生鮮食品中蠟樣芽孢桿菌毒力基因及耐藥性研究

田萬帆,張 榮,龍 虎,柳 琳,賀蘇皖,杜 玄,蔣 敏,趙 悅,唐俊妮

(西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,四川成都610041)

蠟樣芽孢桿菌在我國細(xì)菌性食物中毒中居前三位,是一種需氧、有芽孢、無莢膜、能運(yùn)動(dòng)的革蘭氏陽性桿菌。該菌廣泛存在于自然環(huán)境,是剩米飯、剩菜和涼拌菜等引起食物中毒的常見致病菌[1]。蠟樣芽孢桿菌引起食物中毒的毒力因子主要為非溶血性毒素(NHE)、溶血性毒素(HBL)、細(xì)胞毒素K、腸毒素FM及嘔吐毒素(Cereulide)。溶血毒素和非溶血性毒素都是由3個(gè)亞基構(gòu)成的大分子蛋白,是引起腹瀉型食物中毒的主要原因,嘔吐毒素Cereulide是由(DOLeuDAlaLOValL-Val)3組成的十二肽,耐熱、耐酸堿、耐蛋白酶,可引起嚴(yán)重的橫紋肌溶解或者肝臟功能衰竭等疾病,也是引起蠟樣芽孢桿菌食物中毒的主要原因。腸毒素不耐熱,很容易失活,該類型食物中毒并不常見[23]。蠟樣芽孢桿菌的毒素可分為嘔吐型和腹瀉型,目前,針對(duì)毒力基因的檢測,嘔吐型蠟樣芽孢桿菌的目標(biāo)基因?yàn)閏es和cer;腹瀉型蠟樣芽孢桿菌的目標(biāo)基因?yàn)閑ntFM,hbl,bceT,nhe和cytK[3]。蠟樣芽孢桿菌除引起食物中毒外,還可引發(fā)菌血癥、心內(nèi)膜炎、腦膜炎等[4]。因此,了解生鮮食品中蠟樣芽孢桿菌攜帶的毒力基因,有助于掌握蠟樣芽孢桿菌的流行病學(xué)特征,同時(shí)通過對(duì)食品蠟樣芽孢桿菌分離株進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn),為合理選用抗生素治療食源性蠟樣芽孢桿菌引起的疾病提供依據(jù)。

本研究從成都市農(nóng)貿(mào)市場、路邊小攤共采集100份生鮮食品樣品,分離鑒定食品中污染的蠟樣芽孢桿菌,并對(duì)其攜帶的毒力基因和耐藥性進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甘露醇卵黃多粘菌素瓊脂培養(yǎng)基(MYP)、大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基(TSA)、MuellerHinton瓊脂(MHA) 青島高科園海博生物技術(shù)有限公司;胰蛋白胨大豆肉湯(TSB) 杭州微生物試劑有限公司;TE緩沖溶液;TAE緩沖溶液;REGULAR AGAROSE G10型瓊脂糖 BIOWEST公司;GELVIEW核酸染料、DL2000 Marker 寶生物工程(大連)有限公司;PCR引物 上海生工公司合成;25 mmol/L MgCl2、dNTP、Taq DNA聚合酶 北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司;含藥紙片 Oxiod Limited公司;參考菌株:蠟樣芽胞桿菌CMCC(B)63303 上海復(fù)祥生物科技有限公司。

DYY6C型電泳儀 北京六一儀器廠;WD800B型微波爐 順德市格蘭仕微波爐電器有限公司;PTC200 PCR儀、Universal Hood Ⅱ型凝膠成像儀 BioRad公司;SWCJ2FD潔凈工作臺(tái)蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;UV6100分光光度計(jì) 上海美普達(dá)儀器有限公司;GHP9080水式恒溫培養(yǎng)箱 上海齊欣科學(xué)儀器有限公司;HZQF160全溫振蕩培養(yǎng)箱 江蘇省太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠;AKHLⅢ24艾柯超純水機(jī) (臺(tái)灣艾柯)成都康寧實(shí)驗(yàn)專用純水設(shè)備;MLS3020電熱自動(dòng)滅菌鍋 日本SANYO公司;5804 R型Eppendorf冷凍離心機(jī) Eppendorf中國有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 食品樣本采集 在成都市附近的農(nóng)貿(mào)市場和路邊小攤采集不同生鮮食品樣品100份(其中:農(nóng)貿(mào)市場采集90份,路邊小攤10份,樣品包括:生肉類25份,蔬菜類44份,涼拌即食類14份,速凍食品類4份,米面制品類9份,全蛋2份,奶粉1份,鮮葡萄1份),每天采集的樣品立即送入實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分離鑒定。采樣時(shí)間為2014年7月至9月。

1.2.2 蠟樣芽孢桿菌的培養(yǎng) 分離和純化所有樣品均在無菌條件下進(jìn)行處理。按照《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)蠟樣芽孢桿菌檢驗(yàn)》(GB 4789.142014)進(jìn)行檢驗(yàn),適當(dāng)稀釋的培養(yǎng)物接種到MYP瓊脂平板上(30±1) ℃培養(yǎng)24～48 h,從MYP瓊脂平板上挑取疑似菌落,再次純化并進(jìn)行鑒定。

1.2.3 蠟樣芽孢桿菌的16S rRNA測序鑒定 將純化的菌株和參考菌株CMCC(B)63303分別接種到TSB培養(yǎng)基中,37 ℃恒溫培養(yǎng)8～12 h,采用微波加熱法[5]提取菌株DNA。以細(xì)菌的16S rRNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,引物序列為:16S27F-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG;16S1492R-GGTTACCTTGTTACGACTT[6]。PCR反應(yīng)體系:10×PCR緩沖液2 μL,Mg2+1.6 μL,dNTP混合液1.2 μL,Taq DNA聚合酶 0.2 μL,模板DNA 1 μL,引物各0.5 μL,無菌去離子水補(bǔ)足體積至20 μL。PCR反應(yīng)程序:95 ℃ 5 min,95 ℃ 40 s,55 ℃ 50 s,72 ℃ 40 s,72 ℃ 7 min,35個(gè)循環(huán)。將擴(kuò)增產(chǎn)物送至成都擎科生物公司進(jìn)行測序比對(duì)。

1.2.4 蠟樣芽孢桿菌的毒力基因檢測 DNA模板的制備同上,蠟樣芽孢桿菌的檢測基因的引物序列和擴(kuò)增片段長度詳見表1,PCR反應(yīng)體系同上,退火溫度詳見表1,擴(kuò)增產(chǎn)物采用瓊脂糖電泳和凝膠成像系統(tǒng)檢測。

表1 蠟樣芽孢桿菌的檢測基因引物Table 1 The primers of different genes for B. cereus

1.2.5 蠟樣芽孢桿菌的耐藥性 檢測藥敏實(shí)驗(yàn)根據(jù)美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(Clinical and laboratory standards institute,CLSI)推薦的KB紙片擴(kuò)散法進(jìn)行操作,實(shí)驗(yàn)結(jié)果按照CLSI 的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定。所用抗菌藥物及濃度見表2。

表2 18種抗生素藥物及其使用濃度Table 2 The concentration of different drugs used in this study

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

藥敏實(shí)驗(yàn)每株菌和每個(gè)藥片平行重復(fù)3次,結(jié)果以平均值±SD表示,數(shù)據(jù)采用SPSS 19. 0統(tǒng)計(jì)軟件處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 食品樣品中蠟樣芽孢桿菌的分離與鑒定結(jié)果

蠟樣芽孢桿菌在MYP培養(yǎng)基上的形態(tài)為粉紅色菌落,有2～5 mm沉淀環(huán),菌落較大,表面較為干燥(詳見圖1)。通過形態(tài)學(xué)分離鑒定,初步得到24株菌株。進(jìn)一步對(duì)24株菌株進(jìn)行16S rRNA測序比對(duì),比對(duì)結(jié)果也證實(shí)24株分離菌株均為芽孢桿菌屬。農(nóng)貿(mào)市場樣品90份,檢出17份,檢出率為18.9%;路邊小攤采樣10份,檢出7份,檢出率為70%。路邊小攤食品中的蠟樣芽孢桿菌的檢出率遠(yuǎn)高于農(nóng)貿(mào)市場。并且分離的菌株大部分來自于米、面制品及涼拌即食類食品,詳見表3的采樣記錄。

圖1 蠟樣芽胞桿菌分離菌株在選擇性培養(yǎng)基MYP上的菌落形態(tài)及16S rDNA測序比對(duì)結(jié)果Fig.1 The colony morphology on MYP plate and the sequence analysis of 16 S rDNA of B. cereus isolates

表3 蠟樣芽孢桿菌分離的樣品來源Table 3 The sampling sources of B. cereus isolates

2.2 蠟樣芽孢桿菌的毒力基因檢測結(jié)果

根據(jù)PCR檢測結(jié)果,24株分離菌株在所檢測的毒力基因中,嘔吐型基因ces和cer的檢出率較低,僅在BC4中發(fā)現(xiàn);腹瀉型基因nheC在24株中都有檢出;cytK有13株檢出;bceT有12株檢出;hblA有11株檢出;nheB有10株檢出;hblC、hblD、nheA各有9株檢出;hlyⅡ有7株檢出;hblB、entFM檢出率為0;蠟樣芽孢桿菌的看家基因rpoB、gyrB、groEL、vrrA在24株分離菌株中的檢出率為100%。參考菌株CMCC(B)63303中檢測出nheC基因和四個(gè)看家基因。另外,每株分離菌株至少攜帶1個(gè)以上的毒力基因,其中,BC2中攜帶9個(gè),BC3和BC5菌株各攜帶8個(gè),BC1攜帶7個(gè),具體結(jié)果詳見表4。

表4 蠟樣芽孢桿菌分離菌株中毒力基因的分布情況Table 4 The distribution of different virulence genes in B. cereus isolates

2.3 蠟樣芽孢桿菌對(duì)18種藥物的敏感性檢測結(jié)果

根據(jù)藥物敏感性檢測和判定結(jié)果發(fā)現(xiàn),24株被測蠟樣芽孢桿菌對(duì)18種抗生素存在不同程度的耐藥,藥物敏感譜詳見表5。從表5可以看出,24株蠟樣芽孢桿菌對(duì)桿菌肽B和磺胺甲亞唑兩種藥物的耐藥率為100%,對(duì)苯唑西林、青霉素耐藥率分別為96.2%,中介率為3.8%。對(duì)阿米卡星的耐藥率為0,中介率是19.2%,敏感率是80.8%。對(duì)亞胺培南、慶大霉素的耐藥率為7.7%,中介率為11.5%,敏感率為80.8%。對(duì)呋喃妥因、萬古霉素、頭孢西丁、利福平的耐藥性較相似,耐藥率分別為76.9%、65.4%、61.5%、56.7%,敏感率較低,為0和3.8%。對(duì)氧氟沙星、四環(huán)素、紅霉素、環(huán)丙沙星、克林霉素、鏈霉素、氯霉素的耐藥率較低均小于40%,且依次降低。

表5 蠟樣芽孢桿菌分離菌株對(duì)18種藥物的敏感性檢測結(jié)果Table 5 The results of antimicrobial susceptibility test for B. cereus isolates

3 結(jié)論與討論

近年來,蠟樣芽孢桿菌引起食物中毒事件的報(bào)道逐年增加,其在不同食品中的檢測率也較高,如楊媛等[17]從原料乳中分離蠟樣芽孢桿菌,檢出率為33%;李毅等[18]從溫州地區(qū)不同食品中分離蠟樣芽孢桿菌,檢出率為57.4%;章樂怡等[19]從嬰幼兒奶粉、米粉的蠟樣芽胞桿菌中分離蠟樣芽孢桿菌,檢出率為71.79%。本研究中,我們一共從農(nóng)貿(mào)市場和路邊小攤采集生鮮食品樣品100份,采樣種類豐富,這些食品中蠟樣芽孢桿菌的檢出率為24%。其中,路邊小攤檢出率(70%)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于農(nóng)貿(mào)市場(18.9%)。并且,從我們的檢測結(jié)果來看,米面制品和涼拌食品中蠟樣芽孢桿菌的污染情況較為突出。蠟樣芽孢桿菌易污染米飯、米粉、涼面等含淀粉豐富的米面制品和涼拌食品[20],夏季涼拌食品所用的配料及原材料長時(shí)間暴露在環(huán)境中,所售賣的食品衛(wèi)生難以保證,特別是路邊小攤的食品安全問題應(yīng)當(dāng)引起有關(guān)部門的注意。

針對(duì)24株分離菌株攜帶的毒力基因進(jìn)行檢測,嘔吐型蠟樣芽孢桿菌檢測的目標(biāo)基因ces和cer只在BC4分離株中發(fā)現(xiàn),檢出率較低。盡管entFM基因在所有菌株中未檢出,但是引起蠟樣芽孢桿菌腹瀉的其他目標(biāo)基因hbl,bceT,nhe和cytK在24株分離菌株中的檢測率偏高,要引起重視。四個(gè)看家基因groEL、gyrB、rpoB、vrrA在所有菌株中都有檢出,也進(jìn)一步驗(yàn)證了分離菌株的鑒定情況。文獻(xiàn)研究表明溶血素hbl基因、非溶血性腸毒素nhe基因、細(xì)胞毒素cytK基因是引起腹瀉的主要毒力基因,腸毒素entFM基因、腸毒素bceT基因是潛在的腹瀉性毒力基因[21]。從我們的毒力基因檢測結(jié)果可以看出,本次研究所分離的這些菌株如果感染到人引起腹瀉的可能性較大,說明采樣的生鮮食品引起食物中毒的風(fēng)險(xiǎn)偏高。

24株菌株對(duì)桿菌肽B和磺胺甲亞唑兩種藥物的耐藥率為100%,對(duì)青霉素類藥物的耐藥性也較高。這可能與該地區(qū)這些抗生素的使用頻率有關(guān)聯(lián)。李毅等[18]對(duì)溫州地區(qū)2011～2012年食品中檢出的39株蠟樣芽孢桿菌進(jìn)行藥敏檢測,他們的結(jié)果發(fā)現(xiàn)39株蠟樣芽孢桿菌對(duì)四環(huán)素和利福平的耐藥率較高。莊子慧等[22]對(duì)我國不同地區(qū)2011年收集的238株蠟樣芽孢桿菌進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn),結(jié)果發(fā)現(xiàn)食源性蠟樣芽孢桿菌蠟樣芽孢桿菌對(duì)青霉素類藥物的抗性也較高。楊移斌等[23]針對(duì)羅非魚源分離的一株蠟樣芽孢桿菌進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)該菌株對(duì)苯唑西林、青霉素等10種抗生素耐藥。盡管這些不同地區(qū)不同來源分離的蠟樣芽孢桿菌的耐藥情況存在一定差異,但蠟樣芽孢桿菌食品源分離菌株的耐藥性卻不容忽視。

本研究結(jié)果為本地區(qū)的蠟樣芽孢桿菌引起食物中毒的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和治療措施提供一定的參考價(jià)值。另外,建議有關(guān)部門加強(qiáng)對(duì)生鮮食品流通環(huán)節(jié)的管理,提升生鮮食品加工衛(wèi)生水平,改進(jìn)即食食品安全狀況。

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