釀酒葡萄品種SSR-PCR體系的優(yōu)化與建立

馬文瑞，鄒彎，魏玉潔，嚴(yán)密，全莉，王雪薇，高林龍，馬靜，武運(yùn)*，薛潔*

1(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊，830052)2(中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京，100015)

葡萄屬于葡萄科(Vitaceae)葡萄屬(Vitis L.)，為木質(zhì)藤本植物，是世界最古老的植物之一。優(yōu)良葡萄品種是生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)葡萄酒的關(guān)鍵因素之一，因此，釀酒葡萄種質(zhì)資源的鑒定與分類(lèi)是葡萄酒產(chǎn)業(yè)規(guī)范發(fā)展的基礎(chǔ)。葡萄主要的繁殖方式為無(wú)性繁殖，不同產(chǎn)區(qū)間互相引種，出現(xiàn)同名異物，同物異名現(xiàn)象頻率較高，又因葡萄種間雜交容易產(chǎn)生一些中間型和過(guò)渡型雜種，給葡萄的分類(lèi)鑒定帶來(lái)困難[1]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)在葡萄酒行業(yè)的發(fā)展，基于DNA指紋圖譜技術(shù)的品種鑒定方法，應(yīng)用于葡萄品種鑒別方面，得到了認(rèn)可與青睞。DNA指紋圖譜技術(shù)相對(duì)于傳統(tǒng)的細(xì)胞學(xué)，孢粉學(xué)，細(xì)胞學(xué)和生物化學(xué)鑒定方法，該技術(shù)能夠快速準(zhǔn)確地對(duì)親緣關(guān)系很近的品種或個(gè)體進(jìn)行辨別[2]。

簡(jiǎn)單序列重復(fù) (simple sequence repeats, SSR)技術(shù)是基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction, PCR)的DNA指紋圖譜技術(shù)，SSR技術(shù)也稱(chēng)簡(jiǎn)單重復(fù)序列，以少數(shù)幾個(gè)堿基為單位的多次重復(fù)序列。該技術(shù)具有共顯性遺傳，可重復(fù)性高，多態(tài)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于品種鑒定、遺傳多樣性檢測(cè)和遺傳圖譜的構(gòu)建等方面，如THOMAS等人利用葡萄微衛(wèi)星位點(diǎn)設(shè)計(jì)了5對(duì)引物，成功了區(qū)分了33個(gè)葡萄品種[3]；郭印山等人篩選出多態(tài)性高的49對(duì)SSR引物對(duì)15份不同原產(chǎn)地的葡萄品種進(jìn)行遺傳多態(tài)性分析，結(jié)果表明，歐亞種和美洲種葡萄親緣關(guān)系相對(duì)較近，而山葡萄與二者親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)，引物VMC-NG4B9和VMC3G9能將15個(gè)葡萄品種區(qū)分開(kāi)[4]；張萌等人利用SSR分子標(biāo)記分析了79份不同原產(chǎn)地的葡萄種質(zhì)資源的親緣關(guān)系，結(jié)果表明說(shuō)明中國(guó)野生葡萄資源和砧木品種與鮮食的栽培種親緣關(guān)系較遠(yuǎn)[5]。成冰等人利用SSR分析技術(shù)對(duì)13個(gè)釀酒白葡萄品種進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明13個(gè)品種均有特征性引物且篩選出的引物鑒別效率差異很大， VrZAG62和VVIb66可鑒定所有品種[6]。

本試驗(yàn)采用單因素與正交試驗(yàn)相結(jié)合方法，對(duì)影響釀酒葡萄 SSR-PCR 擴(kuò)增體系的主要因素進(jìn)行優(yōu)化，以期建立一套適合釀酒葡萄資源的SSR標(biāo)記反應(yīng)體系，為葡萄的種質(zhì)鑒定及親緣關(guān)系提供參考依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　試驗(yàn)材料

1.1.1試驗(yàn)原料與試劑

釀酒葡萄原料：新疆天山北麓葡萄酒產(chǎn)區(qū)的赤霞珠，霞多麗，美樂(lè)和玫瑰香釀酒葡萄，置于-80 ℃冰箱貯藏備用。

用于SSR-PCR反應(yīng)的10×PCR buffer(含 Mg2﹢15 mmol/L)、dNTPs和TaqDNA聚合酶(Taq酶)等購(gòu)自于大連寶生物有限公司。D15000 DNA marker和D2000 DNA marker購(gòu)買(mǎi)于北京天根生化科技有限公司。從相關(guān)文獻(xiàn)中篩選出6對(duì)釀酒葡萄SSR引物，見(jiàn)表1，由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。經(jīng)初步篩選，選用多態(tài)性好、條帶清晰的引物 VrZAG79作為單因素和正交試驗(yàn)的固定引物。其他試劑均購(gòu)自北京化工廠。

表1　SSR引物序列及退火溫度Table 1　Sequence and annealing temperature of SSR primer

注：F：上游引物；R：下游引物；Tm：退火溫度。

1.1.2儀器與設(shè)備

JY-CZ-BL垂直電泳槽，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司； VeritiTM96-Well Thermal Cycler 梯度PCR儀，美國(guó)ABI公司；BG-Power600 通用電泳儀電源，北京百晶生物技術(shù)有限公司；Tanon 1600凝膠成像系統(tǒng)，上海天能科技有限公司；BioSpec-nano核酸蛋白檢測(cè)儀，德國(guó)Eppendorf公司；微量移液器，德國(guó)Eppendorf公司；立式電熱壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠等。

1.2　試驗(yàn)方法

1.2.1基因組DNA提取及質(zhì)量檢測(cè)

采用改良的十六烷基三甲基溴化銨法(hexadecyl trimethyl ammonium bromide, CTAB)提取葡萄基因組DNA。參考齊玲倩等人的《水果果肉中總DNA提取方法的比較研究》并根據(jù)葡萄的特性加以改進(jìn)[8]。用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的片段大小及質(zhì)量，同時(shí)在核酸蛋白儀上測(cè)定樣品DNA的濃度。赤霞珠葡萄的基因組DNA作為單因素和正交試驗(yàn)的固定DNA模板。

1.2.2PCR基本反應(yīng)體系

本試驗(yàn)采用25 μL反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，參照10×PCR Buffer說(shuō)明書(shū)，并根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果建立初始體系為： 15 mmol/L Mg2﹢2.50 μL， 2.5 mmol/L dNTPs 2.00 μL，5.0 U/μLTaq酶0.30 μL，10 μmol/L引物1.00 μL，50 ng/25 μL DNA模板1.00 μL，剩余用超純水補(bǔ)足。

1.2.3PCR反應(yīng)程序及聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)

95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性50 s，退火溫度60 s，72 ℃延伸1 min，共35循環(huán)，最后72 ℃延伸7 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用 8.0%聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染檢測(cè)，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察，并照相分析。使用 D2000 DNA marker(含100，250，500，750，1 000，2 000 bp 6條帶)作為DNA核酸分子量梯度的標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.4單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

對(duì)影響SSR-PCR反應(yīng)體系的5個(gè)因素(Mg2+、dNTPs、Taq酶、引物、模板 DNA)進(jìn)行單因素試驗(yàn)，見(jiàn)表2。

表2　SSR-PCR單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 2　Single factor experiments design for SSR-PCR

單因素濃度梯度變化范圍參照陶巧靜等人的《葡萄SSR-PCR體系優(yōu)化及其誘變單株遺傳多樣性分析》[9]。當(dāng)1種因素為單一變量進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)，其他因素按照基本反應(yīng)體系的含量添加，比較不同濃度處理對(duì) SSR-PCR 擴(kuò)增結(jié)果的影響。

1.2.5正交優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)確定的各影響因素的濃度范圍，設(shè)計(jì)L16(45)進(jìn)行5因素4水平正交試驗(yàn)，重復(fù)2次，優(yōu)化條件見(jiàn)表3。PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)8%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，以確定適合釀酒葡萄SSR-PCR擴(kuò)增的最佳反應(yīng)體系。

表3　SSR-PCR反應(yīng)因素水平L16(45)正交設(shè)計(jì)

1.2.6正交優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果分析

結(jié)果分析參照段永紅等人的《藥用植物苦參SSR-PCR體系的優(yōu)化與驗(yàn)證》[10]。數(shù)據(jù)使用SPSS 20.0進(jìn)行分析。

1.2.7最優(yōu)反應(yīng)體系檢測(cè)

將篩選出的引物分別對(duì)赤霞珠，霞多麗，美樂(lè)和玫瑰香釀酒葡萄的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，進(jìn)行最優(yōu)體系進(jìn)行穩(wěn)定性驗(yàn)證。

2　結(jié)果與分析

2.1　基因組DNA提取結(jié)果檢測(cè)

由圖1可以看出，4個(gè)試驗(yàn)樣品的基因組DNA提取效果良好，DNA質(zhì)量較高，條帶清晰完整、無(wú)雜帶、濃度高。

M-D 15000 DNA marker；1-赤霞珠；2-霞多麗；3-美樂(lè)；4-玫瑰香圖1　釀酒葡萄基因組DNA的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig.1　Agarose gel electrophoresis of genomic DNA fromVitis vinifera

2.2　單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1Mg2+濃度對(duì)SSR-PCR結(jié)果的影響

Mg2+濃度作為PCR體系最重要的變量之一。Mg2+濃度過(guò)高，可能會(huì)產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增；Mg2+濃度過(guò)低，會(huì)造成擴(kuò)增效率降低，因此選擇合適的Mg2+濃度，提高PCR產(chǎn)率。圖2表明，當(dāng)Mg2+濃度在0.5和1.0 mmol/L時(shí)條帶不明顯，當(dāng)Mg2+濃度在1.5 mmol/L以上時(shí)出現(xiàn)擴(kuò)增片段，當(dāng)Mg2+濃度在2.0和2.5 mmol/L時(shí)，條帶清晰且多態(tài)性良好。綜合以上分析，選取Mg2+濃度在1.5～3.0 mmol/L范圍進(jìn)行正交優(yōu)化試驗(yàn)。

2.2.2dNTPs濃度對(duì)SSR-PCR結(jié)果的影響

不同濃度的dNTPs均擴(kuò)增出產(chǎn)物。濃度不同，擴(kuò)增片段的產(chǎn)率和清晰度不同。圖2表明，當(dāng)dNTPs為0.10和0.15 mmol/L時(shí)，條帶清晰，擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性最高；在0.20～0.35 mmol/L時(shí)，條帶清晰，但多態(tài)性降低；當(dāng)dNTPs濃度在0.35 mmol/L時(shí)，產(chǎn)物多態(tài)性最低。綜合經(jīng)濟(jì)角度分析，選取dNTPs濃度在0.10～0.25 mmol/L范圍進(jìn)行正交優(yōu)化試驗(yàn)。

圖2　不同濃度Mg2+、dNTPs、Taq酶PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.2　Electrophoresis of PCR amplification products withdifferent amounts of Mg2+,dNTPs, Taq DNA polymerase注：M-D2000 DNA marker；Mg2+濃度從右至左依次為0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00 mmol/L；dNTPs濃度從右至左依次為0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35 mmol/L；Taq酶濃度從右至左依次為0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、1.75 U

2.2.3Taq酶濃度對(duì)SSR-PCR結(jié)果的影響

Taq酶是PCR反應(yīng)中最重要的因素之一。Taq酶濃度過(guò)高，產(chǎn)生非特異性片段的幾率增大；濃度過(guò)低，PCR擴(kuò)增效率降低。不同濃度下的Taq酶均擴(kuò)增出產(chǎn)物且條帶清晰，圖2表明，Taq酶濃度為1.25～1.75 U的多態(tài)性高于0.50～1.00 U。綜合以上分析，選取Taq酶濃度在1.00～1.75 U范圍進(jìn)行正交優(yōu)化試驗(yàn)。

2.2.4引物濃度對(duì)SSR-PCR結(jié)果的影響

不同濃度的引物均擴(kuò)增出產(chǎn)物。引物濃度不同，擴(kuò)增片段的產(chǎn)率不同。圖3表明，當(dāng)引物濃度為0.1～0.2 μmol/L，條帶清晰，但多態(tài)性較低。當(dāng)引物濃度為0.3～0.6 μmol/L，條帶清晰，并且片段的多態(tài)性較高。綜合以上分析，選取引物濃度在0.3～0.6 μmol/L范圍進(jìn)行正交優(yōu)化試驗(yàn)。

圖3　不同濃度引物、DNA PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.3　Electrophoresis of PCR amplification products withdifferent amounts of primers and DNAM-D2000 DNA marker；引物濃度從左至右依次為0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60 μmol/L；DNA濃度從左至右依次為20.00、30.00、40.00、50.00、60.00、70.00 ng/25 μL

2.2.5DNA濃度對(duì)SSR-PCR結(jié)果的影響

適當(dāng)?shù)腄NA含量是增加PCR產(chǎn)率和特異性片段合成的首要條件。DNA含量過(guò)低，PCR產(chǎn)率下降；DNA含量過(guò)高，生成非特異性片段的幾率增大。圖3表明，不同濃度下的DNA均擴(kuò)增出產(chǎn)物，但當(dāng)DNA濃度在20 ng/25μL時(shí)背景顏色較淡，條帶模糊，當(dāng)DNA濃度在70 ng/25μL時(shí)背景顏色較深。在30～60 ng/25μL范圍內(nèi)，條帶清晰且多態(tài)性良好。綜合以上分析，選取DNA含量在30～60 ng/25μL范圍進(jìn)行正交優(yōu)化試驗(yàn)。

2.3　正交優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果分析

根據(jù)正交設(shè)計(jì)表設(shè)計(jì)的16個(gè)處理組合進(jìn)行SSR-PCR擴(kuò)增反應(yīng)，通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，得出結(jié)果均有擴(kuò)增產(chǎn)物，見(jiàn)圖4，2次重復(fù)結(jié)果基本一致。由于Mg2+、dNTPs、Taq酶、引物、模板 DNA的濃度組合不同，擴(kuò)增結(jié)果也存在著差異。1和2號(hào)組合擴(kuò)增產(chǎn)物較少，3和4號(hào)組合條帶模糊，不易觀察；而9、10、13和14號(hào)組合擴(kuò)增的條帶清晰，多態(tài)性較高，便于觀察。根據(jù)電泳圖，結(jié)合遺傳多樣性分析的要求，將擴(kuò)增產(chǎn)物豐富度高、清晰度高、便于觀察分析的最佳產(chǎn)物記為16分，反之，將無(wú)擴(kuò)增條帶或條帶較少、清晰度差的記為1分。根據(jù)電泳結(jié)果，分別進(jìn)行2次獨(dú)立打分統(tǒng)計(jì)。16個(gè)處理組合得到的分?jǐn)?shù)分別記為3、4、7、5、7、8、7、6、16、15、5、6、10、11、5、8；3、4、7、5、7、7、7、6、16、15、5、6、10、11、5、8。從兩次評(píng)分來(lái)看，各個(gè)組合的結(jié)果都有較高的一致性，重復(fù)性好。兩次評(píng)分取平均值，依據(jù)平均分結(jié)果進(jìn)行直觀分析和方差分析。

圖4　正交設(shè)計(jì)組合PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.4　Electrophoresis of PCR amplification productswith different combinationM-D2000 DNA marker；1～16表示為正交優(yōu)化設(shè)計(jì)組合

根據(jù)表4，k值為每一因素水平下的數(shù)據(jù)平均值，反映了各因素不同水平對(duì)反應(yīng)體系的影響情況，均值越大說(shuō)明該反應(yīng)水平對(duì)擴(kuò)增效果越好。因此最佳25 μL體系為Mg2+濃度為2.5 mmol/L，dNTPs為0.15 mmol/L，Taq酶為1.5 U，引物為0.5 μmol/L，DNA含量為40 ng/25μL。由直觀分析中的相同因素不同水平間的均值極差R值的大小判斷各因素對(duì)PCR反應(yīng)效果的影響程度，R值越大，說(shuō)明該因素對(duì)結(jié)果影響越大。各因素對(duì)結(jié)果的影響程度依次為：Mg2+>Taq酶>dNTPs>引物>模板DNA。

表4　正交設(shè)計(jì)直觀分析Table 4　Intuitive analysis of orthogonal design

對(duì)16個(gè)處理組合進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表5 。由方差分析中的 F值的大小判斷各因素對(duì)反應(yīng)效果的影響程度依次為：Mg2+>Taq酶>dNTPs>引物>模板DNA。結(jié)果與直觀分析一致。

表5　正交設(shè)計(jì)方差分析Table 5　Variance analysis of orthogonal design

2.4　最優(yōu)反應(yīng)體系檢測(cè)

根據(jù)上述試驗(yàn)建立的釀酒葡萄SSR-PCR體系，使用已經(jīng)篩選出的6對(duì)釀酒葡萄SSR引物，對(duì)4個(gè)釀酒葡萄品種進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠驗(yàn)證擴(kuò)增效果。擴(kuò)增結(jié)果如圖，均有擴(kuò)增結(jié)果，條帶相對(duì)清晰，易于觀察。條帶均集中在100～500 bp左右，不同引物產(chǎn)生的多態(tài)性條帶為5～13條，見(jiàn)圖5，圖6。證明單因素和正交試驗(yàn)建立的SSR-PCR體系有較高的穩(wěn)定性和重復(fù)性，該體系適用于釀酒葡萄SSR反應(yīng)。

圖5　4個(gè)釀酒葡萄品種SSR-PCR電泳結(jié)果Fig.5　Electrophoresis of PCR amplification products for4 Vitis vinifera varieties注：M-D2000 DNA marker；1～4表示是引物VrZAG79，樣品依次為赤霞珠，霞多麗，美樂(lè)，玫瑰香；5～8表示是引物VrZAG62，樣品依次為赤霞珠，霞多麗，美樂(lè)，玫瑰香；9～12表示是引物VVMD27，樣品依次為赤霞珠，霞多麗，美樂(lè)，玫瑰香

3　討論與結(jié)論

SSR技術(shù)是以PCR技術(shù)為核心發(fā)展起來(lái)的DNA分子標(biāo)記技術(shù)，因此SSR 分子標(biāo)記易受 PCR 反應(yīng)體系中的主要成分以及成分間的互作影響，Mg2+、Taq酶、引物、dNTPs和模板DNA均有可能影響到擴(kuò)增的敏感性、特異性以及產(chǎn)量，因此，SSR-PCR 反應(yīng)體系的建立和優(yōu)化是基于 SSR 標(biāo)記研究生物遺傳多樣性的基礎(chǔ)。

Mg2+是Taq酶的激活劑，而且還影響引物與模板的結(jié)合效率和產(chǎn)物的特異性，Mg2+濃度過(guò)高可降低PCR擴(kuò)增片段的特異性，同時(shí)，非特異性片段產(chǎn)生的幾率可能會(huì)增大；Mg2+濃度過(guò)低會(huì)影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)量甚至擴(kuò)增不出條帶。Taq酶濃度直接影響擴(kuò)增的產(chǎn)量和條帶的清晰度，其濃度偏高，易引起非特異性擴(kuò)增，過(guò)低活性降低，降低擴(kuò)增效率。本試驗(yàn)結(jié)果表明，Mg2+和 Taq酶對(duì)PCR擴(kuò)增影響較大，隨著濃度增加，PCR擴(kuò)增效率增加，當(dāng)Mg2+濃度達(dá)到2.0 mmol/L以上時(shí)，Taq酶濃度增加，擴(kuò)增效果變化不明顯。這一結(jié)果與陶巧靜，劉遵春[9,11]等人的研究結(jié)果一致。dNTPs作為PCR反應(yīng)的直接原材料，形成非特異性擴(kuò)增，濃度過(guò)低，則會(huì)影響擴(kuò)增效果；同時(shí)dNTPs還會(huì)對(duì)體系中的Mg2+產(chǎn)生拮抗作用，造成Mg2+濃度下降。因此本試驗(yàn)結(jié)果表明dNTPs最佳的添加量為0.1 mmol/L。這一結(jié)果與李亞慧，周海蘭等人的研究結(jié)果一致[12-13]。引物的濃度同樣會(huì)影響PCR擴(kuò)增反應(yīng)，濃度過(guò)高會(huì)促進(jìn)非特異性擴(kuò)增，增加引物二聚體的形成概率，濃度過(guò)低則影響擴(kuò)增效果。DNA的純度對(duì)體系擴(kuò)增的穩(wěn)定性有較大的影響，本試驗(yàn)的模板DNA純度較高，有效提高了電泳效果，DNA濃度對(duì)SSR擴(kuò)增體系影響較低，這一研究結(jié)果與潘珍珍，何仁峰等人的研究結(jié)果一致[14-15]。

本研究對(duì)影響新疆釀酒葡萄SSR-PCR反應(yīng)的Mg2+、Taq酶、引物、dNTPs和模板DNA等主要成分濃度用量進(jìn)行了單因素和正交優(yōu)化試驗(yàn)，確定新疆釀酒葡萄 SSR擴(kuò)增的25 μL最佳體系：Mg2+濃度2.5 mmol/L，dNTPs為0.15 mmol/L，Taq酶為1.5 U，引物為0.5 μmol/L，DNA含量為40 ng/25μL。

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