響應(yīng)面法優(yōu)化乳酸菌凍干保護劑配方

楊　輝， 閆曉哲， 杜姣姣， 荊　雄， 董騰達

(陜西科技大學 食品與生物工程學院， 陜西 西安　710021)

0　引言

近年來人們對于乳酸菌的認識不斷深入，其產(chǎn)品種類逐漸多樣化[1]，其中乳酸菌粉劑被廣泛用作直投式發(fā)酵劑[2]、醫(yī)藥[3]和飼料[4]等產(chǎn)品的生產(chǎn).本實驗利用復合乳酸菌[5]發(fā)酵果渣浸提液過程中產(chǎn)生一定量副產(chǎn)物-乳酸菌泥[6]，如果將其棄之則是浪費資源、污染環(huán)境，現(xiàn)通過冷凍干燥的方法將其凍干成粉，既對資源進行了有效利用也避免造成環(huán)境污染.

真空冷凍干燥是保護工業(yè)乳酸菌的存活率和功能活性的有效方法之一[7-9]，它將預(yù)凍樣品中的冰在真空條件下直接升華，達到低溫條件下除去樣品中水分的目的[10].水分的損失必然導致細胞的損傷，進而影響到菌種的活力[11,12].在凍干過程中乳酸菌細胞損傷主要包括機械損傷和溶質(zhì)損傷[13]，而其損傷的程度取決于細胞的生長條件、生長狀態(tài)、技術(shù)參數(shù)及凍干保護劑等，其中凍干保護劑可以通過在細胞外形成蛋白膜，降低相變溫度[14]，增加細胞膜剛性和流動性等功效來預(yù)防或者減少在凍干期間細胞的損傷和死亡.根據(jù)保護劑能否通過細胞壁或細胞膜，可將其細分為：(1)能透過細胞壁和細胞膜的保護劑；(2)只能透過細胞壁的保護劑；(3)不能透過細胞壁和細胞膜的保護劑[13]；不同保護劑其功能作用有所不同，所以通常將多種類型的保護劑復合使用來提高對菌種保護效果[15].

現(xiàn)在的凍干保護劑主要針對單一乳酸菌[16,17]，有學者也研究復合乳酸菌凍干保護劑，陳賀佳等[18]將嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌以3∶2∶1比例直接混合并凍干，使混合乳酸菌的凍干存活率達到89.1 %；張炎等[19]將Lactococcuslactissubsp.LactisQ8和LactobacilluscaseiG5以2∶1的比例接入到改良MRS培養(yǎng)基中生長并凍干，使混合乳酸菌的凍干存活率達到90.55%；本實驗中采用的混合乳酸菌泥是乳酸菌發(fā)酵果渣浸提液的副產(chǎn)物，并不是5種菌種簡單混合，也并未給菌種生長提供特殊的培養(yǎng)基，而是以處理混合乳酸菌發(fā)酵的副產(chǎn)物——5種乳酸菌菌泥為目的.在參考前人實驗[16,17]的基礎(chǔ)上選取了8種常用凍干保護劑，通過一系列試驗對凍干保護劑配方進行優(yōu)化，進而最大程度的保護凍干菌種，從而為乳酸菌飼料制備奠定技術(shù)基礎(chǔ).

1　材料與方法

1.1　材料與試劑

1.1.1菌株

嗜酸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、植物乳桿菌、雙歧桿菌、嗜熱鏈球菌：由陜西科技大學食品與生物工程學院研究室保存.

1.1.2活化培養(yǎng)基

(1)MRS肉湯(北京陸橋技術(shù)有限責任公司)：蛋白胨10.0 g/L、牛肉浸粉5.0 g/L、酵母浸粉4.0 g/L、葡萄糖20.0 g/L、磷酸氫二鉀2.0 g/L、檸檬酸三銨2.0 g/L、乙酸鈉5.0 g/L、硫酸鎂0.2 g/L、硫酸錳0.05 g/L、吐溫80 1.0 g/L、pH值6.2±0.1；

(2)M17培養(yǎng)基(青島高科園海博生物技術(shù)有限公司)：大豆胨5.0 g/L、蛋白胨2.5 g/L、酪蛋白胨2.5 g/L、酵母浸粉2.5 g/L、牛肉浸粉5.0 g/L、乳糖5.0 g/L、抗壞血酸鈉0.5 g/L、β-甘油磷酸鈉19.0 g/L、硫酸鎂0.25 g/L、pH值7.2±0.2.

1.1.3發(fā)酵培養(yǎng)基

調(diào)配的果渣浸提液[6].

1.1.4計數(shù)培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基(北京陸橋技術(shù)有限責任公司)：蛋白胨10.0 g/L、牛肉浸粉8.0 g/L、酵母浸粉4.0 g/L、葡萄糖20.0 g/L、磷酸氫二鉀2.0 g/L、檸檬酸氫二銨2.0 g/L、乙酸鈉5.0 g/L、硫酸鎂0.2 g/L、硫酸錳0.04 g/L、瓊脂14.0 g/L、吐溫80 1.0 mL/L、pH值6.5±0.2.

1.1.5試劑

低聚果糖、低聚木糖、低聚半乳糖、菊糖、磷酸氫二鉀、蔗糖、海藻糖：北京嘉康源科技發(fā)展有限公司；NaHCO3：天津市天力化學試劑有限公司.

1.2　主要儀器

恒溫培養(yǎng)箱(山東濰坊醫(yī)療器械廠)，電子分析天平(賽多利斯(北京)科技有限公司)，pHS-4C+酸度計(成都市方舟科技開發(fā)公司)，DK-S24型電熱恒溫水浴鍋(上海精宏實驗設(shè)備有限公司)，超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備工作廠)，榨汁機(廣東美的精品電器制造有限公司)，YX-24LDJ型滅菌鍋(江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司),LGJ-15D型冷凍干燥機(北京四環(huán)科學儀器廠).

1.3　實驗方法

1.3.1菌泥產(chǎn)生、收集及凍干

菌泥產(chǎn)生、收集及凍干的工藝流程如圖1所示.

圖1　工藝流程圖

1.3.2凍干存活率、單位質(zhì)量菌粉活菌數(shù)的測定

本實驗以凍干存活率為主要指標，其計算公式如式(1)所示；單位質(zhì)量菌粉活菌數(shù)為次要指標，其計算公式如式(2)所示.

凍干存活率R1(%)=

(1)

單位質(zhì)量菌粉活菌數(shù)R2(CFU/mL)=

(2)

1.4　保護劑配比的優(yōu)化

1.4.1單因素實驗

如表1所示，實驗共選擇8種常用保護劑進行三組平行單因素實驗，其中包含了益生元(A、B、C、D)；無機鹽(E、F)；糖(G、H)；共3類，依據(jù)文獻中給出的濃度范圍，分別設(shè)置濃度梯度進行單因素實驗.測定c1、c2、m1,計算R1、R2.

表1　單一保護劑質(zhì)量濃度表

1.4.2篩選實驗

本實驗的凍干對象是由5種乳酸菌混合的菌泥，其細胞表面的官能團、蛋白質(zhì)存在一定的差異，導致了單一凍干保護劑不能滿足高存活率的要求.針對復合乳酸菌，復配的凍干保護劑在滿足保護單一乳酸菌的基礎(chǔ)上，也能對其他種類的乳酸菌進行保護.對單一乳酸菌而言，復配的保護劑之間可能存在協(xié)調(diào)作用，可以在很大程度上提高凍干保護的效率.因此，通過單因素實驗確定凍干保護劑適宜添加量，在此基礎(chǔ)上篩選出對于存活率影響顯著的保護劑種類，并對其進行響應(yīng)面優(yōu)化.

1.4.3爬坡實驗

響應(yīng)面擬合方程在考察的臨近領(lǐng)域內(nèi)能夠最大程度接近真實值，故在篩選實驗基礎(chǔ)上進行爬坡實驗.在爬坡實驗中，選取篩選實驗中對于存活率影響顯著的前三種保護劑的低水平為最后一步，選取適宜步長進行爬坡實驗.

1.4.4響應(yīng)面優(yōu)化

根據(jù)爬坡實驗確定響應(yīng)面中心點，選取各因素高低水平進行響應(yīng)面實驗，并在得到較佳結(jié)果的基礎(chǔ)上進行驗證實驗.

1.4.5使用軟件

本實驗所使用的軟件主要有Design-Expert、Excel、Spss等.

2　結(jié)果與討論

2.1　單因素實驗

2.1.1糖類單因素實驗

蔗糖和海藻糖在凍干保護中的作用機理可以解釋為以下兩種原因：

(1)水置換假說[20].在冷凍干燥過程中，由于水分子除去導致磷脂分子間范德華力作用增強，使細胞膜處于凝膠狀態(tài)，脂質(zhì)高度有序而且緊密，導致細胞膜通透性增大，更易損傷[21].蔗糖和海藻糖可以直接與干燥狀態(tài)的脂質(zhì)膜相互作用取代水分子，維持了相變溫度的穩(wěn)定，從而保持磷脂雙分子層的通透性，防止細胞在脫水干燥、貯存期間泄漏和融合[22].Samuel B等[23]利用FTIR，通過1 550波數(shù)處的酰胺II帶，監(jiān)測蛋白質(zhì)的一般狀態(tài)發(fā)現(xiàn)，在沒有添加蔗糖和海藻糖干燥的細菌中，酰胺II帶向較低波數(shù)移動，表明這些細胞中蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化，當存在海藻糖或蔗糖時，酰胺II帶沒有變化，說明了海藻糖或蔗糖在一定程度上保證了細胞膜上蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性.Adriana M等[24]研究發(fā)現(xiàn)蔗糖可以推遲或者阻止膜結(jié)合蛋白的變性，海藻糖或蔗糖可能代替水分子結(jié)合到蛋白質(zhì)的親水結(jié)構(gòu)域[11]來防止干燥和在水化期間蛋白質(zhì)內(nèi)和蛋白質(zhì)間氫鍵斷裂以保護干燥過程中細胞的完整性.

(2)“玻璃化”假說[23].在凍干時海藻糖和蔗糖可以避免結(jié)晶，從而減少損傷，此外，在凍干時海藻糖和蔗糖將包裹住生物分子，由于玻璃體粘度高，使分子運動和分子變性非常微弱，從而保護生物分子的空間結(jié)構(gòu)[25].

圖2顯示了糖類保護劑添加量對凍干菌粉的影響.由圖2(a)可以看出，此菌泥的蔗糖適宜添加量為7%，海藻糖添加量為9%.

2.1.2益生元類單因素實驗

低聚半乳糖、低聚木糖、低聚果糖以及菊糖都的都具有益生元活性[26].益生元對于乳酸菌具有很好的保護作用，從化學角度來說，這四種益生元是多羥基化合物，它們對菌體的保護作用可以用水置換假說、玻璃化假說等來解釋(在2.1.1已經(jīng)說明).

(a)糖類保護劑添加量對凍干菌粉存活率的影響

(b)糖類保護劑添加量對單位質(zhì)量菌粉活菌數(shù)的影響圖2　糖類保護劑添加量對凍干菌粉的影響

此外，還有第三種機制提出：在水存在的條件下，益生元將會覆蓋在生物分子表面，在一定程度上保持細胞表面的溶劑化和天然性質(zhì).這樣益生元可以維持冷凍干燥的乳酸菌細胞中水的含量，從而適度保存和避免其不受傷害[27]，研究發(fā)現(xiàn)試驗中分子量最大為6 179.36的菊糖對菌體的保護效果最佳，而分子量分別為300、300.28的小分子量的低聚半乳糖、低聚木糖保護效果較差，在一定程度上說明了不同低聚糖的保護效果與其結(jié)構(gòu)特征和鏈長有一定的關(guān)系.Tymczyszyn E E等[12]發(fā)現(xiàn)益生元的結(jié)構(gòu)差異不僅在其與生物分子相互作用的能力中發(fā)揮重要作用，而且在其形成生物分子嵌入玻璃體的能力方面也至關(guān)重要.Tymczyszyn E E等[28]還發(fā)現(xiàn)益生元濃度對乳酸菌凍干和存儲有一定影響，凍干所需濃度高，而存儲所需濃度低.

圖3結(jié)果表明：低聚半乳糖、低聚果糖、低聚木糖、菊糖添加量分別為：8%、12%、16%、8%，菊糖的保護作用最好，與上述分析的一致，不過本研究表明低聚半乳糖和低聚木糖對乳酸菌也具有較好的保護作用，對此還需做進一步的研究.

(a)低聚果糖、菊糖添加量對活菌率的影響

(b)低聚果糖、菊糖添加量對單位質(zhì)量菌粉活菌數(shù)的影響

(c)低聚半乳糖、低聚木糖添加量對活菌率的影響

(d)低聚半乳糖、低聚木糖添加量對單位質(zhì)量菌粉活菌數(shù)的影響圖3　益生元類保護劑添加量對凍干菌粉的影響

2.1.3無機鹽類單因素實驗

由圖4可知，無機鹽類單因素實驗所選無機鹽類都含有單價金屬陽離子，Adriana M等[24]研究發(fā)現(xiàn)，單價金屬陽離子鹽能夠降低細胞膜的相變溫度，使細胞膜保持液體狀態(tài)，并增強細胞對于壓力的抵抗性，同時，乳酸菌處于高滲條件下，使細胞內(nèi)相容性溶質(zhì)濃度提高，增強乳酸菌對高滲環(huán)境的適應(yīng)性，也增加了對干燥、冷凍的耐受性，所以單因素實驗中所選鹽濃度較高.但鹽濃度過高，滲透平衡會被打破，盡管單價金屬陽離子不影響磷脂雙分子層特性，但細胞膜上的蛋白質(zhì)將發(fā)生不可逆變性，使細胞膜受損，進而導致細胞的亞致死損傷或死亡.故根據(jù)單因素實驗結(jié)果選擇碳酸氫鈉添加濃度1.0%，磷酸氫二鉀添加濃度1.4%.不同的鹽離子對細胞內(nèi)的離子濃度的提高程度不同，對細胞的保護作用不同，單一的無機鹽保護效果并不是很理想，因此要配合其他種類保護劑共同使用.

(a)無機鹽添加量對活菌率的影響

(b)無機鹽添加量對單位質(zhì)量菌粉活菌數(shù)的影響圖4　無機鹽添加量對活菌率的影響

2.2　篩選實驗

依據(jù)2.1單因素實驗結(jié)果，進行篩選實驗，其中保護劑各因素水平如表2所示；保護劑PB設(shè)計及結(jié)果如表3所示；保護劑對R1(凍干存活率)的方差分析如表4所示；保護劑對R2(單位質(zhì)量菌粉活菌數(shù))的方差分析如表5所示.

表2　保護劑各因素水平表

表3　保護劑PB設(shè)計及結(jié)果

注：表3中的A～H分別對應(yīng)表2中對應(yīng)的保護劑，保護劑添加量單位(%wt).

表4　保護劑對R1的方差分析

注：表4中的A～H分別對應(yīng)表2中對應(yīng)的保護劑.

表5　保護劑對R2的方差分析

注：表5中的A～H分別對應(yīng)表2中對應(yīng)的保護劑.

由表4方差分析可知，D-菊糖、E-碳酸氫鈉和B-低聚木糖的F值較大，且D的p=0.004 5<0.01，為極顯著性因素；E的p=0.014 5<0.05，為顯著性因素；B的p=0.054 9<0.1，為重要因素，其它因素對混合乳酸菌泥凍干存活率的影響均不顯著；由表5方差分析可知，B-低聚木糖、C-低聚半乳糖、D-菊糖的F值較大，且D的p=0.002 1<0.01，為極顯著性因素；B的p=0.035 8<0.05，C的p=0.047 0<0.5，為顯著性因素，故選取D-菊糖、E-碳酸氫鈉和B-低聚木糖為保護劑組成分.

2.3　爬坡實驗

在篩選實驗中發(fā)現(xiàn)D、E、B都是負效應(yīng)，故應(yīng)該選取其低水平作為爬坡實驗的高水平，設(shè)置步長進行爬坡實驗.其實驗設(shè)計及結(jié)果如表6所示.

表6　爬坡試驗設(shè)計及結(jié)果

根據(jù)表中實驗結(jié)果可知，隨著保護劑濃度的增大，R1逐漸增大，因此選擇第5組為響應(yīng)面中心點，分別為：B-低聚木糖14%；D-菊糖6% ；E-碳酸氫鈉 0.9%.

2.4　響應(yīng)面優(yōu)化實驗

中心組合設(shè)計因素與水平如表7所示；中心組合設(shè)計實驗結(jié)果如表8所示；響應(yīng)面二次模型的方差分析如表9所示.

表7　中心組合設(shè)計因素與水平

對表7的實驗結(jié)果建立回歸模型并進行數(shù)據(jù)分析，得到以下回歸模型方程：

R1=+0.80+0.022×B+0.026×D+0.019×E

+0.027×B×D+0.013×B×E-

4.250×10-3×D×E-0.049×B2-0.047×

D2-0.033×E2

表8　中心組合設(shè)計實驗結(jié)果

表9　響應(yīng)面二次模型的方差分析

注：“**”表示對結(jié)果影響非常顯著(P<0.01)；“*”表示對結(jié)果影響顯著(P<0.05)

方程模型的p值為0.001 3，表明模型顯著，失擬項p>0.1，表明失擬項不顯著，無失擬因素存在，該模型有效，可用模型對數(shù)據(jù)進行分析.R2=0.944 1，說明回歸方程的擬合程度較好，回歸分析有效，因此，用此回歸方程來預(yù)測乳酸菌泥凍干存活率.

圖5顯示了低聚木糖、菊糖、碳酸氫鈉交互作用對凍干存活率影響的響應(yīng)面及等高線.圖5(a)表明低聚木糖和菊糖的交互作用等高線近似圓形，且p=0.023 3<0.05，說明低聚木糖和菊糖對混合乳酸菌凍干菌粉劑交互作用顯著.由水置換假說可知，低聚木糖和菊糖可以取代磷脂分子和蛋白質(zhì)分子上的結(jié)合水，而低聚木糖和菊糖的相對分子量差距較大，當磷脂分子凝膠化，大分子的菊糖對于凝膠體內(nèi)部水的取代效率降低，而分子量較小的低聚木糖可以與菊糖提供互補作用[12]，起到保護作用.

圖5(b)可知，低聚木糖和碳酸氫鈉的交互作用等高線為橢圓形，且p=0.214 0>0.05，說明低聚木糖和碳酸氫鈉對混合乳酸菌凍干菌粉劑交互作用不顯著.圖5(c)可知，菊糖和碳酸氫鈉的交互作用等高線為橢圓形，且p=0.668 5>0.05，說明菊糖和碳酸氫鈉對混合乳酸菌凍干粉劑交互作用不顯著.綜合圖5(b)、圖5(c)，鹽類的保護作用主要在于使細胞內(nèi)相容性溶質(zhì)積累，增強乳酸菌對高滲、干燥、冷凍環(huán)境的適應(yīng)性，而益生元只對于細胞外部膜和蛋白質(zhì)的保護，所以益生元和無機鹽類的交互作用不顯著.

(a)低聚木糖和菊糖的交互作用

(b)低聚木糖和碳酸氫鈉的交互作用

(c)菊糖和碳酸氫鈉的交互作用圖5　低聚木糖、菊糖、碳酸氫鈉交互作用對凍干存活率影響的響應(yīng)面及等高線

通過響應(yīng)面分析可知，當?shù)途勰咎翘砑恿繛?4.5%、菊糖添加量為6.28%、碳酸氫鈉添加量為0.92%時，預(yù)測乳酸菌菌泥的凍干存活率為79.80%.

2.5　驗證實驗

將嗜酸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、植物乳桿菌、雙歧桿菌、嗜熱乳桿菌，以4%的接種量，接種比例2∶1∶2∶3∶4，接種到果渣浸提液中，在37 ℃～39 ℃下培養(yǎng)36～40 h，將菌液在5 000 r/min下離心10 min得到菌泥，將添加保護劑的菌泥在-20 ℃下預(yù)凍2 h后凍干24 h.凍干得到最終存活率為(82.87±4.28)%與預(yù)測值接近，與空白組(添加磷酸緩沖液，pH=7.4)相比乳酸菌菌泥的存活率提高了68.27%，表明響應(yīng)面法優(yōu)化乳酸菌泥凍干保護劑是可行的.

2.6　凍干菌粉活力驗證

保持發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵條件不變，以產(chǎn)酸量為指標，將繼代培養(yǎng)菌種、復水凍干菌粉進行對比發(fā)酵實驗.繼代培養(yǎng)菌種接種量4 mL/100 mL，由于R1約為82.87%，則復水凍干菌粉的接種量為4.83 mL/100 mL，其發(fā)酵結(jié)果如圖6所示.

由圖6可知，繼代培養(yǎng)菌種發(fā)酵39 h與復水凍干菌粉發(fā)酵45 h的產(chǎn)酸量基本接近，說明采用實驗中復合保護劑進行凍干處理可以保護乳酸菌的發(fā)酵活性.繼代培養(yǎng)菌種發(fā)酵3 h的產(chǎn)酸量接近復水凍干菌粉發(fā)酵9 h的產(chǎn)酸量，可能是因為在凍干過程中由于溫度的變化以及水分子的失去，對于乳酸菌細胞造成了一定的損傷，在復水以及發(fā)酵前期需要進行修復，從而延長了發(fā)酵周期.

圖6　凍干菌粉活力驗證

3　結(jié)論

在復合乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生的乳酸菌菌泥中添加低聚木糖、菊糖、碳酸氫鈉且添加量分別為14.5%、6.28%、0.92%時，可使菌泥中乳酸菌的存活率達到(82.87±4.28)%，較單一添加磷酸緩沖液提高了68.27%，表明響應(yīng)面法優(yōu)化復合乳酸菌凍干保護劑配方是可行的，凍干保護劑在保護乳酸菌粉的活性和功能活性方面將發(fā)揮重要作用.

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