基于納米壓痕實(shí)驗(yàn)的犬牙周膜彈性模量研究

傅肄芃 王耀駿 吳斌 黃輝祥 嚴(yán)斌

口腔正畸治療中，牙周膜的應(yīng)力與應(yīng)變是牙齒移動(dòng)的始動(dòng)因素［1－2］，許多關(guān)于正畸牙移動(dòng)過程中骨改建的理論都是基于這一假說，即應(yīng)力與應(yīng)變可以控制成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞的分化和活性。而牙周膜彈性模量則能反映牙周組織加載后初始的應(yīng)力與應(yīng)變關(guān)系。因此，準(zhǔn)確認(rèn)識(shí)牙周膜的彈性模量可以分析牙周組織的應(yīng)力與應(yīng)變［3］，了解矯治器的作用機(jī)制及力學(xué)性能，并確定不同矯治系統(tǒng)對牙齒的施力與牙齒位移的關(guān)系，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)正畸牙的有效移動(dòng)，合理分配正畸治療時(shí)間，完善矯治系統(tǒng)［4］。

目前，國內(nèi)外學(xué)者對于牙周膜彈性模量的研究［5］在以下方面仍存在不足：一方面，由于牙周膜結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性以及實(shí)驗(yàn)對材料和儀器的要求很高，所以實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性較差。不同文獻(xiàn)報(bào)道的牙周膜彈性模量范圍為0.01～1 750 MPa［6］，研究結(jié)果的差異很大。另一方面，大部分研究都是將牙周膜作為各向同性的生物材料，忽視了牙周膜不同部位以及位于同一牙根軸向不同位置可能存在的性質(zhì)差異［7］。

在正畸牙受力情況下，一側(cè)牙周膜受壓力壓縮，另一側(cè)受拉力拉伸［8］。對于牙周膜的拉伸實(shí)驗(yàn)，國內(nèi)外許多學(xué)者已進(jìn)行了大量研究［9］，而對壓縮性能有關(guān)的研究較少，且集中于宏觀測試。近年來，納米壓痕技術(shù)開始用于各種工程材料以及軟硬組織［10－11］力學(xué)性能的研究，此技術(shù)通過類似于針尖樣的壓頭壓入樣品表面而產(chǎn)生的印記來計(jì)算樣品的各項(xiàng)力學(xué)參數(shù)，是一種檢測材料微小區(qū)域力學(xué)性能的有效實(shí)驗(yàn)手段，其精度可達(dá)納米級(jí)別。此外，納米壓痕還具有定點(diǎn)測試、對樣品形狀要求不高、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)。在口腔醫(yī)學(xué)領(lǐng)域主要用于牙釉質(zhì)［12］、牙本質(zhì)［13］等硬組織力學(xué)性能的測量，或是對粘結(jié)劑［14］、烤瓷牙冠材料等口腔用材料性能的驗(yàn)證，而對于生物軟組織的研究較少。所以，為了完善牙周膜受壓力情況下的生物力學(xué)性能研究，本研究應(yīng)用納米壓痕技術(shù)定量測定沿牙長軸不同層面和同一層面牙根不同方位（舌側(cè)、頰側(cè)、近中、遠(yuǎn)中）的動(dòng)物牙周膜彈性模量，分析差異并探究影響牙周膜彈性模量的可能因素。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料與儀器

健康比格犬4只［雌性，2歲齡，南京醫(yī)科大學(xué)倫審（2015）169號(hào)］，空氣針法處死后制取樣本。

切片石蠟（上海華靈康復(fù)機(jī)械廠）（熔點(diǎn)56～58℃）；迷你鋼鋸（SATA，10in），低速切割機(jī)（IsoMet，Buehler，500 r／s，USA）；納米壓痕儀（Micro Materials，TM600，UK）；照片處理軟件 IMAGE ACCESS（Version 5.30，IMAGIC-Imaging Solutions，Germany）；圖表制作軟件Origin（Version 9，origin-lab，USA）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣本制作與處理 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處死后立即將下頜骨分離，去除肌肉、黏骨膜等軟組織，沿下頜兩側(cè)第一磨牙近中和遠(yuǎn)中鄰牙間隙鋸斷，使之與頜骨分離，得到8個(gè)含完整磨牙、牙周膜與牙槽骨的骨塊。隨后用石蠟將其包埋，用低速切割機(jī)在生理鹽水滴注冷卻下沿垂直于牙長軸的方向平行切片（圖1），制成厚度為（2.0±0.3）mm的樣本，每顆磨牙取3個(gè)切片樣本，根據(jù)其在牙根中的位置不同分為根中、根尖、頸緣3組，共獲取24個(gè)樣本。

圖1 樣本切片部位示意圖（A）以及橫斷面切片樣本（B，×10）Fig 1 Schematic diagram of the longitudinal location of the sample（A）and photograph of a typical transverse section of the sample（B，×10）

使用記號(hào)筆對根中，根尖，頸緣3組每個(gè)樣本近遠(yuǎn)中，頰舌側(cè)4個(gè)方位標(biāo)記壓入點(diǎn)，以利于在納米壓痕儀配備的顯微鏡下尋找定位。試件制作完成后置于生理鹽水中于 －20℃［15］凍存。

1.2.2 納米壓痕實(shí)驗(yàn)原理 通過測定已知各項(xiàng)力學(xué)參數(shù)的壓頭在樣品表面留下的印記而推測樣品力學(xué)參數(shù)的方法稱為壓痕技術(shù)。而納米壓痕技術(shù)又是傳統(tǒng)壓痕技術(shù)在測量微小樣品時(shí)的具體應(yīng)用。納米壓痕儀主要由掃描控制系統(tǒng)、傳感系統(tǒng)以及壓頭3個(gè)部分組成。其中，壓頭是影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重要因素，平頭壓頭［16］（與樣本接觸面為平面）比較適合軟材料彈性模量的測試［17］。

一個(gè)完整的壓痕過程通常包括兩部分，即加載過程和卸載過程［18］。圖2是利用納米壓痕測試儀測得的材料典型的加載－卸載過程的載荷－壓痕深度關(guān)系曲線。

圖2 納米壓痕實(shí)驗(yàn)壓頭壓入牙周膜加載示意圖（A）和移位曲線（B）F：Load；Fmax：Maximum load；h：Displacement；hmax：Maximum displacement；hR：Displacementafter unloading；S：Elastic contact stiffnessFig 2 Schematic diagram of nanoindentation test（A）and loaddisplacement curve（B）

為研究材料的粘彈性蠕變行為，通常加載過程和卸載過程的中間加入一個(gè)保載的過程，即在某一段時(shí)間內(nèi)，保持壓頭的載荷不變，此時(shí)壓頭位移會(huì)繼續(xù)增加，如在載荷位移曲線上表現(xiàn)出一個(gè)平臺(tái)的階段，可認(rèn)為材料發(fā)生了蠕變。由Oliver-Pharr［13］提出而又廣泛被采用的納米硬度理論，約化彈性模量E*（reduced modulus）可由下式獲得：

經(jīng)過預(yù)處理后，缺陷已被清晰地呈現(xiàn)出來。為了識(shí)別出缺陷，需要對缺陷的特征進(jìn)行提取，提取的特征量能否準(zhǔn)確地描述缺陷，這對后續(xù)的識(shí)別具有關(guān)鍵作用。

其中，納米壓痕壓頭與被測物體的接觸面積Ac＝πr2，β是與壓頭形狀有關(guān)的常數(shù)。對于圓形壓頭，β＝1，則有：

Oliver和Pharr推導(dǎo)出卸載段曲線的載荷與壓痕深度公式：

其中，F(xiàn)為壓痕載荷，C和m為通過Origin軟件對載荷位移曲線進(jìn)行擬合得到的擬合參數(shù)，h為壓痕深度，hR為殘余壓痕深度，由于卸載剛度S＝dF／dh，對公式3求導(dǎo)，可得到卸載剛度：

代入公式2，可得約化彈性模量E*。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 比格犬牙周膜切片樣本以所在牙根不同層面（頸緣、根中、根尖）為依據(jù)分為3組，每組8個(gè)樣本。每個(gè)樣本均有近中、遠(yuǎn)中、舌側(cè)、頰側(cè)4個(gè)方位。在顯微鏡下找到牙周膜區(qū)域壓入點(diǎn)，牙周膜與牙體組織、骨組織在鏡下有明顯差別（圖3）。

圖3 納米壓痕儀顯微鏡下犬牙槽骨、牙周膜、牙骨質(zhì)組織圖（×100）Fig 3 Micrographs of alveolar bone，PDL and cementum （×100）

顯微鏡下每個(gè)方位定義2×2的矩陣點(diǎn)，每個(gè)點(diǎn)均使用平頭壓頭以0.1 mN／s向牙周膜內(nèi)壓入，直到應(yīng)力到達(dá)1 mN后維持20 s保載時(shí)間，牙周膜得到充分的形變。然后以0.1 mN／s應(yīng)力減少速率進(jìn)行卸載，直至壓頭離開牙周膜表面。每個(gè)壓入點(diǎn)重復(fù)加載5次，繪制納米壓痕的載荷－位移曲線，并根據(jù)公式計(jì)算牙周膜的彈性模量。以圖4示例，取卸載初期斜率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用統(tǒng)計(jì)分析軟件 SPSS（Version 19.0，IBM，USA）對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，評價(jià)牙根層面因素以及牙周膜方位因素對牙周膜彈性模量的影響，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖4 犬牙周膜樣本納米壓痕實(shí)驗(yàn)載荷－位移曲線圖Fig 4 Load-displacement curve of beagle＇s PDL from nanoindentation test

2 結(jié) 果

對于24個(gè)樣本的納米壓痕實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，分別計(jì)算彈性模量并按照所處牙周膜不同區(qū)域進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析（表1）。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，比格犬牙周膜彈性模量最小值位于牙根頸緣樣本的頰側(cè)部位，為（0.452±0.118）MPa，最大值位于根中樣本的近中方位，為（1.542±0.591）MPa。表2析因設(shè)計(jì)方差分析顯示，牙根同一層面不同方位這一變異來源對牙周膜彈性模量具有顯著性影響（P＜0.05），而牙根層面和兩者交互作用因素對牙周膜彈性模量影響不顯著。進(jìn)一步兩兩比較可知（表3），頰舌側(cè)與近遠(yuǎn)中方位的牙周膜彈性模量具有顯著性差異，但頰側(cè)與舌側(cè)、近中與遠(yuǎn)中沒有顯著性差異。

表1 納米壓痕實(shí)驗(yàn)獲得的不同區(qū)域牙周膜彈性模量表 （±s，MPa）Tab 1 Elasticmodulus of various locations（x±s，MPa）

表1 納米壓痕實(shí)驗(yàn)獲得的不同區(qū)域牙周膜彈性模量表 （±s，MPa）Tab 1 Elasticmodulus of various locations（x±s，MPa）

牙根層面牙根方位舌側(cè) 頰側(cè) 近中 遠(yuǎn)中根中 0.716±0.380 0.600±0.366 1.542±0.591 1.190±0.254根尖 0.663±0.135 0.973±0.845 0.967±0.718 1.011±0.781頸緣 0.477±0.269 0.452±0.118 1.163±0.640 1.143±0.506

3 討 論

在生物力學(xué)研究領(lǐng)域，納米壓痕實(shí)驗(yàn)方法多用于硬質(zhì)材料的力學(xué)研究［19］，對于軟質(zhì)地材料，尤其是生物軟組織材料研究較少。近年來，有學(xué)者［20］提出了采用納米壓痕儀研究牙周膜彈性模量的方法，本研究在該方法礎(chǔ)上進(jìn)行了具體的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。以往納米壓痕實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用最多的是Berkovich壓頭，為一圓錐形壓頭，會(huì)對軟組織材料產(chǎn)生破壞性；故本研究采用了圓柱形平面壓頭，該壓頭能與被測表面充分接觸，并可減少尺寸效應(yīng)帶來的測量誤差，較適用于軟組織材料的測試［17，21］。實(shí)驗(yàn)中，對每壓入點(diǎn)使用平頭壓頭以 0.1 mN／s向牙周膜內(nèi)壓入，直到應(yīng)力到達(dá) 1 mN［21］，該大小的應(yīng)力不會(huì)對牙周纖維產(chǎn)生破壞。從圖4可以看出，在保載過程中壓痕深度仍在增加，這說明牙周膜發(fā)生了蠕變［22］，體現(xiàn)了其粘彈性特征。由于蠕變這一現(xiàn)象的存在，較小的卸載率可能會(huì)導(dǎo)致卸載曲線的斜率出現(xiàn)負(fù)值，出現(xiàn)無法計(jì)算彈性模量的情況，可通過設(shè)置較大的卸載率或者增加保載時(shí)間減少蠕變對于實(shí)驗(yàn)的影響。

表2 納米壓痕實(shí)驗(yàn)的牙周膜彈性模量牙根層面、方位方差分析Tab 2 Variance analysis of different locations（circumferential and longitudinal）

表3 牙根方位間兩兩比較方差分析（LSD）Tab 3 Least significant difference（LSD）of PDL locations

目前部分學(xué)者認(rèn)為牙周膜彈性模量約為1 MPa［23－24］，本研究通過納米壓痕實(shí)驗(yàn)法測得的犬彈性模量介于（0.452±0.118）MPa與（1.542±0.591）MPa之間，與之相近。由于實(shí)驗(yàn)中選取了牙根不同層面、不同方位的壓入點(diǎn)，不同壓入點(diǎn)之間的彈性模量存在差異。由于目前較為缺少類似的牙周膜微觀實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持，該部分內(nèi)容的精確性和結(jié)論的可靠性需要后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

本研究將實(shí)驗(yàn)對象按沿牙長軸方向?qū)Σ煌瑢用娣殖深i緣、根中、根尖3組，由兩兩比較可知，牙根軸向?qū)用嬉蛩貙ρ乐苣椥阅Ａ康挠绊懖痪邆浣y(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí)，對每個(gè)層面的樣本選取近中、遠(yuǎn)中、舌側(cè)、頰側(cè)四個(gè)方位進(jìn)行納米壓痕實(shí)驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，牙周膜方位因素顯著影響了牙周膜彈性模量。關(guān)于牙周膜彈性模量的單軸拉伸實(shí)驗(yàn)［25］也得出類似結(jié)論，即牙周膜方位因素對于牙周膜彈性模量的影響大于牙根層面因素，但由于納米壓痕實(shí)驗(yàn)獲得的彈性模量只代表牙周膜在實(shí)驗(yàn)位點(diǎn)處的微觀表征，而單軸拉伸實(shí)驗(yàn)所獲得的彈性模量可以認(rèn)為是無數(shù)個(gè)微觀位點(diǎn)彈性模量的總體表征，并且具體計(jì)算方法和遵循的理論依據(jù)也都不同。此外，本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，頰舌側(cè)方位與近遠(yuǎn)中方位牙周膜彈性模量具有顯著性差異。這與國外學(xué)者Uhlir等［26］對牛下頜中切牙橫斷面切片做軸向拉伸實(shí)驗(yàn)，得到實(shí)驗(yàn)組頰舌側(cè)與近遠(yuǎn)中部分牙周膜彈性模量有顯著差異的結(jié)論相符。推測可能與牙周膜的彈性模量與牙周膜纖維密度、纖維分布、方向以及牙周膜厚度等因素有關(guān)。實(shí)驗(yàn)中，頰舌向彈性模量小于近遠(yuǎn)中，可能由于在比格犬后牙的咀嚼側(cè)向運(yùn)動(dòng)中，頰舌側(cè)所受的力大于近遠(yuǎn)中，其較小的彈性模量支持了頰舌側(cè)牙周膜在受到較大應(yīng)力的情況下，產(chǎn)生較小的應(yīng)變，即相同應(yīng)變下，可較近遠(yuǎn)中承載更大的應(yīng)力。而頰側(cè)與舌側(cè)、近中與遠(yuǎn)中牙周膜彈性模量比較結(jié)果顯示沒有顯著性差異。此結(jié)果對于臨床上正畸牙不同方向移動(dòng)時(shí)施加力的大小選擇，以及牙拔除時(shí)施力大小和方式可能有一定的指導(dǎo)意義，但還需要進(jìn)一步的臨床研究來推理驗(yàn)證。

本實(shí)驗(yàn)測量位點(diǎn)多，當(dāng)某些位點(diǎn)的載荷－位移曲線有明顯異常時(shí)可以摒棄并及時(shí)補(bǔ)測，從而有效減少實(shí)驗(yàn)誤差。但是實(shí)驗(yàn)中仍存在不足之處：本實(shí)驗(yàn)的研究對象是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物比格犬的牙周膜，比格犬牙周膜的組成與人牙周膜相似，但牙根形態(tài)、牙周膜厚度等與人牙齒有所不同，所以其生物力學(xué)性質(zhì)與人牙周膜應(yīng)當(dāng)有所不同；且本實(shí)驗(yàn)僅研究了比格犬磨牙的牙周膜，對于不同牙位牙周膜彈性模量的差異以及牙周膜在體內(nèi)環(huán)境的生物力學(xué)性質(zhì)等都有待今后進(jìn)一步的研究。

4 結(jié) 論

本研究在微觀力學(xué)角度對比格犬磨牙牙周膜彈性模量進(jìn)行了初步研究，得出了以下結(jié)論：①基于納米壓痕法測得比格犬牙周膜彈性模量約為0.452～1.542 MPa；②比格犬下頜磨牙沿牙長軸不同牙根層面的牙周膜彈性模量沒有明顯差異；③比格犬下頜磨牙沿牙長軸同一層面不同方位的牙周膜彈性模量存在明顯差異。

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