四株飼用芽孢桿菌的分離鑒定及其16S-rRNA的序列分析

柴 俊， 朱 麗， 宋泉芝， 劉旭川， 張以芳， 許 琳， 普岳紅*

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)省畜產(chǎn)品加工工程技術(shù)研究中心，云南昆明650201；2云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南昆明650201）

芽孢桿菌（Bacillus），是一類能形成芽孢（內(nèi)生孢子）的桿菌或球菌，為好氧或兼性厭氧的細(xì)菌，革蘭氏染色呈陽性。當(dāng)外界環(huán)境發(fā)生改變時(shí)，菌體內(nèi)的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，經(jīng)過前孢子階段，最終形成一個(gè)芽孢，對(duì)外界不良環(huán)境有很好的抵抗作用（劉秀花，2005）。枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)等芽孢桿菌在生長(zhǎng)過程中會(huì)產(chǎn)生多種活性物質(zhì)，對(duì)致病菌或內(nèi)源性感染的條件致病菌有明顯的抑制作用，因其無毒、無害，被農(nóng)業(yè)部允許作為飼料的添加劑，經(jīng)常被制成微生物添加劑，用于改善動(dòng)物腸道功能、促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)和預(yù)防疾?。‵ouad 等，2017；龔福明等，2009；李佳，2009；李晶等，2008）。本試驗(yàn)對(duì)引進(jìn)的樣品進(jìn)行芽孢桿菌的分離鑒定，為微生物飼料添加劑的研究和利用提供科學(xué)基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料 飼料樣品及DH5α大腸桿菌為云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院動(dòng)物微生物實(shí)驗(yàn)室引進(jìn)保存。

1.2試劑 高保真Taq聚合酶、pMD18-T載體、DH5α感受態(tài)細(xì)胞和各種內(nèi)切酶均為TAKARA公司產(chǎn)品，細(xì)菌DNA基因組提取試劑盒、純化回收試劑盒、質(zhì)粒制備試劑盒均購(gòu)自Bioteke公司。1.3 分離培養(yǎng)及染色鏡檢觀察 樣品經(jīng)80℃高溫處理10～15 min。用無菌生理鹽水稀釋后傾注入芽孢富集培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h，然后在LB固體培養(yǎng)基上劃線分離培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)24 h后，挑取不同形態(tài)特征的單個(gè)菌落，進(jìn)行純培養(yǎng)及涂片染色鏡檢觀察。

1.4生化鑒定 按 《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》（第8版、第9版）中的方法對(duì)純培養(yǎng)細(xì)菌進(jìn)行生理生化鑒定（Holt等，1994；布坎南等，1986）。

1.516S-rRNA擴(kuò)增及測(cè)序 根據(jù)GenBank中芽孢桿菌的16S-rRNA的相關(guān)序列設(shè)計(jì)本研究的引物： 上游引物 PR：8-27 （5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’），下游引物 PF：1525-1541（5’-AAG GAG GTG ATC CAG CC-3’)，目的片段大小為1500bp左右。

細(xì)菌全DNA基因組的提?。喝》蛛x菌株的單個(gè)菌落在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至細(xì)菌對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，用BIOTEKE公司細(xì)菌DNA提取試劑盒按說明書步驟，提取細(xì)菌總DNA，提取的DNA產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)結(jié)果，并初步估計(jì)其DNA含量。

PCR體系與反應(yīng)條件：反應(yīng)體系為50 μL：DNA 模板 4 μL， 10×PCR Buffer 5.0 μL，Ex Taq（5 U/μL)0.5 μL，dNTP mixture 4.0 μL， 上下游引物（20 μM）各 1 μL，ddH2O 34.5 μL。 PCR 反應(yīng)程序：95 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，55 ℃1 min，72 ℃1.5 min，共30個(gè)循環(huán)；72℃10 min；4℃ 保存。PCR結(jié)束后，取5 μL PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，檢測(cè)結(jié)果。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化及克隆測(cè)序：參照BIOTEKE公司DNA純化試劑盒說明對(duì)PCR擴(kuò)增的16S-rRNA產(chǎn)物進(jìn)行純化回收。純化產(chǎn)物與pMD18-T載體連接構(gòu)建重組質(zhì)粒，將得到的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)氨芐抗性篩選、藍(lán)白斑篩選獲得陽性克隆，提取質(zhì)粒。對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切和PCR鑒定，并將鑒定結(jié)果正確的重組質(zhì)粒送TAKARA公司測(cè)序。

1.616S-rRNA同源性及系統(tǒng)發(fā)育樹分析 從GenBank中下載有關(guān)飼用微生物菌株及芽孢桿菌菌株的16S-rRNA代表序列作為參比序列。下載的序列信息見表1。利用DNAStar軟件對(duì)測(cè)得的序列及參比序列進(jìn)行同源性比較。并利用ClusterX和Mega5.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化親緣關(guān)系研究（Baindara等，2013；Leite等，2013）。

2　結(jié)果與分析

從樣品中分離到4株芽孢桿菌，分別命名為YB-1、YB-2、YB-3、YB-4， 經(jīng)表型特性及 16S-rRNA序列分析，YB-1為蘇云金芽孢桿菌、YB-2、4為枯草芽孢桿菌、YB-3為蠟樣芽胞桿菌。其特性結(jié)合描述如下：

表1　飼用微生物中芽孢桿菌代表菌株的參比序列

2.1菌落特征 細(xì)菌在普通瓊脂平板上，YB-1為白色圓形菌落，邊緣整齊，表面透亮，濕潤(rùn)，光滑，中央隆起，黏稠，直徑2～5 mm；YB-2為白色滴狀菌落，邊緣不整齊，中央微隆起，表面無光澤，干燥，直徑0.5～1 mm；YB-3為白色滴狀菌落，邊緣整齊，中央隆起，表面光滑濕潤(rùn)，清亮，黏稠，直徑1.5～2mm；YB-4為白色圓形菌落，邊緣不整齊，表面無光澤，干燥如毛玻璃樣，直徑0.5 mm。

2.2形態(tài)特性 挑取單個(gè)菌落涂片染色后光鏡下觀察，菌落為桿狀呈簇狀或散在存在的革蘭氏陽性細(xì)菌。在不利環(huán)境下，形成芽孢。

2.3生化鑒定結(jié)果 細(xì)菌的生化鑒定結(jié)果為：（1）4株分離菌的接觸酶、運(yùn)動(dòng)性、葡萄糖發(fā)酵、硝酸鹽還原、淀粉水解酶反應(yīng)都呈應(yīng)陽性；尿素水解酶、M.R試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、卵磷脂試驗(yàn)都呈陰性；（2）YB-2和YB-4分離菌的木糖、阿拉伯糖、甘露醇、V.P試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)都是陽性；YB-1分離菌的木糖、阿拉伯糖、甘露醇、V.P試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)都是陰性；YB-3分離菌的木糖、阿拉伯糖、甘露醇的試驗(yàn)為陰性，V.P試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)是陽性。生化試驗(yàn)結(jié)果見表2。

2.3細(xì)菌16S-rRNA PCR擴(kuò)增 4株菌株提取DNA，利用16S-rRNA引物PCR擴(kuò)增，得到約1.5kb大小的目的片段，結(jié)果見圖1。

2.4重組質(zhì)粒的PCR鑒定結(jié)果 將獲得的目的片段與pMD-18T載體連接，構(gòu)建的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞中培養(yǎng)提取質(zhì)粒，進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果見圖2。

2.5重組質(zhì)粒雙酶切鑒定結(jié)果 重組質(zhì)粒用Bam HI、HindⅢ 進(jìn)行雙酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳，可見酶切后產(chǎn)生兩條帶，大小與預(yù)期相符，結(jié)果見圖3。

表2　生化試驗(yàn)結(jié)果

圖1　四株芽孢桿菌的16S-rRNA基因擴(kuò)增電泳圖

圖2　重組質(zhì)粒及質(zhì)粒PCR擴(kuò)增電泳圖

圖3　重組質(zhì)粒雙酶切電泳圖

2.616S-rRNA序列同源性及系統(tǒng)發(fā)育樹分析結(jié)果 根據(jù) YB-1、YB-2、YB-3、YB-4 的 16S-rRNA的測(cè)序結(jié)果，進(jìn)行BLAST序列比對(duì)分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析。采用MEGA5軟件，分析4株分離菌與飼用微生物中芽孢桿菌的參比序列，繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹（見圖4）。4株分離菌與系統(tǒng)進(jìn)化樹遠(yuǎn)端的側(cè)孢芽孢桿菌的的同源性分別為88.35%、88.83%、89.68%和87.87%，表明分離菌與其遺傳距離較遠(yuǎn)。YB-2、YB-4與枯草芽孢桿菌類群的B.subtilis HE937219的同源性分別為99.91%和100%，均在99%以上，且處于同一分支上，表明YB-2、YB-4屬于枯草芽孢桿菌。YB-1與蘇云金芽孢桿菌類群的B.thuringiensis AM292315的同源性為99.17%，在99%以上，處于同一分支，表明YB-1屬于蘇云金芽孢桿菌。YB-3與蠟樣芽孢桿菌類群的B.cereus NC_016771同源性為100%，表明YB-3屬于蠟樣芽孢桿菌。

圖4　4個(gè)分離株16S-rRNA與5個(gè)參比序列構(gòu)建的進(jìn)化樹

3　討論

細(xì)菌芽孢對(duì)外界環(huán)境不利于菌體生長(zhǎng)的環(huán)境，如高溫、過酸等環(huán)境有較強(qiáng)的抵抗力。本試驗(yàn)在樣品處理初期就經(jīng)過80℃的高溫處理，除去了共生繁殖體的細(xì)菌，只有芽孢菌存活下來，使得試驗(yàn)在初期分離細(xì)菌的過程中簡(jiǎn)化了試驗(yàn)時(shí)間和步驟。

目前國(guó)內(nèi)外常用的飼用微生物種類主要有乳酸菌、芽孢桿菌、酵母菌、放線菌、光合細(xì)菌等幾大類（Fouad 等，2017；龔福明等，2009；李佳，2009；李晶等，2008）；其中芽孢桿菌主要有側(cè)孢芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、蠟樣芽胞桿菌、枯草芽孢桿菌等。本研究從引進(jìn)的飼料樣品中分離到的芽孢桿菌種類有枯草芽孢桿菌、蠟樣芽胞桿菌和蘇云金芽孢桿菌，都是常用于飼料中的芽孢桿菌，可為本地微生物飼料添加劑的進(jìn)一步發(fā)展提供研究基礎(chǔ)。

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