潰瘍性結(jié)腸炎小鼠外周血和結(jié)腸組織中Tfh、Tfr細(xì)胞水平變化及意義

李世權(quán)，呂曉丹，謝彥飛，陳蘭，詹靈凌，呂小平

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧530021)

炎癥性腸病(IBD)包括潰瘍性結(jié)腸炎(UC)和克羅恩病，其病因和發(fā)病機(jī)制尚不清楚。腸道黏膜內(nèi)免疫反應(yīng)的過(guò)度活化是導(dǎo)致IBD發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵[1]。濾泡輔助性T細(xì)胞(Tfh)和濾泡調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tfr)是CD4+T細(xì)胞新的亞型。Tfh高表達(dá)趨化因子受體(CXCR5)、程序性細(xì)胞死亡蛋白1(PD-1)、誘導(dǎo)協(xié)同刺激分子(ICOS)、白細(xì)胞介素21(IL-21)等細(xì)胞因子，在促進(jìn)和維持生發(fā)中心(GC)的形成、刺激B細(xì)胞分化、產(chǎn)生高親和力抗體、抗體類別轉(zhuǎn)換及維持長(zhǎng)時(shí)間體液免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用[2]。Tfr能限制GC反應(yīng)，調(diào)節(jié)Tfh細(xì)胞分化，起到維持免疫耐受和防止自身免疫的作用[3]。Tfh、Tfr細(xì)胞在濾泡GC平衡機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)方面起重要作用。研究顯示，Tfh/Tfr平衡紊亂，則自身免疫性疾病(類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、IBD、1型糖尿病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、重癥肌無(wú)力、原發(fā)性干燥綜合征等)的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加[4～6]。IBD發(fā)病是否與Tfh/Tfr的失衡有關(guān)報(bào)道較少。2016年5月～2017年6月，我們觀察了潰瘍性結(jié)腸炎小鼠外周血及結(jié)腸組織中Tfh和Tfr的水平變化，并探討其臨床意義。

1　材料與方法

1.1動(dòng)物、試劑及儀器來(lái)源20只健康雄性昆明小鼠(9～12周齡，體質(zhì)量40～45 g)購(gòu)自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。三硝基苯磺酸(TNBS)購(gòu)自Sigma公司；淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自北京索萊寶公司；流式細(xì)胞術(shù)熒光標(biāo)記一抗CD4抗體(APC)、PD-1抗體(FITC)、FOXP3抗體(PerCP/Cy5.5?)及對(duì)應(yīng)的同型對(duì)照抗體均購(gòu)自Abcam公司，Anti-Mouse CXCR5(PE)及其同型對(duì)照抗體購(gòu)自BD公司；三色免疫熒光一抗抗小鼠Foxp3 eFluor 660、抗CD185(CXCR5)eFluor 450、抗CD4 FITC、抗CD279(PD-1)APC購(gòu)自eBioscience公司；Western blotting抗體GAPDH購(gòu)自Abcam公司、PD-1抗體購(gòu)自Novusbio公司。冷凍離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司；流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司；石蠟切片機(jī)及病理圖像分析儀購(gòu)自德國(guó)Leica公司；共聚焦顯微鏡購(gòu)自O(shè)lympus公司；電泳儀power/pac300購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；垂直電泳槽購(gòu)自北京六一儀器廠。

1.2動(dòng)物分組及UC模型建立將小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對(duì)照組、觀察組各10只。觀察組制備小鼠UC模型，參考文獻(xiàn)[7]方法。造模前小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，保持室溫20～22 ℃，濕度50%，明暗交替周期12 h；禁食24 h后，予4%水合氯醛按40 mg/kg腹腔注射麻醉后，由肛門插入直徑5 mm硅膠管至腸道內(nèi)約8 cm，一次性結(jié)腸灌注100 mg/kg TNBS(溶于50%乙醇溶液)0.4 mL，提起小鼠尾部倒立3 min，放回籠內(nèi)常規(guī)飼養(yǎng)。正常對(duì)照組予相同劑量的0.9%氯化鈉溶液灌腸。造模第8天，予4%水合氯醛40 mg/kg腹腔注射麻醉，用標(biāo)記的肝素抗凝采血管收集小鼠腹主動(dòng)脈血2 mL，迅速置于4 ℃冰箱中，并將小鼠結(jié)腸取出縱行切開，用冰生理鹽水反復(fù)沖洗干凈，以潰瘍部位為中心用眼科剪剪取直徑約1 cm結(jié)腸組織數(shù)塊，一部分置入4%多聚甲醛溶液固定，另一部分置于-80 ℃冰箱或液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3小鼠癥狀、體征觀察造模過(guò)程中每天記錄小鼠體質(zhì)量、大便情況，進(jìn)行大便潛血實(shí)驗(yàn)。采用UC疾病活動(dòng)指數(shù)(DAI)[8]對(duì)小鼠的體質(zhì)量、大便性狀、出血情況進(jìn)行評(píng)分。體質(zhì)量不變?yōu)?分，體質(zhì)量下降1%～5%為1分，6%～10%為2分，11%～15%為3分，>15%為4分；大便性狀正常為0分，大便松散為2分，黏糊狀為3分，腹瀉為4分；大便正常為0分，隱血弱陽(yáng)性為2分，隱血強(qiáng)陽(yáng)性為3分，顯性出血為4分。計(jì)算以上3項(xiàng)評(píng)分的平均值。

1.4小鼠結(jié)腸組織病理變化觀察取石蠟切片，行HE染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察腸黏膜損傷情況。組織損傷評(píng)價(jià)參照Schmidt等[9]的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，包括炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及組織損傷兩方面。炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)評(píng)分：無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)為0分，炎癥細(xì)胞浸及固有黏膜層1分，炎癥細(xì)胞浸及黏膜下層2分，炎癥細(xì)胞浸及整個(gè)腸壁3分；組織損傷評(píng)分：無(wú)黏膜損傷0分，不連續(xù)黏膜上皮損傷為1分，黏膜有糜爛或輕度潰瘍?yōu)?分，嚴(yán)重黏膜損傷伴潰瘍侵及腸壁為3分。計(jì)算兩項(xiàng)評(píng)分的平均值。

1.5小鼠外周血CD4+CXCR5+Foxp3+Tfr、CD4+CXCR5+PD-1+Tfh檢測(cè)采用流式細(xì)胞術(shù)。取小鼠EDTA抗凝的外周血2 mL，用Ficoll密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，將細(xì)胞稀釋為10×106/mL。Tfh流式管內(nèi)加入CD4(APC)、PD-1(FITC)、CXCR5(PE)流式抗體各2 μL，進(jìn)行三色熒光標(biāo)記，于4 ℃避光孵育20 min。Tfr流式管加入CD4(APC)、CXCR5(PE)流式抗體各2 μL，4 ℃避光孵育20 min后，加入FoxP3破膜液500 μL，于37 ℃避光孵育30 min，加入FoxP3(PerCP/Cy5.5?)抗體或FoxP3 1 μL，室溫避光孵育20 min，用PBS 2 mL清洗，4 ℃、1 500 r/min離心5 min，4 ℃，棄上清，重復(fù)清洗1次。加入PBS 300 μL重懸細(xì)胞，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血單個(gè)核細(xì)胞中CD4+CXCR5+Foxp3+Tfr、CD4+CXCR5+PD-1+Tfh細(xì)胞在CD4+T細(xì)胞中的比例。

1.6小鼠結(jié)腸組織中CD4+CXCR5+Foxp3+Tfr、CD4+CXCR5+PD-1+Tfh檢測(cè)采用三色免疫熒光標(biāo)記法。將結(jié)腸組織病理切片脫蠟、水化、清洗，置于0.01 mol/L枸鹽酸緩沖液(pH 6.0)中行高壓熱修復(fù)，水洗，用3%雙氧水室溫孵育10 min，PBS沖洗5 min×2次；免疫組化筆劃圈，滴加正常山羊血清封閉液50 μL，置于室溫20 min后封閉；一抗4 ℃孵育過(guò)夜(三標(biāo)三抗體同時(shí)加，濃度均為1∶100)；PBS洗3次，去離子水洗2次，每次5 min；抗熒光淬滅劑封片，共聚焦顯微鏡下觀察并拍照記錄；圖像采用Image-Pro Plus5.0軟件分析，以光密度與分布面積的比值表示CD4+CXCR5+Foxp3+Tfr、CD4+CXCR5+PD-1+Tfh細(xì)胞因子在結(jié)腸組織中的表達(dá)量。

1.7結(jié)腸組織中PD-1蛋白表達(dá)檢測(cè)采用Western blotting法。提取各組小鼠腸黏膜組織中的總蛋白，使用BCA蛋白定量試劑盒在570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定總蛋白濃度。蛋白經(jīng)過(guò)10% SDS-PAGE電泳后，將凝膠中蛋白電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，以TBST液配置5%脫脂奶粉溶液進(jìn)行封閉，加入PD-1一抗(1∶1 000)，于搖床上4 ℃孵育過(guò)夜，洗滌后加入熒光二抗(1∶10 000)，室溫孵育60 min后，ECL底物化學(xué)發(fā)光顯色后曝光顯影。目標(biāo)條帶使用圖像分析軟件進(jìn)行分析，目的蛋白的灰度值/內(nèi)參GAPDH的灰度值以校正誤差，所得結(jié)果代表樣品目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2　結(jié)果

2.1兩組癥狀、體征比較正常對(duì)照組小鼠反應(yīng)靈敏，飲食活動(dòng)正常，毛發(fā)有光澤，無(wú)便血，DAI為0。觀察組造模次日出現(xiàn)懶動(dòng)、拱背、厭食、體質(zhì)量下降、糞便隱血陽(yáng)性，進(jìn)食和飲水量減少；隨著時(shí)間推移，觀察組小鼠癥狀逐漸加重，造模第2～7天出現(xiàn)不同程度的肉眼血便，DAI為(2.65±1.13)分，與正常對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2兩組組織學(xué)變化比較正常對(duì)照組小鼠結(jié)腸黏膜層單層柱狀上皮細(xì)胞排列整齊完整，腸腺清晰，可見大量吸收細(xì)胞與杯狀細(xì)胞，形態(tài)正常，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肌層薄厚均勻無(wú)異常改變。觀察組小鼠結(jié)腸炎癥主要累及黏膜和黏膜下層，少數(shù)可達(dá)漿膜層，結(jié)腸黏膜不完整,可見多灶性淺潰瘍，大部分腺體被破壞，腺體正常結(jié)構(gòu)喪失，排列紊亂，腺腔大多消失；可見大量淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。觀察組組織損傷評(píng)分[(5.25±0.89)分]高于正常對(duì)照組[(0.30±0.48)分]，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3兩組外周血Tfh、Tfr細(xì)胞比例比較與正常對(duì)照組比較，觀察組外周血Tfh細(xì)胞比例高，Tfr細(xì)胞比例低，Tfh/Tfr高(P均<0.05)。見表1。

表1　兩組外周血Tfh、Tfr細(xì)胞比例比較

2.4兩組結(jié)腸組織中Tfh、Tfr細(xì)胞比例比較與正常對(duì)照組比較，觀察組小鼠結(jié)腸組織中Tfh細(xì)胞比例高，Tfr細(xì)胞比例低(P均<0.05)。見表2。

表2　兩組結(jié)腸組織中Tfh、Tfr細(xì)胞比例比較

2.5兩組結(jié)腸組織中PD-1蛋白表達(dá)比較正常對(duì)照組、觀察組PD-1蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.09±0.01、0.16±0.03，兩組比較，P<0.05。

3　討論

目前IBD的確切病因尚還清楚，但公認(rèn)的病因是機(jī)體對(duì)腸道(細(xì)菌)抗原的免疫反應(yīng)失衡，導(dǎo)致腸黏膜發(fā)生過(guò)度炎癥反應(yīng)。引起腸道黏膜免疫反應(yīng)的免疫細(xì)胞主要為CD4+T淋巴細(xì)胞，可分化為輔助性T細(xì)胞(Th1)、Th2、Th17、胸腺調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)等多種功能性的免疫細(xì)胞，通過(guò)表達(dá)與合成不同細(xì)胞因子在黏膜炎癥反應(yīng)中起主要作用，Th1/Th2、Th17/Treg失調(diào)產(chǎn)生過(guò)量的促炎性細(xì)胞因子，從而導(dǎo)致腸道炎癥損傷，與IBD的發(fā)生發(fā)展有重要關(guān)系[10，11]。近年來(lái)在淋巴GC中發(fā)現(xiàn)兩類新型的CD4+T細(xì)胞亞群，Tfh和Tfr細(xì)胞，Tfh細(xì)胞高表達(dá)CXCR5，在B細(xì)胞表達(dá)的細(xì)胞因子CXCL13趨化作用下，促使Tfh遷移至B淋巴細(xì)胞濾泡區(qū)域；Tfh高表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子Bcl-6和ICOS，對(duì)Tfh細(xì)胞的分化和維持具有重要作用[12]；此外，Tfh細(xì)胞還分泌大量的細(xì)胞因子IL-21[13]。Tfr從Treg分化而來(lái)[10]，其表面不僅表達(dá)Treg細(xì)胞的特征性轉(zhuǎn)錄因子FoxP3，而且還高表達(dá)Tfh細(xì)胞一樣的趨化受體CXCR5，能趨化定位到GC調(diào)節(jié)Tfh細(xì)胞的數(shù)量，抑制B細(xì)胞的分化成熟及抗體生成。缺乏Tfr細(xì)胞或Tfr/Tfh失衡將產(chǎn)生大量自身抗體，從而增加自身免疫性疾病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[14]。Tfr細(xì)胞對(duì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ秃妥陨砻庖咝约膊』颊弑憩F(xiàn)出抗自身免疫的保護(hù)作用。因此，通過(guò)分析Tfr細(xì)胞和Tfh細(xì)胞間的比例變化，不僅對(duì)預(yù)測(cè)機(jī)體免疫反應(yīng)的質(zhì)量和數(shù)量有幫助，且通過(guò)調(diào)節(jié)Tfr細(xì)胞治療自身免疫性疾病將成為可能[15,16]。

功能性相似的Tfh細(xì)胞不僅表達(dá)在人和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷拇渭?jí)淋巴器官，在外周血中同樣發(fā)現(xiàn)類似的CXCR5+Tfh細(xì)胞。本研究結(jié)果顯示，TNBS誘導(dǎo)小鼠UC后，其外周血Tfh細(xì)胞比例升高，與既往研究[4，6]結(jié)果一致。此外，本研究發(fā)現(xiàn)UC小鼠外周血Tfr細(xì)胞比例下降，Tfh/Tfr升高。提示外周血Tfh/Tfr異?？赡茉贗BD自身免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。

本研究結(jié)果顯示，UC小鼠結(jié)腸組織CD4+CXCR5+PD-1+Tfh水平升高，而CD4+CXCR5+Foxp3+Tfr水平下降，PD-1蛋白表達(dá)升高。Tfh在發(fā)揮輔助B細(xì)胞功能時(shí)，需高表達(dá)CXCR5，而位于B細(xì)胞區(qū)的濾泡樹突狀細(xì)胞分泌CXCR的配體CXCL13，通過(guò)PI3K信號(hào)通路傳導(dǎo)促使Tfh遷移到T-B細(xì)胞的交界區(qū)，在交界區(qū)域接受眾多細(xì)胞因子的刺激，同時(shí)與B細(xì)胞相互作用，進(jìn)一步分化為成熟的Tfh細(xì)胞，并趨化至濾泡區(qū)與B細(xì)胞形成GC，協(xié)助B細(xì)胞分化成熟，并實(shí)現(xiàn)Tfh自身的分化。Tfh細(xì)胞同樣高表達(dá)抑制性受體PD-1，與CXCR5、ICOS一樣亦是Tfh細(xì)胞的表面標(biāo)志物之一，可能給Tfh細(xì)胞提供一個(gè)抑制性的信號(hào)，防止CD4+T細(xì)胞過(guò)度分化為Tfh細(xì)胞。PD-1通過(guò)與PD-L1相互作用抑制Tfr細(xì)胞的數(shù)量，促進(jìn)Tfr細(xì)胞向Tfh細(xì)胞轉(zhuǎn)化[2]。本研究結(jié)果亦提示結(jié)腸組織中CD4+CXCR5+PD-1+Tfh和CD4+CXCR5+Foxp3+Tfr的異常表達(dá)及PD-1異常升高可能成為UC發(fā)病的機(jī)制之一。

總之，Tfh細(xì)胞及PD-1水平升高，導(dǎo)致Tfr細(xì)胞的表達(dá)受到抑制，Tfh/Thr比例失衡可能在IBD的發(fā)病機(jī)制中扮演重要角色，此為探討IBD的發(fā)病機(jī)制及治療措施提供了理論依據(jù)。

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