miR-25在乳腺癌組織、細胞的表達及對細胞增殖的影響

董超，黃遠麗，徐正豐

(華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬荊州醫(yī)院，湖北荊州434020)

乳腺癌近年來發(fā)病率逐年上升，且呈年輕化趨勢[1]。研究顯示，微小RNA(miRNA)廣泛參與細胞的各種生理病理過程，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[2，3]。miRNA在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中起重要作用[4～6]。miR-25是近年來發(fā)現(xiàn)的腫瘤相關(guān)miRNA

分子之一，位于人第7號染色體長臂(7q22.1)上的MCM7基因內(nèi)含子上，在多種腫瘤中表達上調(diào)，在腫瘤發(fā)生過程中起重要調(diào)控作用[7]。但目前有關(guān)miR-25在乳腺癌中的表達及作用機制尚不完全清楚。2017年3～4月，我們采用qRT-PCR法檢測乳腺癌組織和細胞系中miR-25表達，并探討miR-25對乳腺癌細胞增殖的影響。

1　材料與方法

1.1材料收集2014年1月～2015年1月本院手術(shù)切除的乳腺癌組織89例及相應距腫瘤邊緣5 cm以上的癌旁組織，組織離體30 min內(nèi)液氮速凍，-80 ℃保存?；颊咝g(shù)前均未接受放化療、免疫治療等抗腫瘤治療，均為女性,年齡28～75歲，平均46.9歲，均經(jīng)術(shù)后病理檢查確診。組織學分級：Ⅰ級15例、Ⅱ+Ⅲ級74例；TNM分期：Ⅰ+Ⅱ期61例、Ⅲ+Ⅳ期28例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移52例。本實驗經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準，患者均知情同意并簽署知情同意書。RMPI1640培養(yǎng)基購自美國Corning公司，TRIzol試劑購自北京達科為生物技術(shù)公司，miR-25及內(nèi)參U6引物由廣州銳博生物公司構(gòu)建和提供，RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、qRT-PCR試劑盒購自美國Bio-Rad公司，LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司，miR-25inhibitor及陰性對照inhibitor-NC購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司，CCK-8試劑盒購自上海碧云天生物公司。人乳腺癌細胞系SK-BR-3、MCF-7、MDA-MB-231和人乳腺上皮細胞系HBL-100均購自美國典藏細胞庫(ATCC)，培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RMPI1640培養(yǎng)基中，置入37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中。

1.2乳腺癌組織和細胞中miR-25表達檢測按照TRIzol試劑盒說明書提取組織或細胞總RNA，核酸蛋白測定儀檢測OD260nm/OD280nm在1.7～2.0，符合實驗要求，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。miR-25引物序列：正向引物：5′-ATCCAGTGCGTGTCGTG-3′，反向引物：5′-TGCTCATTGCACTTGTCTC-3′。以cDNA為模板，配置qRT-PCR反應體系，反應條件：94 ℃ 2 min，94 ℃ 20 s，60 ℃ 30 s，共40個循環(huán)。以U6作為內(nèi)參基因，miR-25表達量數(shù)值采用2-ΔΔCt法計算。收集乳腺癌患者的臨床病理特征，包括年齡、TNM分期、腫瘤最大直徑、組織學分級、ER狀態(tài)、PR狀態(tài)、C-erbB-2狀態(tài)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等。每項臨床病理特征分為兩個亞組，比較兩個亞組患者乳腺癌組織中miR-25的相對表達情況。

1.3miR-25 inhibitor轉(zhuǎn)染乳腺癌細胞將對數(shù)生長期的乳腺癌細胞系SK-BR-3接種于細胞培養(yǎng)板中，嚴格按照LipofectamineTM2000說明書操作，分別將miR-25 inhibitor和inhibitor-NC轉(zhuǎn)染至SK-BR-3細胞，轉(zhuǎn)染后的SK-BR-3細胞分別為miR-25 inhibitor組和inhibitor-NC組，轉(zhuǎn)染后48 h收集細胞進行后續(xù)實驗。

1.4乳腺癌細胞增殖能力檢測采用CCK-8法。將轉(zhuǎn)染48 h后的各組細胞按3 000/孔的密度分別種于96孔板上，每孔設3個復孔，每24 h加入CCK-8反應液孵育30 min，后在490 nm處測定各孔的光密度(OD)，連續(xù)測定3 d，繪制細胞增殖曲線。

2　 結(jié)果

2.1miR-25在乳腺癌組織和細胞系中的表達比較miR-25在乳腺癌組織和癌旁組織中的表達分別為5.47±0.54、1.03±0.05，miR-25在乳腺癌組織中的表達高于癌旁組織(P<0.01)；miR-25在乳腺癌細胞系SK-BR-3、MCF-7、MDA-MB-231和人乳腺上皮細胞系HBL-100中的表達分別為7.48±0.81、4.47±0.48、4.99±0.51、1.02±0.04，miR-25在各乳腺癌細胞系中的表達高于正常乳腺上皮細胞系(P均<0.01)。其中miR-25在SK-BR-3中表達水平最高，因此選擇SK-BR-3作為后續(xù)細胞學實驗的研究對象。

2.2miR-25表達與乳腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系miR-25表達與乳腺癌患者TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)﹙P均<0.01﹚，而與年齡、腫瘤最大直徑、ER、PR、C-erbB-2及組織學分級等無關(guān)(P均>0.05)。見表1。

2.3miR-25 inhibitor組和inhibitor-NC組細胞中miR-25表達比較miR-25 inhibitor組和inhibitor-NC組細胞中miR-25的相對表達量分別為0.38±0.11、1.01±0.03，兩組比較，P<0.01。

表1　miR-25表達與患者臨床病理特征的關(guān)系

2.4miR-25 inhibitor組與inhibitor-NC組乳腺癌細胞增殖能力比較CCK-8實驗結(jié)果顯示，miR-25 inhibitor組SK-BR-3細胞的增殖速度較inhibitor-NC組細胞下調(diào)(P<0.05)。miR-25 inhibitor組24、48、72、96 h時OD值分別為0.46±0.03、0.56±0.12、1.10±0.10、1.72±0.16；inhibitor-NC組24、48、72、96 h時OD值分別為0.45±0.04、0.95±0.13、1.81±0.12、3.40±0.10，miR-25 inhibitor組48、72、96 h時OD值低于inhibitor-NC組(P均<0.05)。

3　討論

miRNA是一類約22個核苷酸長度的小分子非編碼RNA，通過與靶基因mRNA的3′端非編碼區(qū)結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄水平上通過降解mRNA或抑制翻譯，調(diào)控人類約1/3基因表達，在細胞增殖、代謝、分化等過程中起重要作用[8]。隨著目前對miRNA研究不斷深入，miRNAs已被證實發(fā)揮癌基因或抑癌基因的作用，參與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展[9]，其表達失衡與多種惡性腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。

miR-25屬于miR-106b家族成員之一，是近年來發(fā)現(xiàn)的腫瘤相關(guān)miRNA分子。miR-106b家族編碼三種成熟miRNA(miR-106b、miR-25、miR-93)。miR-106b和miR-93具有相似的種子序列，而miR-25與兩者的序列不一致。已有研究表明，miR-25在多種腫瘤中表達異常，且參與腫瘤的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移[10]。Xiang等[11]研究發(fā)現(xiàn)，miR-25在非小細胞肺癌中表達上調(diào)，且通過靶向調(diào)控FBXW7表達促進腫瘤細胞增殖和轉(zhuǎn)移；Chen 等[12]發(fā)現(xiàn)miR-25能靶向調(diào)控RGS3表達，抑制非小細胞肺癌細胞凋亡；Peng等[13]發(fā)現(xiàn)miR-25靶向調(diào)控NEFL基因促進膠質(zhì)瘤的增殖和轉(zhuǎn)移。本研究中我們發(fā)現(xiàn)，miR-25在乳腺癌組織中的表達高于癌旁組織，同時miR-25在乳腺癌細胞中的表達高于正常乳腺上皮細胞，差異均有統(tǒng)計學意義，提示miR-25在乳腺癌中具有癌基因功能，且進一步統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，miR-25與乳腺癌患者的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，miR-25可促進乳腺癌的進展。

miR-25作為癌基因參與惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展過程是一個復雜的調(diào)控網(wǎng)絡，其分子機制主要包括促進腫瘤增殖、侵襲與轉(zhuǎn)移，抑制腫瘤凋亡、調(diào)控細胞周期等[10]。田川等[14]報道m(xù)iR-25通過調(diào)控Klf4促進肝癌細胞的增殖。本研究中我們通過miR-25 inhibitor成功抑制了乳腺癌細胞中miR-25表達，CCK-8法檢測發(fā)現(xiàn)，抑制乳腺癌細胞中miR-25表達能明顯抑制乳腺癌細胞的增殖活性，提示miR-25與乳腺癌的細胞增殖能力有關(guān)，可能為乳腺癌的基因治療提供新的治療靶點。

綜上所述，miR-25在乳腺癌組織和細胞系中表達上調(diào)，且與臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)；體外實驗證實，抑制miR-25表達能抑制乳腺癌細胞增殖，miR-25有望成為治療乳腺癌的新靶點。

參考文獻：

[1] 謝曉娟，汪旭,佟仲生.不同年齡段乳腺癌患者臨床病理特征分析[J].山東醫(yī)藥,2015,55(34):32-33.

[2] Farazi TA， Spitzer JI， Morozov P， et al． miRNAs in human cancer[J]． J Pathol， 2011，223(2):102-115.

[3] Sorel O, Dewals BG. MicroRNAs in large herpesvirus DNA genomes: recent advances[J]. Biomol Concepts, 2016,7(4):229-239.

[4] Singh T, Adams BD. The regulatory role of miRNAs on VDR in breast cancer[J]. Transcription, 2017,8(4):232-241.

[5] Campos-Parra AD, Mitznahuatl GC, Pedroza-Torres A, et al. Micro-RNAs as Potential Predictors of Response to Breast Cancer Systemic Therapy: Future Clinical Implications[J]. Int J Mol Sci, 2017,18(6).pii: E1182.

[6] Mandujano-Tinoco EA, Garcia-Venzor A, Munoz-Galindo L, et al. miRNA expression profile in multicellular breast cancer spheroids[J]. Biochim Biophys Acta, 2017,1864(10):1642-1655.

[7] Liu Q, Wang Y, Yang T, et al. Protective effects of miR-25 against hypoxia/reoxygenation-induced fibrosis and apoptosis of H9c2 cells[J]. Int J Mol Med, 2016,38(4):1225-1234.

[8] Hammond SM. An overview of microRNAs[J]. Adv Drug Deliv Rev, 2015,87:3-14.

[9] Zhao L, Chen X, Cao Y. New role of microRNA: carcinogenesis and clinical application in cancer[J]. Acta Biochim Biophys Sin, 2011,43(11):831-839.

[10] 丁小麗,胡蓉.microRNA-25在腫瘤中的研究進展[J].重慶醫(yī)學,2017,46(4):545-548.

[11] Xiang J, Hang JB, Che JM, et al. MiR-25 is up-regulated in non-small cell lung cancer and promotes cell proliferation and motility by targeting FBXW7[J]. Int J Clin Exp Pathol, 2015,8(8):9147-9153.

[12] Chen Z, Wu Y, Meng Q, et al. Elevated microRNA-25 inhibits cell apoptosis in lung cancer by targeting RGS3[J]. In Vitro Cell Dev Biol Anim, 2016,52(1):62-67.

[13] Peng G, Yuan X, Yuan J, et al. miR-25 promotes glioblastoma cell proliferation and invasion by directly targeting NEFL[J]. Mol Cell Biochem, 2015,409(1-2):103-111.

[14] 田川,姚姍姍,董笑,等.微小RNA-25通過調(diào)控Klf4表達促進肝癌細胞的增殖和遷移[J].腫瘤,2016,36(5):512-520.