香菇多糖抗氧化性與抑菌特性的研究

湯 強(qiáng)，楊靖東，方 玲，胡 雯

（蕪湖職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物學(xué)院，安徽蕪湖241003）

香菇多糖抗氧化性與抑菌特性的研究

湯 強(qiáng)，楊靖東，方 玲，胡 雯

（蕪湖職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物學(xué)院，安徽蕪湖241003）

本研究主要從清除超氧陰離子自由基功能、清除羥自由基功能及抗DPPH自由基能力測(cè)試來評(píng)價(jià)香菇胞外多糖抗氧化功能。在濃度為0.30mg·m L-1條件下，香菇胞外多糖對(duì)羥自由基、DDPH自由基的清除率分別為76.23%和62.58%，而如果濃度為0.25mg·m L-1，香菇胞外多糖能將68.12%的超氧陰離子自由基清除。實(shí)驗(yàn)結(jié)論最終表明，其抗氧化能力比較突出。此外，對(duì)香菇胞外多糖的抑菌活性及其抑菌穩(wěn)定性進(jìn)行了研究。結(jié)果證實(shí)：酸堿度值如果處在5-9之間，香菇胞外多糖則全面存在著抑菌活性，其中最強(qiáng)抑菌活性發(fā)生在酸堿度值pH=6時(shí)。結(jié)果證實(shí)，該菌株的酸堿抑菌譜比較廣。而且這種香菇胞外多糖的熱穩(wěn)定性能較好，121℃條件下30m in處理，抑菌活性依然不會(huì)受到明顯影響。香菇胞外多糖的生化特征良好，有效奠定了其未來的發(fā)展與應(yīng)用基礎(chǔ)。

香菇；抗氧化；抑菌活性

食用菌是一種大型真菌，這種真菌具有豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，是世界各國(guó)各地區(qū)公認(rèn)的“植物蛋白頂峰”[1-2]。中國(guó)具有悠久的“食用菌”研究史。東漢末年，《神農(nóng)本草經(jīng)》集結(jié)整理成書，享有全球首部“藥物專著”之稱的這本書，對(duì)食用真菌（豬苓、茯苓、靈芝等）所具有的藥用功能進(jìn)行了全面記述；李時(shí)珍是明代的著名醫(yī)學(xué)家，其撰寫的《本草綱目》享譽(yù)國(guó)內(nèi)外，而關(guān)于真菌藥效，此書的記述也超過了二十種[2]。既有研究結(jié)論證實(shí)，分屬51科70多個(gè)屬的三百多種食用菌能夠有效抑制約80%的癌細(xì)胞，比如艾氏癌、肉瘤等[3]。

有學(xué)者指出，機(jī)體衰老的基本標(biāo)志之一是自由基增多，細(xì)胞膜、其他組織結(jié)構(gòu)均能被自由基所破壞[4]。而機(jī)體抗氧化、抗衰老等能力的強(qiáng)弱主要取決于清除自由基的能力[5-6]。因此，人們對(duì)于抗氧化劑具有十分迫切的需求。由于人工合成的抗氧化劑成本較高，毒副作用也較大，因而當(dāng)務(wù)之急就是尋找天然產(chǎn)物抗氧化劑。

近年來，眾多學(xué)者均深入研究了植物多糖在抑制多種細(xì)菌方面具有的基本功能[7]，但卻鮮有學(xué)者關(guān)注并探索香菇多糖的抑菌功能。本試驗(yàn)對(duì)香菇多糖的抑菌效果進(jìn)行研究，意在進(jìn)行天然食品防腐劑分析、研究及設(shè)計(jì)開發(fā)，為深入拓展香菇多糖的主體功能提供相應(yīng)的理論參照。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)指示菌

1.1.2 主要試劑

試劑（氫氧化鈉、瓊脂粉、氯化鈉、丙酮、無水乙醇及牛肉膏等）均為國(guó)產(chǎn)分析純。

表1 供試指示菌Tab.1 The tested strains

1.1.3 濾紙片制備

用直徑為6mm的打孔器將吸水性強(qiáng)濾紙打成若干圓形片，分裝后置于培養(yǎng)皿12l～124℃高壓蒸汽滅菌20min，烘干后備用。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 胞外多糖的制備[8]

配置五個(gè)濃度梯度的香菇多糖樣品液。將Vc 1mg、1.5mg、2mg、2.5mg和3mg分別稱取出來，在甲醇（10 ml）內(nèi)溶解，以此將 0.30mg.m l-1、0.25mg.ml-1、0.20mg.m l-1、0.15mg.ml-1及 0.10mg.mL-1濃度的樣品液分別制取成功。

1.2.2 香菇胞外多糖對(duì)DPPH清除作用

香菇胞外多糖對(duì)DPPH清除實(shí)驗(yàn)參照陳宏偉[9]的方法。

該多糖的自由基清除率以下式為依據(jù)計(jì)算，即：

自由基清除率=［1-(A p-A c)∕A max］×100%

1.2.3 香菇胞外多糖對(duì)羥自由基清除作用

在測(cè)定香菇多糖清除羥基自由基過程中，可以參照以下方法。

依據(jù)下式計(jì)算清除率，即：

清除率(%)=[A0-(AX-AX0)]∕A0×100

其中：多糖（無顯色劑）的本底吸收值為AX0；

待測(cè)溶液加入之后吸光度為AX；

空白對(duì)照液（不加糖液）吸光度為A0。

1.2.4 香菇胞外多糖對(duì)超氧陰離子自由基清除作用

參照潘丹丹[10]的方法。

依據(jù)下式計(jì)算清除率，即：

清除率S(%)=(F空-F樣)∕F空×100

其中，吸光度隨時(shí)間（被測(cè)液）的變化率為F樣，吸光度隨時(shí)間（空白溶液）的變化率為F空。

1.2.5 香菇多糖對(duì)8種菌的抑制作用

參照孟俊龍等[11]方法，利用測(cè)量抑菌圈直徑的途徑，完成對(duì)香菇多糖抑制8種菌的實(shí)際效果對(duì)比。

1.2.6 香菇多糖對(duì)6種常見病原菌的體外最小抑菌濃度

基于前述提及的最理想環(huán)境及2倍稀釋法，把香菇多糖液的質(zhì)量濃度分別進(jìn)行每毫升0.625mg、1.25mg、2.5mg、5.0mg、10mg這5種梯度稀釋，實(shí)驗(yàn)流程同上。

1.2.7 不同pH條件下香菇多糖對(duì)6種指示菌的抑制作用

以前文提及的最適當(dāng)條件為基礎(chǔ)，采用氫氧化鈉（1mol·l-1）、鹽酸（1mol·l-1）將香菇多糖液酸堿度調(diào)節(jié)成5個(gè)梯度（即5-9），其實(shí)驗(yàn)過程等同于前文分析的相關(guān)實(shí)驗(yàn)步驟。

1.2.8 不同溫度對(duì)香菇多糖的影響

三角瓶（50ml）內(nèi)加入質(zhì)量濃度為10mg·ml-1總計(jì)10m l的香菇多糖，且于30℃、60℃、80℃、100℃以及121℃等環(huán)境中將樣品分別加熱，并在恒溫環(huán)境分別進(jìn)行30min處理，采用抑菌圈法測(cè)定對(duì)6種指示菌的抑菌效果。試驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 清除DPPH自由基能力

實(shí)驗(yàn)結(jié)果（如表2和表3）說明香菇多糖的DPPH清除率與質(zhì)量濃度呈正相關(guān)。質(zhì)量濃度為0.10mg·m l-1時(shí)，DPPH自由基清除率為10.52%，但濃度為0.30mg·m l-1時(shí)，香菇胞外多糖自由基清除率62.58%，抗氧化能力比較理想。但是，0.30mg·ml-1（最高濃度）時(shí)，Vc自由基清除率為89.14%；由表3可以看出，Vc的IC50值僅為0.2158mg·m l-1，遠(yuǎn)小于香菇胞外多糖的2.2165mg·ml-1，這證實(shí)：和香菇胞外多糖抑制率相比，Vc可能更有效的抑制DPPH自由基。

2.2 對(duì)羥自由基清除作用

實(shí)驗(yàn)結(jié)果與DPPH法存在差異（表4），當(dāng)濃度達(dá)到0.30mg·mL-1時(shí)對(duì)羥自由基抑制率達(dá)到76.23%，其他濃度情況下抑制率均小于50%，并且在0.10～0.30mg·m l-1濃度下，香菇胞外多糖對(duì)羥自由基的抑制率均大于Vc的抑制率。由表5可以看出，香菇胞外多糖的IC50值僅為0.9245mg·m l-1，遠(yuǎn)小于Vc的1.3597mg·ml-1，同樣證實(shí)，和Vc抑制率相比，香菇胞外多糖可以更有效的抑制羥自由基。至此，香菇胞外多糖可以更好地抑制羥自由基得到證實(shí)。

表4 香菇胞外多糖對(duì)羥自由基清除作用

表5 對(duì)羥自由基清除作用IC50值

2.3 對(duì)超氧陰離子自由基清除作用

O2-(超氧自由基)同樣可以受到香菇胞外多糖某種程度的抑制（如表6、表7所示）。當(dāng)濃度從0.10～0.25mg·m l-1濃度下，香菇胞外多糖對(duì)羥自由基的抑制率隨著濃度不斷增加，0.25mg·ml-1達(dá)到峰值，當(dāng)濃度繼續(xù)增加到0.30mg·ml-1抑制率有下降的趨勢(shì)。對(duì)照組Vc濃度與超氧自由基清除率呈正比。

2.4 抑菌圈直徑的測(cè)量

在前文提及的8種指示菌中，香菇胞外多糖可以抑制其中的6種，且其對(duì)于指示菌（如黃色葡萄球菌、雞白痢沙門氏菌、大腸桿菌等）的抑制作用更明顯，這種抑制作用最突出的表現(xiàn)在其對(duì)大腸桿菌的抑菌活性，其抑菌直徑最高可至12.16mm。對(duì)2種真菌類（黑曲霉與青霉）指示菌來說，則沒有抑菌作用，所以，菌株Le10胞外多糖的抑菌譜極其廣泛（如表8所示）。

2.5 香菇多糖的最小抑制濃度(MIC)

由表9可知，其抑菌效果隨著濃度上升，呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)。結(jié)果表明，香菇多糖對(duì)釀酒酵母具有最大的抑制濃度，其值為5.0mg.m l-1；對(duì)于大腸桿菌抑菌濃度則只有1.25mg.ml-1，處于最低值。說明香菇多糖對(duì)大腸桿菌抑菌作用最強(qiáng)。

2.6 不同pH香菇多糖對(duì)6種指示菌抑菌率的影響

對(duì)于6種菌來說，香菇多糖的酸堿度不同，其抑制作用也有所區(qū)別（如圖1所示）。當(dāng)酸堿度值處于5～9之間時(shí)，具有極為穩(wěn)定的抑菌作用；如果酸堿度值是6，香菇多糖具有最大的抑菌活性，尤其會(huì)對(duì)大腸桿菌來說，其會(huì)表現(xiàn)出最高的抑菌活性，能形成高達(dá)12.16mm的抑菌直徑。不過，伴隨酸堿度不斷提升，香菇多糖的抑菌作用并非持續(xù)增大，而是“不升反降”。

注:“-”表示無抑菌效果

表9 香菇胞外多糖的最小抑菌濃度

圖1 不同pH香菇多糖對(duì)6種指示劑抑菌作用的影響

2.7 對(duì)溫度的穩(wěn)定性

對(duì)受試菌來說，香菇提取物具有良好的抑菌效果。因此，本實(shí)驗(yàn)對(duì)各種加熱溫度條件下香菇多糖的抑菌效果進(jìn)行了測(cè)定。如表10所示即為香菇胞外多糖抑菌圈直徑（對(duì)6種指示劑）。在總計(jì)5種溫度梯度（30～121℃）環(huán)境中處理后獲得的結(jié)果證實(shí)，香菇胞外多糖不會(huì)明顯影響到指示菌（5種）的抑菌活性，溫度提升時(shí)，會(huì)略微降低抑菌活性，但是，抑菌活性依然比較突出，即使在121℃這樣的高溫環(huán)境中處理，其抑菌的活性依然比較高，也就是說，沒有明顯改變其抑菌活性，來自香菇胞外多糖的抑菌物質(zhì)，其熱穩(wěn)定性較強(qiáng)由此得到證實(shí)。不過，高溫環(huán)境會(huì)明顯影響到釀酒酵母抑菌活性，如果溫度為100℃以上，則沒有抑菌活性。

表10 不同溫度下的抑菌圈直徑

3 討論

近年來關(guān)于自由基清除劑的研究非常熱門[12]。分析證實(shí)：基于清除作用，自由基清除劑可以在將活潑自由基（生物體內(nèi)）的中間體濃度降低的同時(shí)，將自由基連鎖反應(yīng)的擴(kuò)展效率降低，以此對(duì)自由基產(chǎn)生進(jìn)行抑制[13-16]。香菇的有效活性成分之一香菇多糖，是一種宿主免疫增強(qiáng)劑，相關(guān)研究顯示，香菇多糖具有調(diào)節(jié)免疫功能、抗腫瘤、抗氧化和抗病毒等作用［17］，故本實(shí)驗(yàn)以香菇胞外多糖的活性之一抗氧化為目標(biāo)開展了研究，結(jié)果表明：香菇胞外多糖對(duì)DDPH自由基清除率最高達(dá)到62.58%，對(duì)羥自由基的清除率最高達(dá)到76.23%，對(duì)超氧陰離子自由基的清除率最高達(dá)到68.12%，研究結(jié)論為香菇胞外多糖具備較強(qiáng)的抗氧化能力。本研究就香菇胞外多糖的抑菌活性及其抑菌穩(wěn)定性也進(jìn)行了相關(guān)實(shí)驗(yàn)，當(dāng)酸堿度值pH為5-9時(shí)，香菇胞外多糖均具有抑菌能力，pH為6時(shí)活性最強(qiáng)；并且香菇胞外多糖熱穩(wěn)定性較強(qiáng)，121℃環(huán)境中進(jìn)行30 min處理之后，其抑菌活性依然比較理想。分析表明，香菇胞外多糖具有良好的生化特征，未來的發(fā)展與應(yīng)用空間廣闊。

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Study on Antioxidative and Antimicrobial Activities of Lentinan

TANGQiang,YANG Jingdong,FANG Ling,HUWen
(Wuhu vocational and technical college of biology,Wuhu 241003,China)

Inspected the capability of antioxidation from L. edodes of exopolysaccharide though three kinds ofmethods were applied including DPPH and the ability of scavenging hydroxyl radical, Superoxide radical scavenging activity. The results showed that L. edodes of exopolysaccharide had relatively better antioxidant capacity.Then studied the antibacterial activity of L. edodes of exopolysaccharide and its stability. The results show mushroom exopolysaccharide conditions at pH 5～9, have antibacterial activity, which is 6 in pH strongest antibacterialactivity, indicating that the strain has a wide antibacterial spectrum of pH. Meanwhile, the mushroom exopolysaccharidehas good thermal stability, even at 121℃ for 30min still has good antibacterial activity; in order to providereference basis for the further applications of exopolysaccharide from L. edodes.

lentinula edobes;antioxidant;antibacterial activity

王彥永）

TS201.4

A

1673-2928（2018）02-0102-05

D01:10.19329/j.cnki.1673-2928.2018.02.029

2018-01-03

安徽省高校自然科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目（KJ2016A761）；蕪湖職業(yè)技術(shù)學(xué)院教授工程項(xiàng)目（jsgc201610）；安徽省高校自然科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目（KJ2017A556）；安徽省質(zhì)量工程-藥品生產(chǎn)技術(shù)專業(yè)卓越技能型人才教育培養(yǎng)計(jì)劃（2016zjjh073）；安徽省高校優(yōu)秀青年人才支持計(jì)劃項(xiàng)目（2014年）。

湯強(qiáng)（1981－），男，安徽蕪湖人，博士，副教授，研究方向:微生物學(xué)及分子生物學(xué)。