嗜熱脂肪芽孢桿菌木聚糖酶A的H297F定點(diǎn)突變、表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)變化

李嬋娟，石慧，王曼玥，王婧

1(武漢設(shè)計(jì)工程學(xué)院 食品與生物科技學(xué)院，湖北 武漢，430205)2(湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，湖北 武漢，430064)

來源于Geobacillusstearothermophilus木聚糖酶最適反應(yīng)溫度在65～80 ℃之間，為高溫木聚糖酶，在烘焙、造紙等工業(yè)領(lǐng)域具有應(yīng)用潛力，成為熱門研究對(duì)象[7]。ZHANG等人應(yīng)用易錯(cuò)PCR結(jié)合family shuffling技術(shù)將Geobacillusstearothermophilus木聚糖酶XT6的最適反應(yīng)溫度從77 ℃提高到87 ℃；催化效率也提高了90%[11]。WANG等人對(duì)Geobacillusstearothermophilus木聚糖酶XynA的179位H進(jìn)行飽和突變，當(dāng)其突變?yōu)?79F時(shí)，催化活性和熱穩(wěn)定性均有提高[12]。本研究采用重疊延伸PCR技術(shù)對(duì)XynA保守區(qū)內(nèi)可能影響活性的位點(diǎn)H297定點(diǎn)突變?yōu)镕，以期提高XynA的熱穩(wěn)定性和催化活性。

1　材料與方法

1.1　材料與試劑

菌種和質(zhì)粒：木聚糖酶基因由本實(shí)驗(yàn)室從Geobacillusstearothermophilus菌株中獲得并構(gòu)建成重組質(zhì)粒pGEX-6p-xynA，可在大腸桿菌中異源表達(dá)；大腸桿菌EscherichiacoliDH5α、BL21(DE3)均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

培養(yǎng)基：酵母粉5 g，胰蛋白胨10 g，NaCl 10 g，溶于1 000 mL蒸餾水；液體培養(yǎng)基中加入1.5%瓊脂粉即為固體培養(yǎng)基。

工具酶和生化試劑：TransStartFastPfuDNA聚合酶為北京全式金生物技術(shù)有限公司提供；限制性內(nèi)切酶BamHI和XhoI、T4 DNA連接酶、DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)和蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自TaKaRa 寶生物工程(大連)有限公司，AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒和AxyPrep Plasmid Miniprep Kit購(gòu)自愛思進(jìn)(杭州)技術(shù)有限公司，GST-蛋白純化試劑盒購(gòu)自GE Healthcare公司(美國(guó))，蛋白質(zhì)定量檢測(cè)試劑盒為Beyotime公司產(chǎn)品；樺木木聚糖(birchwood xylan) 、氨芐青霉素、異丙基-β-d-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-d-thiogalactoside, IPTG)購(gòu)自Sigma 公司(美國(guó))，其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2　儀器與設(shè)備

PCR儀，美國(guó)Biorad T100 Thermal Cycler；微量離心機(jī)，美國(guó)Thermo Heraeus Pico 17；超速冷凍離心機(jī)，美國(guó)Backman OptimeTM LE-80K；凝膠成像系統(tǒng)，中國(guó)CLiXN GenoSens1580；細(xì)胞破碎儀器，美國(guó)Thermo French Cell Press；酶標(biāo)儀，美國(guó)Thermo Multiskan Spectrum。

1.3　方法

1.3.1XynAH297F定點(diǎn)突變

根據(jù)嗜熱脂肪芽孢桿菌木聚糖酶XynA的核苷酸序列設(shè)計(jì)引物如下：

TC(下劃線為BamHI酶切位點(diǎn))；

CCAA(下劃線為XhoI酶切位點(diǎn))；

CTTGACCAT(下劃線為Phe 297位點(diǎn))；

GGCAATTCC(下劃線為Phe 297位點(diǎn))；

利用重疊延伸PCR法對(duì)xynA的H297位點(diǎn)突變?yōu)镕。第一步：以構(gòu)建好的pGEX-6p-xynA質(zhì)粒為模板，以xynA-F/xynAH297F-R 和xynAH297F-F/xynA-R為引物分別擴(kuò)增上游片段和下游片段。反應(yīng)體系為50 μL：5×FastPfubuffer 10 μL，正向引物、反向引物(10 mmol/L)各1 μL，模板DNA 1 μL，F(xiàn)astPfuDNA聚合酶(2.5 U/μL)1 μL，dNTP(2.5 mmol/L)2 μL，補(bǔ)充ddH2O至50 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸25 s，30個(gè)循環(huán)。第二步：取上游片段和下游片段混合為模板，以xynA-F/xynA-R為引物進(jìn)行全長(zhǎng)擴(kuò)增，獲得含有酶切位點(diǎn)和突變位點(diǎn)的xynAH297F基因，反應(yīng)體系同第一步。反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)。以1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增結(jié)果，凝膠回收試劑盒回收DNA片段。

1.3.2重組質(zhì)粒pGEX-6p-xynAH297F的構(gòu)建

用BamH I和XhoI對(duì)回收后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切，再回收木聚糖酶基因酶切片段，將其與相應(yīng)雙酶切的pGEX-6p-1質(zhì)粒載體在4 ℃下酶連過夜，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，構(gòu)建pGEX-6p-xynAH297F重組質(zhì)粒，挑選陽性克隆進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

1.3.3XynA及XynAH297F在E.coliBL21(DE3)中的表達(dá)與純化

將構(gòu)建正確的重組質(zhì)粒pGEX-6p-xynA、pGEX-6p-xynAH297F分別轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中。挑選含有重組質(zhì)粒的E.coliBL21(DE3)分別液體培養(yǎng)過夜，以1%的接種量分別轉(zhuǎn)接至含100 μg/mL氨芐青霉素2 L的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃搖床培養(yǎng)A600達(dá)到0.6～0.7后，加入IPTG至終濃度為0.1 mmol/L，18 ℃，200 r/min誘導(dǎo)培養(yǎng)12 h。離心收集菌體，PBS懸浮后高壓破碎儀破細(xì)胞，12 000 r/min，4 ℃離心30 min，收集細(xì)胞破碎液上清，按照谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase，GST)融合蛋白純化試劑盒說明書純化重組木聚糖酶XynA及突變體XynAH297F。根據(jù)采用5%的濃縮膠和12%的分離膠進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳 (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)檢測(cè)分析，并根據(jù)蛋白定量檢測(cè)試劑盒說明書測(cè)定蛋白濃度。

1.3.4XynA及XynAH297F酶學(xué)性質(zhì)研究

采用Somogyi-Nelson 法測(cè)定木聚糖酶活性。取10 μL適量的木聚糖酶加入90 μL緩沖液配制的1%樺木木聚糖底物，一定溫度下反應(yīng)10 min，再加入100 μL 3,5-二硝基水楊酸(DNS)沸水浴10 min，冷卻后加ddH2O定容至1 mL，再取200 μL反應(yīng)液至96孔板中，酶標(biāo)儀測(cè)定A540讀數(shù)。

酶活單位定義(Unit)： 在上述條件下，每分鐘產(chǎn)生1 μmol木糖所需要的酶量為一個(gè)酶活力單位。

1.3.4.1XynA及XynAH297F最適pH及pH穩(wěn)定性研究

最適pH：配制不同pH值的濃度為1%底物溶液(pH 4～8緩沖液為0.2 mol/LNa2HPO4/0.1 mol/L檸檬酸緩沖液；pH 8.5～10緩沖液為50 mmol/L Gly-NaOH緩沖液)，按照上述酶活測(cè)定方法，以最高酶活為100%，計(jì)算不同pH條件下的相對(duì)酶活。

pH穩(wěn)定性：將木聚糖酶分別置于不同pH緩沖液中，室溫放置20 h后，以最適pH緩沖液配制底物測(cè)定活性，以未處理的木聚糖酶酶活為100%，計(jì)算相對(duì)酶活。

1.3.4.2XynA及XynAH297FP的最適反應(yīng)溫度和熱穩(wěn)定性研究

最適反應(yīng)溫度：以最適pH緩沖液配制底物，按照標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定不同溫度下的酶活，以最高酶活為100%，計(jì)算相對(duì)酶活。

熱穩(wěn)定性：將木聚糖酶分別置于60～80 ℃處理20 min，然后在最適條件下測(cè)定酶活，以未處理的木聚糖酶酶活為100%，計(jì)算相對(duì)酶活。

1.3.5XynA及XynAH297F動(dòng)力學(xué)研究

以最適pH緩沖液配制一系列不同濃度梯度的木聚糖底物，酶促反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)Lineweaver-Burk 法，通過雙倒數(shù)作圖，求出米氏常數(shù)Km和最大速率Vmax，而催化常數(shù)Kcat=Vmax/[E]，[E]為酶濃度。

2　結(jié)果與分析

2.1　XynAH297F的定點(diǎn)突變

本實(shí)驗(yàn)采用重疊延伸PCR進(jìn)行xynA的定點(diǎn)突變H297F。如圖1所示，以xynA-F/xynAH297F-R和xynAH297F-F/xynA-R為引物分別擴(kuò)增上游片段891 bp

M-DNA marker；1-引物xynAH297F-F/ xynA-R擴(kuò)增產(chǎn)物；2-xynAH297F-F/xynA-R擴(kuò)增產(chǎn)物；3-xynA-F/xynA-R擴(kuò)增產(chǎn)物圖1　重疊延伸PCR擴(kuò)增xynAH297F基因Fig.1　XynAH297F gene amplified by overlapping extension PCR

和下游片段105 bp，第二輪PCR以xynA-F/xynA-R為引物進(jìn)行全長(zhǎng)擴(kuò)增所得片段大小為996 bp，與預(yù)期一致。構(gòu)建重組質(zhì)粒并測(cè)序驗(yàn)證，將成功的突變的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coliBL21(DE3)中進(jìn)行表達(dá)與純化。

2.2　XynA及XynAH297F的誘導(dǎo)表達(dá)和純化

將帶有重組質(zhì)粒pGEX-6p-xynA、 pGEX-6p-xynAH297F的E.coliBL21(DE3)分別誘導(dǎo)表達(dá)，破細(xì)胞后利用SDS-PAGE檢測(cè)蛋白表達(dá)情況。如圖2-A所示，帶有空載質(zhì)粒菌株誘導(dǎo)后只表達(dá)了26 ku的GST標(biāo)簽，且主要存在上清中；含有重組的pGEX-6p-xynA和pGEX-6p-xynAH297F菌株均表達(dá)了64 ku的融合蛋白，雖然主要存在沉淀中，但是上清中也存在可溶的融合蛋白。經(jīng)過親和層析、3C蛋白酶切除GST標(biāo)簽后，最終獲得高純度的木聚糖酶。經(jīng)SDS-PAGE分析，純化后的蛋白條帶單一，且大小約為38 ku，與預(yù)期一致，說明所得蛋白即為目標(biāo)蛋白。

A-XynA和XynAH297P在BL21(DE3)中的表達(dá)分析。M-蛋白質(zhì)marker；1-IPTG誘導(dǎo)的含pGEX-6p-1的E. coliBL21(DE3)表達(dá)上清；2-IPTG誘導(dǎo)的含pGEX-6p-1的E. coli BL21(DE3)表達(dá)沉淀；3-IPTG誘導(dǎo)的含pGEX-6p-xynA的E. coliBL21(DE3)表達(dá)上清；4-IPTG誘導(dǎo)的含pGEX-6p-xynA的E. coliBL21(DE3)表達(dá)沉淀；5-IPTG誘導(dǎo)的含pGEX-6p-xynAH297F的E. coli BL21(DE3)表達(dá)上清H297P上清；6-IPTG誘導(dǎo)的含pGEX-6p-xynAH297F的E. coli BL21(DE3)表達(dá)上清H297P沉淀。B-M-蛋白質(zhì)marker；1-純化后的XynA；2-純化后的XynAH297P圖2　XynA和XynAH297P的表達(dá)與純化SDS-PAGE分析Fig.2　SDS-PAGE analysis of XynA and XynAH297P

2.3　XynA和XynAH297F酶學(xué)性質(zhì)

2.3.1最適反應(yīng)pH和pH的穩(wěn)定性研究

如圖3-A所示，野生型XynA與突變體XynAH297F的最適反應(yīng)pH值均為5.5，且在不同pH緩沖液中相對(duì)活性幾乎相同。由圖3-B可知，野生型XynA在pH 4～10的緩沖液中室溫處理20h后殘余活性均在90%左右；相同處理?xiàng)l件下，XynAH297F殘余活性均在95%左右。XynA與突變體XynAH297F均具有較好的pH穩(wěn)定性，且兩者的pH穩(wěn)定性也幾乎相同。說明H297位點(diǎn)對(duì)該酶的最適pH和pH穩(wěn)定性不起關(guān)鍵作用。

A-XynA和XynAH297P的最適反應(yīng)pH測(cè)定; B-XynA和XynAH297P的pH穩(wěn)定性研究圖3　XynA和XynAH297P的最適反應(yīng)pH及pH穩(wěn)定性研究Fig.3　The optimum pH and pH stability of the purified XynAand XynAH297P

2.3.2XynA及XynAH297P最適反應(yīng)溫度及熱穩(wěn)定性研究

測(cè)定不同溫度下XynA和XynAH297F的相對(duì)活性，如圖4-A所示，XynA的最適反應(yīng)溫度為70 ℃；XynAH297F的最適反應(yīng)溫度為75 ℃，與野生型相比提高了5 ℃。分別測(cè)定XynA和XynAH297的熱穩(wěn)定性發(fā)現(xiàn)，65 ℃處理20 min后，XynA殘余活性降低至80%左右，而XynAH297活性幾乎不變；80℃處理20 min后，XynA的殘余活性降低至10%左右，而XynAH297仍具有30%左右的殘余活性，說明突變體的熱穩(wěn)定性優(yōu)于野生型。

A-XynA和XynAH297P的最適反應(yīng)溫度；B-XynA和XynAH297P的熱穩(wěn)定性圖4　XynA和XynAH297P的最適反應(yīng)溫度及熱穩(wěn)定性研究Fig.4　The optimum temperature and thermal stability of XynAand XynAH297P

2.4　XynA及XynAH297P的動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)定

以不同濃度的木聚糖為底物，測(cè)定XynA和XynAH297P的活性，采用雙倒數(shù)作圖法計(jì)算動(dòng)力學(xué)參數(shù)。從表1可以看出，與重組野生型酶相比，突變體XynAH297P的Km增大，說明H297位點(diǎn)突變成F后導(dǎo)致酶對(duì)底物的親和力下降。但突變體Vmax和Kcat均增大了1倍，說明突變后酶促催化速率增大，酶活也提高了1倍。

表1　XynA及XynAH297P的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 1　Kinetic parameters for XynA and XynAH297P

2.5　同源建模

Swiss-model 服務(wù)器以蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)(http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do)中已經(jīng)報(bào)道的GeobacillusstearothermophilusT6(IXT6; PDB code 3mui)木聚糖酶的三維結(jié)構(gòu)為模板，模擬出突變型酶的三維結(jié)構(gòu)模型。從圖5可以看出，Glu44和Asn45是酶與底物結(jié)合的關(guān)鍵殘基，可能與底物木四糖形成氫鍵。H297突變?yōu)镻he后，底物的空間位置有一定改變，可能影響Glu44和Asn45與底物的作用力，使得酶對(duì)底物的親和力下降。另外，如圖5所示，Phe取代His后側(cè)鏈角度向外偏轉(zhuǎn)，活性空腔變大，可能有利于產(chǎn)物的釋放，從而增大酶促反應(yīng)速率。同時(shí)，Phe的苯環(huán)結(jié)構(gòu)的疏水性大于His的咪唑基團(tuán)，有研究表明，引入疏水性氨基酸有利于提高木聚糖酶的熱穩(wěn)定性[13]。李同彪等人對(duì)黑曲霉木聚糖酶XynZF-2進(jìn)行突變引入芳香族氨基酸和其他疏水性氨基酸后都明顯改善了XynZF-2的熱穩(wěn)定性、最適反應(yīng)溫度等[14-15]。

藍(lán)色代表突變前酶蛋白結(jié)合的底物分子木四糖；黃色代表突變后酶蛋白結(jié)合的底物分子；綠色代表his297殘基；紅色代表突變后的Phe殘基圖5　利用Siwss-Model 模擬XynA及XynAH297P的結(jié)構(gòu)圖Fig.5　The molecular simulation of XynA and XynAH297Pby Siwss-Model

3　結(jié)論

本研究利用重疊延伸PCR對(duì)嗜熱脂肪芽孢桿菌木聚糖酶XynA活性中心附近的H297位點(diǎn)突變?yōu)镕。在大腸桿菌中異源表達(dá)并純化相關(guān)蛋白，比較研究野生型木聚糖酶XynA和突變體XynAH297P的酶學(xué)性質(zhì)發(fā)現(xiàn)，H297突變?yōu)镕后，酶的最適pH和pH穩(wěn)定性不受影響，但最適反應(yīng)溫度和熱穩(wěn)定性有所提高。F297取代H297后，酶對(duì)底物的親和力下降，但催化反應(yīng)速率有一定程度提高。本結(jié)果為木聚糖酶結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系研究提供了材料。

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