染色體的識別及核型特征分析

鄒　禹,鄭　嬌,張　靜,劉賢德,王志勇,蔡明夷

(集美大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院,農(nóng)業(yè)部東海海水健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建 廈門 361021)

1　材料與方法

1.1　實(shí)驗(yàn)材料及染色體制備

1.2　染色體制片的染色

染色體制片分別用碘化丙啶(PI)、4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)和硝酸銀染液進(jìn)行染色．PI和DAPI染色參考鄭嬌等[12]的方法．硝酸銀染色(銀染)根據(jù)Howell等[13]的方法略作修改:染色體制片平放于50 ℃濕潤培養(yǎng)皿中;明膠顯影液和50%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))硝酸銀溶液按1∶2(體積比)混勻后滴加到載玻片上,蓋上蓋玻片;待反應(yīng)液呈金褐色時(shí)取出制片,去離子水沖洗后用5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))Na2S2O3溶液終止反應(yīng)．

1.3　FISH

圖1　染色體的PI染色核型圖(a)和3D-光強(qiáng)度圖(b)Fig.1 Karyotype image with PI staining (a) and 3D-optical density histogram (b) of M. miiuy chromosomes

采用FISH技術(shù)定位18S rDNA、5S rDNA和端粒序列在染色體上的分布位置．其中,2種rDNA片段均利用PCR擴(kuò)增獲得．DNA提取、PCR引物設(shè)計(jì)、PCR體系及程序參照鄭嬌等[12]的方法．端粒序列通過無模板擴(kuò)增獲得,引物為(TTAGGG)5和(TAACCC)5[14]．上述PCR產(chǎn)物用缺口平移試劑盒(Roche公司)制備生物素或地高辛標(biāo)記探針．探針變性、染色體制片變性、探針與染色體制片雜交、雜交后洗滌、信號放大、復(fù)染和封片等步驟參照蔡明夷等[15]的方法．

1.4　鏡檢及數(shù)據(jù)分析

染色體的顯微圖像利用熒光顯微鏡(Olympus BX53)觀察．分散良好的中期染色體用電荷耦合元件(CCD)圖像傳感器(Olympus DP80)拍攝．用IPP 6.0軟件分析染色體圖像,測量染色體的長度、寬度、面積、累積光密度(IOD)和3D-光強(qiáng)度[16]．綜合各項(xiàng)測量數(shù)據(jù)完成染色體配對,并按相對長度降序排列出核型圖，用Adobe Photoshop CC軟件輔助完成．

2　結(jié)果與分析

2.1　核型圖像分析

2.2　核型數(shù)據(jù)分析

選取5個(gè)數(shù)目完整、分散良好的中期相,測量染色體的相對長度、相對面積和PI染色的相對IOD,并計(jì)算各參數(shù)的平均值,結(jié)果見表1．其中,1號染色體的相對長度為(5.542±0.280)%,24號染色體相對長度為(2.756±0.026)%；染色體的相對長度、相對面積和相對IOD的分布均比較連續(xù),但三者的排序并不一致．

表1　染色體的相對長度、相對面積和相對IOD

%

2.3　染色體特征識別

DAPI染色結(jié)果如圖2(a)所示：染色體呈現(xiàn)熒光強(qiáng)度不均勻,特別是在1號染色體距離著絲粒約1/3臂長處呈現(xiàn)出明顯的暗帶．銀染結(jié)果如圖2(b)所示:每個(gè)間期核有1～2個(gè)深染的核仁組織區(qū)域(NOR);每個(gè)中期相染色體組有1對深染的NOR,位置與DAPI染色的暗帶相當(dāng)．18S rDNA和5S rDNA雙色FISH結(jié)果如圖2(c)所示:18S rDNA和5S rDNA均只有1對位點(diǎn),分別位于1號染色體DAPI暗帶區(qū)域和2號染色體著絲粒區(qū)域．端粒序列FISH結(jié)果如圖2(d)所示:端粒的熒光信號在所有染色體上均特異地出現(xiàn)在端部區(qū)域,未發(fā)現(xiàn)臂間端粒信號;除部分端粒信號略微弱外,總體信號強(qiáng)度較均勻．

(a) DAPI 染色,箭頭所指為DAPI暗帶;(b) 銀染,箭頭所指為NOR;(c) 18S rDNA和5S rDNA雙色FISH;(d) 端粒序列FISH．標(biāo)尺為10 μm．圖2　染色體的中期相圖Fig.2 The metaphase image of M. miiuy chromosomes

3　討　論

3.1　染色體識別

相對于其他脊椎動物與植物而言,海水魚類染色體研究發(fā)展比較滯后．一方面是由于染色體制備需要細(xì)胞分裂旺盛的活體材料,而海水魚類取樣相對陸生動植物困難;另一方面是由于海水魚類染色體普遍有規(guī)格小、長度連續(xù)、標(biāo)記匱乏等特點(diǎn),且適用于哺乳動物的G帶和Q帶技術(shù)往往不能成功應(yīng)用于魚類,導(dǎo)致海水魚類染色體識別較困難[17]．為了提高魚類染色體辨識水平,研究人員致力于開發(fā)各種技術(shù),如復(fù)制帶、限制性內(nèi)切酶顯帶、自身基因組熒光原位雜交(self-GISH)等[12,17]．

PI是DNA定量中最常用的熒光染料,對DNA染色幾乎沒有選擇性．染色體經(jīng)PI染色后呈現(xiàn)熒光強(qiáng)度不均勻的特點(diǎn),可能是DNA在染色體不同部位濃縮水平存在差異的結(jié)果[18]．本研究利用PI染色方法發(fā)現(xiàn)染色體呈現(xiàn)強(qiáng)度不均勻的熒光，染色體不同位置的熒光強(qiáng)度有一定差異,呈現(xiàn)出特定的熒光強(qiáng)度分布模式;同源染色體間熒光分布模式雖然略有差異,但總體小于非同源染色體之間的差異．利用IPP 6.0軟件獲得的3D-光強(qiáng)度圖可以更直觀地顯示熒光染色強(qiáng)度的二維分布,為染色體的人工識別和配對提供了豐富的信息,同時(shí)為進(jìn)一步開發(fā)魚類染色體自動分析系統(tǒng)奠定了基礎(chǔ)．相比鄭嬌等[12]基于self-GISH和圖像分析的染色體識別方法,本方法操作更簡便．

表2　石首魚類rDNA FISH定位結(jié)果

Tab.2　Chromosomal organization of rDNA by FISH in Sciaenidae

物種18SrDNA5SrDNA對數(shù)位置a對數(shù)位置a參考文獻(xiàn)廈門白姑魚(Argyrosomusamoyensis)11st,PRX13rd,TER[22]棘頭梅童魚(Collichthyslucidus)b11st,STL(F);1st,P(M)11st,STL(F);1st,P(M)[23]大黃魚(Larimichthyscrocea)118th,TER9～10[22]黃姑魚(Nibeaalbiflora)11st,PRX21st,TER;4th,STL[7]眼斑擬石首魚(Sciaenopsocellatus)11st,PRX23rd,STL;8th,PRX[24](M.miiuy)11st,PRX12nd,TER本研究

注：a.命名參考文獻(xiàn)[24]，TER表示t染色體的著絲粒端,PRX表示近著絲粒區(qū)域,P表示短臂,STL表示亞端部;b.棘頭梅童魚的雌(F)、雄(M)核型不一致．

FISH是20世紀(jì)80年代末發(fā)展起來的分子細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)，利用核酸雜交與免疫放大定位目標(biāo)探針在染色體上的位置,從而將染色體研究推進(jìn)到分子水平[20]．rDNA是最常用作FISH探針的DNA序列之一．真核生物的rDNA包括45S rDNA和5S rDNA兩種獨(dú)立基因簇：45S rDNA重復(fù)單位包括28S rDNA、18S rDNA和5.8S rRNA序列和間隔區(qū)(ITS1和ITS2)；5S rDNA重復(fù)單位包括5S rDNA序列和間隔區(qū)[21]．45S rDNA FISH通常利用部分序列作探針(如18S rDNA),而5S rDNA FISH常用編碼序列和部分間隔區(qū)作探針．迄今,利用FISH對18S rDNA和5S rDNA位點(diǎn)進(jìn)行過定位的石首魚類共6種，如表2所示：石首魚類18S rDNA位點(diǎn)分布數(shù)目相對保守,除大黃魚和雄性棘頭梅童魚外,均為單對位點(diǎn),分布于1號染色體近著絲粒區(qū)域；相比之下,5S rDNA位點(diǎn)的分布模式在石首魚類不同種間的差異要大得多,不僅表現(xiàn)在位點(diǎn)數(shù)目上,也表現(xiàn)在染色體的相對位置上．導(dǎo)致rDNA位點(diǎn)位置差異的機(jī)制可能是轉(zhuǎn)座子的作用或同源染色體的不平衡交換等[25-26]．基于石首魚類的核型和18S rDNA分布模式很保守的特點(diǎn),我們推測與5S rDNA相關(guān)的轉(zhuǎn)座子可能是導(dǎo)致其數(shù)目和位置變異的主要原因．

4　結(jié)　論

參考文獻(xiàn)：

[1] 朱元鼎,羅云林,伍漢霖.中國石首魚類分類系統(tǒng)的研究和新屬新種的敘述[M].上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,1963:66-67.

[2]柳淑芳,陳亮亮,戴芳群,等.基于線粒體CO1基因的 DNA 條形碼在石首魚科 (Sciaenidae) 魚類系統(tǒng)分類中的應(yīng)用[J].海洋與湖沼,2010,41(2):223-232.

[5]CHENG Y,JIN X,SHI G,et al.Genetic diversity and population structure of miiuy croaker populations in East China Sea revealed by the mitochondrial DNA control region sequence[J].Biochemical Systematics and Ecology,2011,39(4):718-724.

[6]CHE R,SUN Y,SUN D,et al.Characterization of the miiuy croaker (Miichthysmiiuy) transcriptome and deve-lopment of immune-relevant genes and molecular markers[J].PLoS One,2014,9(4):e94046.

[8]李國珍.染色體及其研究方法[M].北京:科學(xué)出版社,1985:108-129.

[11]陳紫瑩.大黃魚與黃姑魚細(xì)胞遺傳學(xué)初步研究[D].廈門:集美大學(xué),2013:13-15.

[12]鄭嬌,曹款,楊安冉,等.黃姑魚染色體識別與重復(fù)序列定位[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào),2016,40(8):1156-1162.

[13]HOWELL W M,BLACK D A.Controlled silver-staining of nucleolus organizer regions with a protective colloidal developer:a 1-step method[J].Experientta,1980,36(8):1014-1015.

[14]SAHARA K,MAREC F,TRAUT W.TTAGG telomeric repeats in chromosomes of some insects and other arthropods[J].Chromosome Research,1999,7(6):449-460.

[15]蔡明夷,劉賢德,陳紫瑩,等.皺紋盤鮑染色體 C 帶和 rDNA 定位[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào),2013,37(7):1002-1008.

[16]曹款,鄭嬌,王志勇,等.黃姑魚基因組大小和染色體物理長度的測定[J].南方水產(chǎn)科學(xué),2015,11(4):65-70.

[17]任修海,余其興.魚類基因組結(jié)構(gòu)研究[J].遺傳學(xué)報(bào),1991,18(1):17-22.

[18]SAITOH Y,LAEMMLI U K.Metaphase chromosome structure:bands arise from a differential folding path of the highly AT-rich scaffold[J].Cell,1994,76(4):609-622.

[19]KAPUSCINSKI J.DAPI:a DNA-specific fluorescent probe[J].Biotechnic & Histochemistry,1995,70(5):220-233.

[20]王昌留，張士催,王勇軍.熒光原位雜交技術(shù)的發(fā)展及其在染色體基因定位中的應(yīng)用[J].海洋科學(xué),2003(9):21-23.

[21]GORNUNG E.Twenty years of physical mapping of major ribosomal RNA genes across the teleosts:a review of research[J].Cytogenetic and Genome Research,2013,141(2/3):90-102.

[22]廖夢香,鄭嬌,王志勇,等.核糖體 DNA 在廈門白姑魚和大黃魚染色體上的比較定位[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào),2017,41(9):1338-1344.

[23]ZHANG S K,ZHENG J,ZHANG J,et al.Cytogenetic characterization and description of an X1X1X2X2/X1X2Y sex chromosome system inCollichthyslucidus(Richardson,1844)[J].Acta Oceanologica Sinica,2018.doi:10.1007/s13131-018-1152-1.

[24]朱齊春,鄭嬌,張靜,等.眼斑擬石首魚重復(fù) DNA 序列的染色體定位[J].水生生物學(xué)報(bào),2017,41(6):1218-1224.

[25]COEN E S,DOVER G A.Unequal exchanges and the coevolution of X and Y rDNA arrays inDrosophilamelanogaster[J].Cell,1983,33(3):849-855.

[26]MERLO M A,CROSS I,MANCHADO M,et al.The 5S rDNA high dynamism inDiplodussargusis a transposon-mediated mechanism.Comparison with other multigene families and Sparidae species[J].Journal of Molecular Evolution,2013,76(3):83-97.

[27]OCHS R L,BUSCH H.Further evidence that phosphoprotein C23 (110 kD/pI 5.1) is the nucleolar silver staining protein[J].Experimental Cell Research,1984,152(1):260-265.

[28]ARTANDI S E,CHANG S,LEE S L,et al.Telomere dysfunction promotes non-reciprocal translocations and epithelial cancers in mice[J].Nature,2000,406(6796):641.

[29]OCALEWICZ K.Telomeres in fishes[J].Cytogenetic and Genome Research,2013,141(2/3):114-125.