正交優(yōu)化蟻獅黃酮超聲提取工藝

王穎娟張　培李子忠

（1.興義民族師范學院民族藥用生物資源研究與開發(fā)實驗室，貴州　興義　562400 2.貴州大學昆蟲研究所，貴州　貴陽　550025）

蟻獅(Antlion)，別名地牯牛、沙猴、倒退蟲、沙牛等，隸屬脈翅目Neuroptera蟻蛉科Myrmeleontidae，是一種藥用價值很高的昆蟲。其有平肝熄風、解熱鎮(zhèn)痙、祛瘀散結、撥毒消腫、通便瀉下、截瘧殺蟲之功效；主治小兒高熱驚厥、癲癇、中風等癥[1-3]。蟻獅作為傳統(tǒng)的藥用昆蟲，為全蟲入藥，但其有效部位尚不明確。前期試驗表明蟻獅醇提物具有較好的抗炎抑菌作用，經檢測醇提物中含有較多的黃酮類物質。

目前多見植物類黃酮的相關文獻報道[4-9]，鮮見昆蟲體內含有黃酮以及其提取技術的報道。超聲波機械熱振動的傳播過程中有助于有效成分的溶出和擴散，增加提取物的得率[10-11]，超聲波輔助提取法已廣泛應用于植物次生代謝物質的提取[12-14]。本實驗以蟻獅為研究對象，研究冷浸法[13]、傳統(tǒng)的索氏浸提法[14]、超聲波法[12]對蟻獅黃酮提取率的影響，并對最佳提取方法進行了正交優(yōu)化[15]提取條件的研究，以尋求一種快速、簡便、有效地提取方法，為今后昆蟲體內黃酮的研究奠定基礎。

一、材料

1.儀器

UV-1601型紫外一可見分光光度計 (北京瑞利分析儀器公司)；JAl003N電子天平(上海精密科學儀器有限公司)；SG2200HPT型超聲波洗滌機(上海冠特超聲儀器有限公司)。

2.藥品及試劑

蘆丁(生化試劑，上海晶純試劑有限公司)；乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉等化學試劑均為分析純(AR)。

蟻獅采自貴州省貴陽市森林公園，飼養(yǎng)至成蟲后，成蟲標本經中國農業(yè)大學王心麗教授鑒定為銹翅蟻蛉Myrmeleon ferrugineipennis Bao&Wang,2009。

二、方法

1.標準曲線的制備

以蘆丁為對照品，加入NaNO2，還原提取液中的黃酮類化合物，再加入Al（NO3）3，使黃酮類化合物與鋁離子絡合，形成穩(wěn)定的化合物，再加入Na0H使其顯色，在可見光區(qū)能獲得穩(wěn)定的特征吸收峰，故提取液中黃酮的含量與其吸光度有關。

（1）最大吸收波長的選擇

精確稱取5mg蘆丁標準品烘干至恒重，用60%的乙醇溶液溶解，定容至100mL，搖勻，得濃度為0.05mg/mL的標準液。

精確量取蘆丁標準液2mL，加5%NaNO20.3mL，搖勻，靜置6min，加10%Al（NO3）30.3mL，搖勻，靜置6min，加4%Na0H溶液4mL，用60%的乙醇溶液定容至10mL，搖勻，在400nm～600nm波長處掃描，結果在510nm處有最大吸收。

（2）標準曲線的繪制

精確量取蘆丁對照品溶液 0.0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0mL，分別置于10mL的比色管中，均用60%的乙醇溶液補充至5mL，各加5%NaN02溶液0.3mL，搖勻，放置6min；然后各加10%的Al(NO3)3溶液0.3mL，搖勻，放置6min；然后各加4%的NaOH溶液4mL搖勻，最后用60%的乙醇溶液補充到刻度，混勻，放置15min，以試劑空白為參比，在最大吸收波長510nm處測定吸光值。以吸光度值為縱坐標，濃度為橫坐標繪制標準曲線，得線性回歸方程 A=6.7733c+0.0034，R2=0.9995。

2.黃酮提取工藝及含量測定

精確稱取0.50g蟻獅鮮蟲置于研缽，反復凍融，研磨至蟲漿，放入磨口三角燒瓶中，加入乙醇溶液，超聲波輔助提取，過濾，石油醚脫色處理后，所得濾渣用70%乙醇溶液溶解并定容至50mL，作為待測液，按（2）項進行操作，測定黃酮含量。

3.單因素試驗

（1）不同溶劑的選擇

精確稱取2份0.50g蟻獅，以料液比為l︰20，超聲功率為50W，分別加入95%甲醇和95%乙醇提取30min。計算蟻獅黃酮提取率。

（2）不同提取方式的選擇

精確稱取0.50g蟻獅3份，以料液比為l︰20，加入95%乙醇，冷浸法靜置抽提6h，索氏提取法提取4h，超聲波提取30min，計算蟻獅黃酮提取率。

（3）乙醇體積分數的選擇

精確稱取0.50g蟻獅6份，以料液比為l︰20，超聲功率為50w，分別加入50%，60,%，70%，80%，90%，100%的乙醇提取30min。計算蟻獅黃酮提取率。

（4）液料比的選擇

精確稱取0.50g蟻獅6份，以95%的乙醇溶液分別以料液比為 l︰5，l︰10，l︰15，l︰20，l︰25，l︰30的量加入，超聲功率為50w，提取30min。計算不同料液比下蟻獅黃酮的提取率。

（5）提取時間的選擇

精確稱取0.50g蟻獅5份，以料液比為l︰20，超聲功率為50w，加入95%的乙醇溶液，在超聲時間分別為20min，40min，60min，80min，100min的條件下提取，計算不同提取時間下蟻獅黃酮的提取率。

4.正交試驗設計

在單因素試驗的基礎上，進行正交優(yōu)化設計，以料液比（A）、提取時間(B)、乙醇濃度(C)3個因素為考察指標，設計3因素3水平正交分析試驗，各試驗因素水平如表1所示。對獲得的優(yōu)化條件進行3次驗證試驗。

表1　銹翅蟻蛉幼蟲黃酮提取因素及水平

三、結果

1.單因素試驗結果

（1）不同溶劑對黃酮提取率的影響

圖1　不同溶劑對蟻獅黃酮提取率的影響

如圖1所示，乙醇的提取效果遠遠高于甲醇，且乙醇對人體的傷害小于甲醇，故提取蟻獅總黃酮時，乙醇為最佳提取溶媒。

（2）不同提取方式對黃酮提取率的影響

圖2　不同提取方式對蟻獅黃酮提取率的影響

由圖2所示，三種提取方式中以超聲波提取法黃酮得率最高，索氏提取法次之，冷浸法提取效果最差。冷浸法提取存在耗時長、提取不徹底等缺點；索氏提取法是通過熱回流提取黃酮，長時間保持在高溫狀態(tài)下，黃酮的活性可能會被破壞；而超聲波在提取溶媒中產生的‘空化效應’和機械作用可有效地破碎細胞壁，還可加速提取溶媒的分子運動，使得提取溶媒和黃酮類物質快速接觸而相互溶合，使得在短時間內有較高的提取率。

（3）乙醇濃度對黃酮提取率的影響

圖3　乙醇濃度對蟻獅黃酮提取率的影響

由圖3可知，當乙醇體積分數較低時，黃酮的提取率隨著乙醇濃度的增加而增加，在乙醇體積分數達到95%時，黃酮類物質溶出趨于飽和，而同時隨著乙醇體積分數的進一步升高，提取率反而有所下降。分析原因，可能是因為蟻獅體內含有水溶性的黃酮化合物，當溶劑中沒有水分時，這類黃酮物質不能被溶解，故表現為提取率下降。故提取蟻獅黃酮的最佳乙醇體積分數為95%。

（4）料液比對黃酮提取率的影響

圖4　料液比對蟻獅總黃酮提取率的影響

如圖4所示，隨著提取溶劑用量的增加，黃酮得率也隨之呈增長趨勢，當液料比達到l︰25（g/mL）時，提取率最高，此時若繼續(xù)增加溶劑的用量，黃酮得率反而呈緩慢下降趨勢，這可能是因為液料比達到l︰25（g/mL）時，黃酮類物質已基本溶出，繼續(xù)增加溶劑用量反而會促使其他雜質的溶出，使得黃酮得率下降?？紤]到節(jié)約成本和后續(xù)回收操作，確定液料比為l︰25（g/mL）為宜。

（5）提取時間對黃酮提取率的影響

圖5　提取時間對蟻獅總黃酮提取率的影響

由圖5可知，隨著超聲時間的增加，黃酮提取率先增后降，在40min處提取率達到最大值。超聲時間增長降低黃酮提取率的原因可能是溶解出的黃酮長時間處于超聲波環(huán)境中，受超聲波的影響而降解。故提取蟻獅黃酮的超聲時間為40min比較合適。

2.正交試驗結果

以料液比（A）、提取時間(B)、乙醇濃度(C)3個因素為考察因素進行正交試驗，結果見表2，表3。由直觀分析和方差分析可以看出，各因素對蟻獅黃酮得總率率的影響順序為C﹥A﹥B，因素C、因素A對蟻獅總黃酮提取有顯著影響（0.01＜P≤0.05），因素B對其影響不明顯。正交優(yōu)化工藝為A2B2C3，即料液比為1:15，提取時間為60min，乙醇濃度為90%。此工藝下進行3次驗證試驗，結果蟻獅黃酮的平均得率為2.13%，說明優(yōu)選的工藝穩(wěn)定可行。

表2　蟻獅黃酮提取正交實驗結果及極差分析

表3　蟻獅總黃酮提取正交實驗方差分析

四、討論

一般認為，黃酮類化合物廣泛存在植物體內，屬植物的次生代謝產物[16]。而在動物體內發(fā)現黃酮類化合物目前鮮有報道，本實驗測定出銹翅蟻蛉幼蟲體內含有大量的黃酮類化合物，含量1000mg/100g～2000mg/100g。

本實驗利用超聲波輔助提取對蟻獅黃酮的提取方法和工藝進行了單因素分析和正交試驗。正交試驗結果得出，影響黃酮提取效果的各因素主次順序為：乙醇濃度＞料液比＞提取時間，通過極差分析和方差分析，獲得了優(yōu)化的提取工藝為乙醇濃度90%，料液比1:15，提取時間60min。驗證試驗結果表明，優(yōu)選的工藝穩(wěn)定可行。

通過抗炎抑菌試驗，蟻獅黃酮類物質具有一定的抑菌、抗炎效果。蟻獅體內的黃酮類化合物的種類、結構、生物活性以及是否具有與目前報道的植物體內提取的黃酮相似的功能還需進一步深入研究。

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