金匱腎氣丸對慶大霉素致聾豚鼠耳蝸GABAA受體表達(dá)的影響

蔣浩賢 盧宇涵 朱香茹 張夢茜 趙烏蘭# 丁麗鳳#

慶大霉素是最常見的氨基糖苷類抗生素，因具有耳毒性等毒副作用[1]，限制了其臨床使用。慶大霉素可對內(nèi)耳造成結(jié)構(gòu)損壞導(dǎo)致聽力損失、平衡障礙和耳鳴[2]。有學(xué)者認(rèn)為慶大霉素可激活體內(nèi)的氨基酸激酶，導(dǎo)致毛細(xì)胞凋亡，通過抑制氨基酸激酶的活化可減輕慶大霉素對毛細(xì)胞的損害[3]。

有研究表明耳蝸損毀后螺旋神經(jīng)節(jié)元GABA表達(dá)及其神經(jīng)元數(shù)量也呈明顯下降[4]，GABA是聽覺外周感受器耳蝸中重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，而GABAA受體是門控性離子通道型的一種，通過結(jié)合GABA介導(dǎo)神經(jīng)元抑制。GABAA受體主要有α、β和γ三種亞型，其中GABAARα1是表達(dá)量最高的亞型之一[5]，是GABAAR的重要功能基團(tuán)，其表達(dá)的下調(diào)與聽覺功能下降有密切的聯(lián)系[6]。

中醫(yī)有“腎主耳，在竅為耳”（《素問陰陽應(yīng)象大論》）的論證依據(jù)，并有采用中醫(yī)藥補(bǔ)腎助陽藥方，以緩解耳聾[7]?？紤]其有效成分和具體作用機(jī)制不明，本研究旨在通過觀察造模后慶大霉素對豚鼠聽力的損傷程度和中藥制劑金匱腎氣丸對該損傷的保護(hù)程度，采用免疫印跡法測定耳蝸內(nèi)GABAARα1在藥物損傷下和保護(hù)下的表達(dá)，探討補(bǔ)腎方對慶大霉素致耳蝸損傷的保護(hù)作用。

1　材料與方法

1.1　研究對象與分組

選取30只（60耳）體重330.0±20.0 g，雙側(cè)耳廓反射正常，無耳疾，體態(tài)、毛色、活動度正常的普通級DHP白毛紅目雌性豚鼠并隨機(jī)平均分成3組：正常對照組（CG組）采用2.5 ml.kg-1.d-1生理鹽水注射；模型組（GM組）采用硫酸慶大霉素注射液100 mg.kg-1.d-1；治療組（TG組）采用硫酸慶大霉素注射液100 mg.kg-1.d-1+補(bǔ)腎方灌胃13.5 g.kg-1.d-1。連續(xù)造模12天。

本研究所有實(shí)驗(yàn)均在浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)動物由該中心提供及常規(guī)飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)操作均由該中心協(xié)助，不涉及動物倫理、福利等問題。

1.2　補(bǔ)腎方與試劑

補(bǔ)腎方：即金匱腎氣丸復(fù)方，摘自《金匱要略》擬方：熟地黃30 g、山藥20 g、山茱萸15 g、牡丹皮10 g、茯苓10 g、澤瀉10 g、桂枝5 g、制附子5 g，生藥含量1 g/ml。硫酸慶大霉素注射液：8萬單位／2 ml/每支，購自辰欣藥業(yè)股份有限公司（批號1608102231）；戊巴比妥鈉由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供；GABA receptor alpha 1兔多克隆抗體購自Abcam公司（貨號：ab33299）。

1.3　方法

1.3.1DPOAE測試 采用美國智聽Smart OAE耳聲發(fā)射儀器，所有測試均在隔聲室進(jìn)行。豚鼠麻醉，保持自主呼吸，維持動物體溫，將探頭輕柔地放置外耳道。f2/f1=1.22，L1=65 dB SPL，L2=55 dB SPL，并對不同組別在2、3、4、6和8 kHz處的DPOAE振幅進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.3.2ABR閾值測試 采用美國GSI Audera聽覺誘發(fā)電位儀，豚鼠行1%戊巴比妥鈉30 mg.kg-1腹腔注射麻醉后，俯臥于保溫毯上。兩耳廓前沿連線中點(diǎn)顱頂為記錄電極入針點(diǎn)，參考電極插入外耳廓后軟組織內(nèi)，地極插入鼻尖處，在標(biāo)準(zhǔn)屏蔽隔聲室內(nèi)用短聲（click）刺激，刺激速率11.1 次/秒，開窗時程20 ms，帶通濾波為100～3000 Hz，信號疊加512次。起始聲刺激為90 dB nHL引出后逐步降低強(qiáng)度10 dB直至無法引出可以重復(fù)的ABR波形，重復(fù)后仍未引出后以強(qiáng)度5 dB提高刺激強(qiáng)度，以引出波Ⅱ或波Ⅲ的最小刺激強(qiáng)度記為ABR閾值。ABR測試行畢后立即斷頭取耳蝸。

1.3.3免疫印記檢測 采用總蛋白提取試劑盒（含protease inhibitor cocktail）進(jìn)行總蛋白的提取，采用BCA定量試劑盒進(jìn)行總蛋白定量。配膠后每個孔60 ug總蛋白進(jìn)行上樣，每孔10～15 ul，電泳2 h左右。聚偏二氟乙烯（polyvinylidene flouride，PVDF）膜甲醇中浸泡20 s，然后轉(zhuǎn)移到Tris-Glycine轉(zhuǎn)移緩沖液（含5%甲醇）中平衡5 min；SDS-PAGE凝膠在Tris-Glycine轉(zhuǎn)移緩沖液平衡30 min；在冷卻全濕轉(zhuǎn)膜2 h。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，放到T-TBS(5%脫脂奶粉)，室溫封閉1 h，然后T-TBS漂洗5 min×3。一抗以一定比例溶于T-TBS（含3%脫脂奶粉），4℃孵育過夜；然后T-TBS漂洗5 min×4。二抗以一定比例溶于T-TBS（含2%脫脂奶粉），室溫1 h；然后T-TBS漂洗5 min×5。采用SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate制備約1 ml ECL工作液，室溫孵育轉(zhuǎn)印膜1 min，去除多余ECL試劑，保鮮膜密封，暗盒中放上X-ray film曝光5～10 min后進(jìn)行顯影和定影。采用Image J軟件分析條帶的光密度值，每個條帶重復(fù)3次，目的蛋白相對表達(dá)量=[目的蛋白（光密度值）/內(nèi)參（光密度值）]×10 n。

1.4　統(tǒng)計方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 23.0軟件統(tǒng)計分析，計數(shù)統(tǒng)計采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)用于檢驗(yàn)不同組別間ABR閾值和DPOAE振幅的差異。以P＜0.05表示組間差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義，以P＜0.01表示組間差異具有極顯著統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1　ABR閾值的比較

本研究豚鼠造模后，模型組（GM）和治療組（TG組）的ABR閾值均較正常對照組（CG組）升高，并具有極顯著統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.01）；TG組的ABR閾值顯著低于GM組（P＜0.05），見表1。

表1　各組豚鼠ABR閾值比較（±s ）

表1　各組豚鼠ABR閾值比較（±s ）

組

2.2　DPOAE幅值的比較

本研究豚鼠造模后，GM組和TG組的DPOAE幅值在不同頻率（2、3、4、6、8 kHz）均較CG組低（見表2），且GM組與CG組的DPOAE幅值在各頻率點(diǎn)均具有極顯著統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.01）；而TG組和GM組的DPOAE振幅在4 k和8 kHz處具有顯著統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05），見圖1。

表2　各組豚鼠DPOAE幅值比較（±s ）

表2　各組豚鼠DPOAE幅值比較（±s ）

組別 　耳數(shù)（n）　　　 DPOAE振幅（dB SPL）2 kHz　3 kHz　4 kHz　 6 kHz　 8 kHz CG 　14 　9.9±3.2 15.4±8.7 12.6±4.9 　13.4±9.0 　32.6±11.0 GM 　12 -5.1±2.9 -3.7±9.3 -12.4±4.6 -1.1±5.0 -13.6±5.2 TG 　11 -1.3±2.1 3.8±2.2 -2.5±5.1 2.0±1.4　 3.8±2.6

圖1　各組豚鼠DPOAE在不同頻率處的振幅比較

2.3　耳蝸GABAARα1相對表達(dá)量的比較

采用Western blot分析各組豚鼠耳蝸GABAARα1蛋白表達(dá)量并行組間比較。GM組的GABAARα1蛋白表達(dá)量較CG組低并具有極顯著統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.01)；TG組的GABAARα1蛋白表達(dá)量較GM組高并具有顯著統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05)，但較CG組低（P＞0.05），見圖2。

圖2　GABAARα1在各組耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)中表達(dá)值

3　討論

慶大霉素是最常見的氨基糖苷類抗生素，可進(jìn)入內(nèi)耳淋巴液，通過在內(nèi)耳外淋巴液中蓄積并通過干擾內(nèi)耳Corti器內(nèi)外毛細(xì)胞的糖代謝和能量利用，導(dǎo)致內(nèi)耳毛細(xì)胞膜上鈉、鉀離子泵功能障礙和耳蝸的毛細(xì)胞廣泛損傷，表現(xiàn)為藥物中毒性聽力損失[8]。慶大霉素還具有腎毒性，并且腎毒性早于耳毒性[9]。目前，藥物中毒性聽力損失仍以預(yù)防為主，雖然耳聾基因篩查對敏感性個體的耳毒性藥物應(yīng)用有重要指導(dǎo)意義[10，11]，但臨床診療中因應(yīng)用氨基糖苷類抗生素致聾的病例時有發(fā)生[12]。臨床中對耳毒性藥物導(dǎo)致的感音神經(jīng)性聽力損失，現(xiàn)有的治療手段卻很有限[15]，而中醫(yī)藥的補(bǔ)腎方在聽力保護(hù)和治療中已有應(yīng)用，并取得一定成效[7，14，15]。

現(xiàn)代中醫(yī)研究[7，14～16]認(rèn)為，慶大霉素造成的藥物性聾屬腎虛耳聾范疇，金匱腎氣丸源自中醫(yī)經(jīng)典書籍，醫(yī)圣張仲景所著《金匱要略》，為中醫(yī)傳統(tǒng)的補(bǔ)腎方藥。金貴腎氣丸通過組方配伍達(dá)到溫補(bǔ)腎陽化氣行水的功效，糾正慶大霉素的腎毒性，以拮抗慶大霉素的損傷[16]。

本研究中，GM組豚鼠ABR閾值升高，且DPOAE各個頻率點(diǎn)均未引出。TG豚鼠在ABR測試中其聽力閾值與GM組，組間存在顯著統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05)，但仍差于正常對照組。說明金貴腎氣丸治療組確有一定的拮抗慶大霉素毒性作用與前期研究一致[16]。

GABA作為耳蝸聽覺傳導(dǎo)通路中重要的神經(jīng)遞質(zhì)，與多項聽覺功能相關(guān)[5，6]。有研究證實(shí)耳蝸核GABA含量降低可能與耳聾的發(fā)病具有一定的相關(guān)性[4，17]。本實(shí)驗(yàn)中TG組豚鼠耳蝸GABAARα1表達(dá)盡管低于正常對照組（P＞0.05），但顯著高于GM組（P＜0.05）。慶大霉素造模后，其表達(dá)下降提示聽覺功能的下降；而在金匱腎氣丸湯劑的拮抗下，上調(diào)蛋白的表達(dá)以此保護(hù)了聽覺功能，該結(jié)果與ABR反應(yīng)閾值結(jié)果一致。

綜上所述，本研究對慶大霉素致藥物性聽力損失的臨床治療有一定參考價值，但仍有不足之處。比如采用click聲刺激的ABR無法準(zhǔn)確的描述慶大霉素對豚鼠在各頻率段尤其是高頻的損傷，無法與DPOAE結(jié)果做相互驗(yàn)證；同時未在實(shí)驗(yàn)前測試豚鼠聽覺功能，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)前后的閾移結(jié)果無法得到。此外金匱腎氣丸湯劑對慶大霉素引起的聽力損失的保護(hù)作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

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