高效液相色譜法檢測乳中β-內(nèi)酰胺酶抑制劑他唑巴坦

于國萍,范美婧,郭佩佩,陳 媛,劉 鵬,董良偉

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150030)

他唑巴坦(Tazobactam)屬半合成青霉烷砜類衍生物,是以舒巴坦為原料化學(xué)合成的,抑酶作用更強(qiáng),是一種應(yīng)用廣泛的β內(nèi)酰胺酶抑制劑[12],具有廣譜的β內(nèi)酰胺酶抑制作用[3]。

抗生素常用來治療牛乳房炎,避免不了殘留在牛乳中,而不法商販通過添加β內(nèi)酰胺酶進(jìn)行掩蓋[45];隨著β內(nèi)酰胺酶檢測方法的出現(xiàn),有些人利用β內(nèi)酰胺酶抑制劑不可逆地與β內(nèi)酰胺酶結(jié)合的性質(zhì),在乳中添加β內(nèi)酰胺酶抑制劑,使該酶失去活性,導(dǎo)致含有β內(nèi)酰胺酶的奶不能被檢測出來[68];所謂不可逆競爭性抑制劑,是因?yàn)樗鼈冞M(jìn)行正常的水解反應(yīng)時,產(chǎn)生一些中間產(chǎn)物導(dǎo)致的。有研究表明,他唑巴坦會導(dǎo)致一些過敏反應(yīng),例如皮疹、藥熱等,嚴(yán)重危害消費(fèi)者身體健康[910]。

國內(nèi)外關(guān)于β內(nèi)酰胺酶抑制劑的檢測方法多集中于生物樣品[1113]、臨床醫(yī)療[1416]等方面,而關(guān)于β內(nèi)酰胺酶抑制劑的檢測方法又主要集中在分光光度法[17]、微生物法[18]、毛細(xì)管電泳法[19]、高效液相色譜質(zhì)譜[9]、高效液相色譜法[20]等。在乳制品中關(guān)于β內(nèi)酰胺酶抑制劑的檢測還沒有現(xiàn)行的標(biāo)準(zhǔn)發(fā)布,因此建立具有推廣性的檢測方法已經(jīng)迫在眉睫。

本文利用高效液相色譜法建立了乳中β內(nèi)酰胺酶抑制劑他唑巴坦的檢測方法,該方法實(shí)用性及推廣性較強(qiáng)、操作簡便,這對于保證乳制品的質(zhì)量,維護(hù)消費(fèi)者健康權(quán)益具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義和指導(dǎo)作用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

他唑巴坦標(biāo)準(zhǔn)品 美國sigma公司;乙腈、甲醇、正己烷 均為色譜純,瑞典歐森巴克化學(xué)公司;四丁基氫氧化銨、磷酸氫二鉀 天津市天力化學(xué)試劑有限公司;超純水 娃哈哈純凈水;原料乳 哈爾濱周邊奶牛場。

Hypersil ODS2 C18色譜柱 美國Thermo Fisher公司;Waters 2487高效液相色譜儀、Waters 2487紫外吸收檢測器 美國Waters公司;FE28型pH計、AL204電子天平 梅特勒儀器有限公司;MTN-2800D氮吹濃縮裝置 天津奧特賽恩斯儀器有限公司;LD42A型臺式低速離心機(jī) 北京眾益中和生物技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 液相色譜條件 色譜柱:Hypersil ODS2 C18(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動相:流動相A:乙腈;流動相B:取5 mL 5 mmol/L的四丁基氫氧化銨與995 mL 0.03 mol/L磷酸二氫鉀混合,調(diào)整pH為5;A∶B為(10∶90);檢測波長:213 nm;流速:1 mL/min;進(jìn)樣量:10 μL;

1.2.2 樣品前處理方法 用移液器取1 mL牛奶與4 mL乙腈于10 mL離心管中進(jìn)行混合,60 s振蕩混勻后,4000 r/min離心15 min,取2 mL上清液與3 mL正己烷于另一10 mL離心管中進(jìn)行混合,60 s振蕩混勻后,4000 r/min離心8 min,棄去上面的正己烷層,剩余液體用40 ℃氮?dú)獯蹈珊蠖ㄈ葜? mL,過0.45 μm有機(jī)系微孔濾膜后,按照上述最佳色譜條件進(jìn)行上機(jī)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行分析測定。

1.2.3 加標(biāo)樣品前處理方法 分別取5、50、100 μL 濃度為1 mg/mL的他唑巴坦標(biāo)準(zhǔn)溶液加入到1 mL牛奶樣品中,然后進(jìn)行樣品前處理(同1.2.2)。

1.2.4 色譜條件的優(yōu)化 依據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果,確定乙腈為沉淀蛋白溶劑,正己烷為脫脂溶劑。在此基礎(chǔ)上進(jìn)行流動相的優(yōu)選。

1.2.4.1 流動相選擇及配比的優(yōu)化 流動相的選擇,對比了甲醇水(10∶90)和乙腈水(10∶90)兩種不同流動相體系在同等條件下對他唑巴坦分離的效果,通過上機(jī)實(shí)驗(yàn)選擇合適的有機(jī)相;根據(jù)所選擇的有機(jī)相,優(yōu)化配比,分別選擇有機(jī)相與水的比例為10∶90、20∶80、30∶70、40∶60、50∶50,上機(jī)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行測定。

1.2.4.2 緩沖溶液的選擇及濃度的優(yōu)化 在色譜分析中,緩沖溶液的添加,可以起到防止樣品解離、峰型拖尾、增加方法的可靠性等作用。緩沖溶液的種類較多,比如酸類:醋酸,磷酸等緩沖液;堿類:三乙胺,二乙胺;鹽類的:磷酸二氫鉀,酸酸氫二鉀等[2123]。本實(shí)驗(yàn)在水相中添加濃度為0、5、10、15、20 mmol/L 四丁基氫氧化銨和濃度為0、0.015、0.03、0.06、0.12 mol/L的磷酸氫二鉀兩種緩沖溶液,考察了緩沖溶液及濃度對他唑巴坦分離效果的影響。

1.2.4.3 緩沖溶液pH的優(yōu)化 緩沖溶液的pH會影響樣品的分析效果,若pH的選擇不恰當(dāng)會導(dǎo)致分裂峰、不對稱峰、肩峰或?qū)挿宓?本實(shí)驗(yàn)利用0.05 moL/L的磷酸調(diào)節(jié)pH為3、4、5、6、7,考察他唑巴坦保留時間及分離效果受緩沖溶液pH的影響。

1.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢測限 本實(shí)驗(yàn)采用流動相稀釋標(biāo)準(zhǔn)溶液作標(biāo)準(zhǔn)曲線,分別用流動相逐步稀釋濃度為1 mg/mL的他唑巴坦標(biāo)準(zhǔn)溶液,將其變成濃度為5、10、50、100、150、200 (g/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液后,按上述最佳色譜條件上機(jī)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行測定。

1.2.6 回收率與精密度 實(shí)驗(yàn)采用空白加標(biāo)的方法進(jìn)行回收率和精密度測定。在空白牛奶樣品中分別添加濃度為5、50、100 μg/mL的他唑巴坦標(biāo)準(zhǔn)溶液后,在最佳色譜條件下進(jìn)行上機(jī)加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn),并依據(jù)公式:回收率(%)=樣品測定值/標(biāo)準(zhǔn)加入量×100進(jìn)行計算,每個濃度平行測定6次。

1.2.7 實(shí)際樣品的測定 本實(shí)驗(yàn)通過采用β內(nèi)酰胺酶商品化試劑盒,測定抑制β內(nèi)酰胺酶的最低的他唑巴坦的添加量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本論文采用Origin繪圖工具,SPSS Statistics 19.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。其中單因素方差分析(ANOVA)中采用Duncan檢驗(yàn),圖表中的字母表示差異顯著性分析的結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 流動相選擇及配比的優(yōu)化 首先對比了甲醇水(10∶90)和乙腈水(10∶90)兩種不同流動相體系在同等條件下對他唑巴坦分離的效果,結(jié)果如圖1所示,以甲醇水體系(圖1a)為流動相時,色譜峰峰形較差,他唑巴坦得不到理想的分離效果,而用乙腈代替甲醇(圖1b)作為流動相后,則峰形較好,改善了分離效果。因此,本實(shí)驗(yàn)選擇流動相為乙腈水體系,并進(jìn)一步考察乙腈與水不同配比時,對待測物質(zhì)分離效果的影響,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。

圖1 兩種流動相的色譜圖Fig.1 The chromatogram of two mobile phase注:a、b分別為甲醇水、乙腈水為流動相的色譜圖。

圖2 不同乙腈含量的色譜圖Fig.2 The chromatogram of different acetonitrile content注:a～e表示乙腈與水的比例分別為10∶90、20∶80、30∶70、40∶60、50∶50。

由圖2可知,乙腈含量升高,可提高檢測的靈敏度,但隨著乙腈含量升高,保留時間減小,使他唑巴坦的分離效果較差，而乙腈含量降低,可增大他唑巴坦的保留時間,并得到很好的分離結(jié)果。通過前期的預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),當(dāng)乙腈濃度低于10%時,分離效果沒有達(dá)到最佳狀態(tài),他唑巴坦和雜質(zhì)沒有完全分開,這可能是二者比例的改變,導(dǎo)致流動相極性的改變,不利于他唑巴坦和雜質(zhì)的分開。因此選擇乙腈∶水=10∶90比例時較為適宜。

2.1.2 緩沖溶液的選擇及濃度的優(yōu)化 由圖3可知,他唑巴坦的保留時間隨著添加四丁基氫氧化銨溶液濃度的增加而延長,雖然增加的效果不顯著,但色譜分離效果明顯改善,表明加入四丁基氫氧化銨后能夠增加其在色譜柱上的保留能力,所以在保證他唑巴坦與相鄰組分有效分離的條件下,本實(shí)驗(yàn)采用添加四丁基氫氧化銨溶液的濃度為5 mmol/L。

圖3 優(yōu)化四丁基氫氧化銨濃度的色譜圖Fig.3 Optimize the tetrabutylammonium hydroxide of concentration of potassium dihydrogen phosphate注:a～e表示四丁基氫氧化銨的濃度分別為0、5、10、15、20 mmol/L。

添加磷酸二氫鉀對他唑巴坦保留時間的影響見圖4,可以看出,隨著添加磷酸二氫鉀溶液濃度的增大,色譜圖中的保留時間也增大,但考慮色譜柱對有機(jī)鹽濃度的限制,應(yīng)選擇鹽濃度相對較低的緩沖溶液添加到流動相中,但是必須保證能夠有效分離。因此,本實(shí)驗(yàn)確定添加磷酸二氫鉀的濃度為0.03 mol/L。

圖4 優(yōu)化磷酸二氫鉀濃度的色譜圖Fig.4 Optimize the chromatogram of concentration of potassium dihydrogen phosphate注:a～b表示磷酸二氫鉀的濃度分別為0、0.0125、0.03、0.06、0.12 mol/L。

2.1.3 緩沖溶液pH的優(yōu)化 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示,他唑巴坦的保留時間隨著緩沖溶液pH的減小而逐漸增加,且pH越低,分離效果越好。當(dāng)pH為5時,色譜峰峰形窄且對稱,無拖尾現(xiàn)象,分離效果也好。因此,本實(shí)驗(yàn)選擇pH為5。

表1 pH與保留時間的關(guān)系Table 1 The relationship between pH and retention time

2.2 方法學(xué)的驗(yàn)證

2.2.1 系統(tǒng)適用性 在上述最佳色譜條件下,他唑巴坦標(biāo)準(zhǔn)溶液和原料乳中添加他唑巴坦溶液的色譜圖,分別如圖5和圖6所示。

圖5 最佳色譜條件下他唑巴坦標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖Fig.5 The chromatogram of tazobactam standard solution under the best chromatographic condition

圖6 最佳色譜條件下原料乳中添加他唑巴坦的色譜圖Fig.6 The chromatogram of tazobactam spiked in milk under the best chromatographic condition

從圖5和圖6可以看出,最佳色譜條件下,他唑巴坦標(biāo)準(zhǔn)溶液的保留時間為5.287 min,原料乳中添加他唑巴坦的保留時間為5.284 min,他唑巴坦標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品中他唑巴坦峰的主峰保留時間基本一致,且在原料乳中,他唑巴坦與雜質(zhì)得到很好的分離效果,表明最佳色譜條件,即色譜柱為Hypersil ODS2 C18(4.6 mm×250 mm,5 μm),流動相A為乙腈;流動相B為取5 mL 5 mmol/L的四丁基氫氧化銨與995 mL 0.03 mol/L磷酸二氫鉀混合,調(diào)整pH為 5;A∶B為(10∶90);檢測波長為213 nm;流速為1 mL/min;進(jìn)樣量為10 μL;此條件適用于乳中他唑巴坦的檢測。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢測限 本實(shí)驗(yàn)是采用流動相稀釋標(biāo)準(zhǔn)溶液作標(biāo)準(zhǔn)曲線,結(jié)果如圖7所示,可以看出,標(biāo)準(zhǔn)溶液回歸方程為:y=17429x4330,相關(guān)系數(shù)為0.9993,表明在0.5～200 g/mL的濃度范圍內(nèi)他唑巴坦與其峰面積呈正相關(guān),線性關(guān)系良好;按照最小檢出限的定義,在信噪比3∶1時,確定他唑巴坦的最小檢出限為0.07 g/mL,達(dá)到日常分析要求。

圖7 他唑巴坦的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.7 The standard curve of tazobactam

2.2.3 回收率與精密度 結(jié)果如表2所示，該方法的回收率在88.40%～94.18%之間,滿足加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)要求;而相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于等于1.57%,表明本法的精密度良好。

表2 乳中他唑巴坦的加標(biāo)回收率及精密度(n=6)Table 2 Recoveries and relative standard deviations of tazobactam spiked in milk(n=6)

2.2.4 實(shí)際樣品的測定 本實(shí)驗(yàn)室通過利用β內(nèi)酰胺酶商品化試劑盒,確定了抑制β內(nèi)酰胺酶所需的最低添加量為15 μg/mL,落在本研究所建立的HPLC方法的檢測范圍內(nèi)。按照此法對目前市場上的原料乳進(jìn)行測定,并對樣品添加15 μg/mL他唑巴坦標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行對比分析,結(jié)果如表3所示。從表中可以看出,樣品均未檢出β內(nèi)酰胺酶抑制劑他唑巴坦,15 μg/mL他唑巴坦加標(biāo)回收率的平均值為89.96%±0.48%。

表3 用當(dāng)前的方法分析不同牛奶樣品中他唑巴坦的含量Table 3 Analysis of tazobactam in different milk samples using the proposed method

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立并驗(yàn)證了測定乳中β內(nèi)酰胺酶抑制劑他唑巴坦的高效液相色譜的檢測方法。樣品采用乙腈作為沉淀蛋白溶劑,正己烷作為脫脂溶劑,確定了最佳色譜條件。結(jié)果表明他唑巴坦在0.5～200 μg/mL的濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系,最小檢出限為0.07 μg/mL,采用空白基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液的方法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)校正,顯示他唑巴坦的平均回收率在88.40%～94.18%之間,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于1.57%。表明該方法適用于乳中β內(nèi)酰胺酶抑制劑他唑巴坦的檢測,測定結(jié)果準(zhǔn)確可靠并具有一定的推廣價值,還可為監(jiān)管部門管理乳制品市場提供有力依據(jù)。

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