鑒定出6種代謝生物標(biāo)志物，EOC患者中4種確定的生物標(biāo)志物[L-色氨酸，溶血卵磷脂(18∶3)，溶血卵磷脂(14∶0)和2-哌啶酮]的血漿濃度均低于BOT患者。其中，研究者發(fā)現(xiàn)色氨酸和溶血卵磷脂可能參與癌癥進(jìn)展，2-哌啶酮可能是EOC的新型生物標(biāo)志物。該研究證實，6種代謝物生物標(biāo)志物可能是提供調(diào)查EOC生物學(xué)機制的重要信息，在鑒別惡性與良性卵巢腫瘤方面具有有利的價值。Zhang等[34]用超高效液相色譜質(zhì)譜法從易復(fù)發(fā)的卵巢癌患者和不易復(fù)發(fā)的卵巢癌患者的等離子代謝物中比較發(fā)現(xiàn)，易復(fù)發(fā)的卵巢癌患者的左旋色氨酸水平較低，而犬尿素水平則較高，從而分析判斷卵巢癌患者的預(yù)后。

4 結(jié) 語

代謝組學(xué)是一個包含綜合代謝物評估，模式識別和統(tǒng)計分析的新紀(jì)元，在檢測方法和應(yīng)用等方面還需要完善。隨著代謝組學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，盡管卵巢癌仍然是所有婦科惡性腫瘤中死亡率最高的，但是其診斷、臨床分期、鑒別及預(yù)后等方面的發(fā)展前景和利用價值相信經(jīng)過進(jìn)一步探討和研究定會有廣闊的發(fā)展前景。

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