早期膽汁外引流對重癥急性胰腺炎大鼠血清高遷移率族蛋白B1和血紅素加氧酶1表達的影響*

張賽，王付海，溫慶彬，趙玉成，吳志正，田虎

（1.山東中醫(yī)藥大學 第二臨床學院，山東 濟南 250000；2.山東省千佛山醫(yī)院 普外中心，山東 濟南 250000）

隨著生活水平的提高，胰腺炎發(fā)生率也在明顯提高，追求更多減緩胰腺炎炎癥的進程和促進機體機能快速恢復的方法成為了當前的研究焦點。高遷移率族蛋白B1（high mobility group box 1 protein, HMGB1）和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α, TNF-α）是SAP發(fā)生發(fā)展過程中重要的炎性因子，同時血紅素加氧酶1（heme oxygenase 1, HO-1）可抑制炎癥反應。本實驗通過建立SAP大鼠模型，探討早期膽汁外引流對SAP大鼠炎性因子HMGB1和TNF-α以及抑制炎性因子HO-1表達的影響，從而達到調(diào)控炎癥，保護相關(guān)臟器的作用，進而指導臨床應用。

1 材料與方法

1.1 材料

54只健康清潔Wistar成年大鼠，雌性，體重190～200 g，由山東省朋悅公司提供；酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）試劑盒（武漢基因美生物科技有限公司提供）；?；悄懰徕c（美國Sigma公司提供）。

1.2 儀器與設備

酶標儀（山東省千佛山醫(yī)院中心實驗室提供）；低速離心機（山東大學弘立醫(yī)學動物實驗公司提 供）。

1.3 試驗方法

1.3.1 實驗過程一 將54只健康清潔Wistar成年大鼠分成3組，每組大鼠各18只，假手術(shù)組（SOG組)、模型未引流組（SAP組)和模型引流組（BDG組）。構(gòu)建大鼠SAP模型：采取腹腔注射麻醉，取上腹部正中開腹，沿肝十二指腸韌帶找到膽總管后，暫時夾閉肝門部膽管，使用0.45號頭皮針頭于十二指腸外側(cè)壁（對系膜緣）穿孔，經(jīng)胰膽管逆行注射4%?；悄懰徕c（0.1 ml/100 g），逐層關(guān)腹，術(shù)后大鼠繼續(xù)禁食，自由飲水。SAP組與BDG組均構(gòu)建大鼠SAP模型，BDG組大鼠行早期膽汁外引流處理；SOG組只行開腹手術(shù)。

1.3.1 實驗過程二 實驗結(jié)束后立即行開腹手術(shù)，在無菌條件下抽取下腔靜脈血液3～4 ml，室溫放置2 h后，1 000 g離心20 min，取上清；應用ELISA法檢測細胞因子TNF-α、HO-1以及HMGB1的表達和含量：取出ELISA試劑盒板條，設置標準品孔和樣本孔，標準品孔加不同濃度標準品50 μl（TNF-α標準品濃度依次是240、160、80、40、20和0 pg/ml；HO-1標準品濃度依次是1 800、1 200、600、300、150 和 0 pg/ml；HMGB1標準品濃度依次是：12、8、4、2、1和0 μg/L），樣本孔加入待測樣本50 μl，空白孔不加；除空白孔外，標準品孔與樣本孔每孔加入辣根過氧化物酶（horse radish peroxidase, HRP）標記的檢測抗體100 μl，用封板膜封住反應孔，37℃恒溫箱溫育60 min；棄去液體，吸水紙拍干，每孔加滿洗滌液350 μl，靜置1 min；甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復洗板5次；洗板完成后，每孔加入底物A、B各50 μl，37℃避光孵育15 min；每孔加入終止液50 μl，15 min內(nèi)，在450 nm波長處測定各孔吸光度（optical density, OD）值，以標準品濃度與其OD值繪出標準曲線，計算樣品實際濃度。

1.4 統(tǒng)計學方法

應用SPSS 13.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組計量資料組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），其中組間兩兩數(shù)據(jù)比較采用Dunnet-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 3組研究對象TNF-α水平比較

建模成功后第3、6和12小時SAP組TNF-α水平均顯著高于SOG組（P＜0.05） ；建模成功后第3、6和12小時，SAP組與BDG組TNF-α水平比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

2.2 3組研究對象HMGB1水平比較

建模成功后第3、6和12小時，SAP組與SOG組HMGB1水平比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；建模成功后第3和12小時，SAP組與BDG組HMGB1水平比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；建模成功后第6小時，SAP組與BDG組HMGB1水平比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表2。

2.3 3組研究對象HO-1水平比較

建模成功后第3、6和12小時BDG組HO-1水平均顯著高于SAP組（P＜0.05）；建模成功后第3、6和12小時，SAP組與SOG組HO-1水平比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表3。

表1 3組研究對象建模成功后不同時間點TNF-α水平比較 （±s, pg/ml）

表1 3組研究對象建模成功后不同時間點TNF-α水平比較 （±s, pg/ml）

注：1）與SOG組比較，t =40.195，29.193，40.202；P =0.000，0.000，0.000。2）與SAP組比較，t =7.061，7.310，8.539；P =0.000，0.000，0.000。

組別 例數(shù) 3 h 6 h 12 h SOG 組 6 86.83±1.29 106.91±3.44 103.69±1.11 SAP 組 6 216.31±8.461） 267.57±13.061） 215.95±6.751）BDG組 6 189.59±5.472） 226.77±4.392） 187.87±4.392）

表2 3組研究對象建模成功后不同時間點HMGB1水平比較 （±s, pg/ml）

表2 3組研究對象建模成功后不同時間點HMGB1水平比較 （±s, pg/ml）

注：1）與SOG組比較，t =14.203，13.014，8.520；P =0.000，0.000，0.000。2）與SAP組比較，t =0.172，11.669，0.549；P =0.867，0.000，0.595。

組別 例數(shù) 3 h 6 h 12 h SOG組 6 9.90±0.0.76 9.45±0.81 9.62±0.0.36 SAP 組 6 15.81±0.661） 17.5±0.411） 15.85±0.751）BDG組 6 15.75±0.572） 14.31±0.522） 15.64±0.0.682）

表3 3組研究對象建模成功后不同時間點HO-1水平比較 （±s, pg/ml）

表3 3組研究對象建模成功后不同時間點HO-1水平比較 （±s, pg/ml）

注：1）與SOG組比較，t =9.247，11.884，21.355；P =0.000，0.000，0.000。2）與SAP組比較，t =4.847，14.738，32.106；P =0.002，0.000，0.000。

組別 例數(shù) 3 h 6 h 12 h SOG 組 6 2 061.13±67.61 2 074.95±19.33 1 945.52±20.89 SAP 組 6 2 376.99±95.021） 2 232.38±66.851） 1 689.19±20.691）BDG組 6 2 588.84±49.282） 2 664.09±26.052） 2 303.44±42.042）

3 討論

急性胰腺炎（acute pancreatitis, AP）是由多種原因促使胰酶異常激活的胰腺急性進程的炎癥疾病,其中膽源性和酒精所致的急性胰腺炎在臨床中比較常見[1]。急性重癥胰腺炎（severe acute pancreatitis, SAP）的特點是胰腺組織壞死感染合并持續(xù)性的器官衰竭，而SAP全身炎性反應是其全身性炎性病變的基礎[2]。HMGB1是一種新型的炎性細胞因子，既往研究已經(jīng)證實HMGB1與SAP的發(fā)生與嚴重程度相關(guān)[3]。本研究結(jié)果顯示，建模成功后第3、6和12小時，SAP組HMGB1水平均高于SOG組（P＜0.05），本結(jié)果也證實了上述觀點。晚期糖基化終產(chǎn)物受體（receptor of advanced glycation end products, RAGE）是HMGB1的主要受體，RAGE與HMGB1具有高度親和力[4]，兩者結(jié)合后可同時激活兩條下游信號途徑：一條是Ras和NF-κB途徑，其涉及炎癥和應激反應；另一條Rac和cdc42途徑，其與細胞的運動性和神經(jīng)軸突生長有關(guān)[5]。Park等[6]證實HMGB1可與膜受體結(jié)合激活Toll樣受體介導的炎癥通路，使下游NF-κB表達增加，引起瀑式炎癥反應，并且HMGB1參與膿毒癥的致死效應，且該細胞因子出現(xiàn)較晚且持續(xù)時間更長[7]。TNF-α是一種由巨噬細胞分泌的細胞因子,其被證實在SAP發(fā)病機制中起重要作用，其可使NF-κB活化，進一步引起一系列炎癥反應[8-10]。本研究顯示，建模成功后第3、6和12小時SAP組TNF-α水平均顯著高于SOG組（P＜0.05），以上證實了TNF-a與SAP的嚴重程度有關(guān)。HO-1是HO的亞型，其作為一種熱休克蛋白-32，可通過抵抗細胞的凋亡和氧化從而改善機體微循環(huán)[11-12]。HO-1可催化血紅素，使血紅素正中位α碳鏈斷裂,產(chǎn)生等摩爾的膽綠素、亞鐵離子（Fe2+）和一氧化碳（CO），這3種代謝產(chǎn)物都具有抗氧化，減緩組織損傷的功能，當機體受到細胞因子、一氧化氮（NO）以及低氧等刺激產(chǎn)生氧化應激反應時，HO-1表達升高，一定程度上是通過血紅素代謝產(chǎn)物從而發(fā)揮抗炎作用[13]。本實驗結(jié)果顯示，建模成功后第3、6和12小時BDG組HO-1水平均顯著高于SAP組（P＜0.05）；而SAP組HO-1水平隨時間的延續(xù)呈下降趨勢。以上結(jié)果提示SAP組炎癥程度呈增高趨勢，并且HO-1表達的增加可抑制SAP的炎癥反應。

當前對重癥急性胰腺炎的研究主要集中于液體復蘇和抑制胰液中胰酶釋放等應用方面，對于早期膽汁外引流延緩SAP的進程尚缺乏理論依據(jù)。臨床中，以內(nèi)鏡鼻膽管引流（endoscopic nasobiliary drainage, ENBD）、內(nèi)鏡膽管支架內(nèi)引流（endoscopic retrograde biliary drainage, ERBD）為主的膽汁外引流治療方式，具有操作簡單、創(chuàng)傷小、效果明顯、并發(fā)癥少且費用低等優(yōu)點[14]。有研究證實，SAP患者行膽汁引流術(shù)后，相關(guān)炎癥因子淀粉酶等胰腺炎指標及相關(guān)炎癥因子表達水平明顯降低。Liu等[15]研究證實失血性休克大鼠和內(nèi)毒素休克大鼠行“膽汁外引流”后，大鼠的存活時間均顯著延長，同時其腸道的病理損傷顯著減輕。相關(guān)文獻報道，休克以及膿毒血癥患者或動物模型膽汁中含有多種炎性細胞，如TNF-α、HMGB1以及NF-κB等炎性因子，當膽汁引流使炎性細胞流出體外，并使炎性細胞含量降低，從而緩解患者或?qū)嶒瀯游锏难装Y狀況[16-18]。本實驗通過建立SAP大鼠模型，行早期膽汁外引流，第3、6和12小時BDG組HMGB1、TNF-a水平均低于SAP組（P ＜0.05），證實了早期膽汁外引流確實可以減少SAP大鼠血清中炎性因子的表達，調(diào)控炎癥反應，進而減緩SAP的進程，起到保護相關(guān)臟器的作用。

綜上所述，早期膽汁外引流可調(diào)控SAP患者炎癥反應，為ENBD和ENRD在SAP患者的臨床應用中提供了一定的理論依據(jù)，也為臨床中尋求更多減緩胰腺炎炎癥進程和促進機體機能快速恢復方法做出了貢獻。

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