白藜蘆醇對(duì)腸易激綜合征大鼠腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子系統(tǒng)表達(dá)的影響

張健波，朱娜萍，陳潔，劉開平，葉涵，許文，潘建春

（溫州醫(yī)科大學(xué)　藥學(xué)院，浙江 溫州 325035）

腸易激綜合征（irritable bowel syndrome，IBS）是一種以腸道不適或反復(fù)腹痛為主要特征，并且伴有排便習(xí)慣改變和糞便性狀異常的功能性胃腸疾病[1]。近期研究表明[2]，IBS除了與胃食管反流、功能性消化不良等胃腸道疾病共病外，其與應(yīng)激相關(guān)的情緒障礙疾病（如抑郁、焦慮）共病率高達(dá)30%～50%[3-4]，提示IBS與精神疾病可能存在共同的生理和病理過程。白藜蘆醇（resveratrol，RES）是一種從虎杖中提取的多酚類化合物。研究表明，RES具有鎮(zhèn)痛、抗焦慮和抑郁活性，猜測其對(duì)IBS的焦慮、抑郁樣和腸道超敏狀態(tài)有一定的治療作用[5-7]。為此，本研究探索了RES對(duì)慢急性聯(lián)合應(yīng)激（chronic acute combined stress，CACS）誘導(dǎo)的IBS大鼠可能存在的精神狀態(tài)異常和消化道功能紊亂的改善作用及其作用機(jī)制。

1　材料和方法

1.1材料

1.1.1主要藥物和試劑： RES、氟西汀（fluoxetine，F(xiàn)LU）和地西泮（diazepam，DIA）均購于美國Sigma公司。羧甲基纖維素鈉（sodium salt of caboxy methyl cellulose，CMC-Na）購于上海博蘊(yùn)生物科技有限公司。一抗腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）抗體購于英國Abcam生物公司，一抗β-actin、GAPDH抗體購于美國Bioworld生物科技公司，二抗Goat anti-Rabbit IgG（H+L）HRP購于杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司。EZ-ECL曝光液購于以色列Biological Industries公司。

1.1.2主要儀器：SCIENTZ-IID超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；SCIENTZ-48高通量組織研磨器（寧波新芝生物科技股份有限公司）；Eppendorf 5417R小型臺(tái)式冷凍型離心機(jī)（德國Eppendorf公司）；Bio-Rad小垂直板電泳槽和Bio-Rad Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）；SpectraMax 190全波長酶標(biāo)儀（美國Molecular Devices Corporation公司）。

1.1.3動(dòng)物分組和處理：42只雄性SD大鼠，體質(zhì)量150～180 g，購于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（滬）2012-0002。大鼠在室溫（23±1）℃，濕度50%±5%，自然光照，晝夜節(jié)律，自由攝食飲水條件下適應(yīng)性飼養(yǎng)4 d后隨機(jī)分為7組，每組6只，分別為正常對(duì)照組、CACS模型組、不同劑量白藜蘆醇組（10、20、40 mg/kg，i.g.）、氟西汀組（10 mg/kg，i.g.）以及地西泮組（1 mg/kg，i.p.）。RES溶于0.5% CMC-Na中，并且于給藥當(dāng)天稀釋至所需濃度，氟西汀和地西泮用0.9%氯化鈉溶液溶解。按照分組以灌胃或者腹腔注射的方式連續(xù)給藥22 d，其中正常對(duì)照組和CACS模型組大鼠按體質(zhì)量（0.5 mL/100 g）灌胃給予0.5% CMCNa。氟西汀與地西泮均為陽性對(duì)照藥，其中氟西汀用于藥物抗抑郁樣作用對(duì)照，地西泮用于藥物抗焦慮樣作用對(duì)照。

1.2方法

1.2.1大鼠CACS模型建立：除正常對(duì)照組大鼠外，其余實(shí)驗(yàn)大鼠在應(yīng)激期間孤籠飼養(yǎng)并采用CACS的方式建立模型[8-9]，即在連續(xù)給予21 d慢性不可預(yù)知應(yīng)激后，于第22 d給予實(shí)驗(yàn)大鼠3 h急性束縛應(yīng)激。其中慢性不可預(yù)知應(yīng)激包括：禁食24 h，禁水24 h，4 ℃冰水游泳5 min，45°傾斜籠子6 h，潮濕墊料6 h，光照過夜，夾尾3 min等。行為學(xué)測試于應(yīng)激結(jié)束后24 h進(jìn)行。

1.2.2強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)（forced swimming test，F(xiàn)ST）：是最常用于抗抑郁藥物療效評(píng)估的動(dòng)物模型之一[10]。在PORSOLT等[11]所描述的方法上稍加修改后進(jìn)行FST試驗(yàn)。試驗(yàn)分為兩個(gè)部分，分別為預(yù)測試階段和測試階段。預(yù)測試階段：迫使大鼠在盛有30 cm深度清水[水溫（25±1）℃]的透明圓柱形玻璃容器（直徑25 cm，高度45 cm）中游泳15 min。測試階段：在預(yù)測試結(jié)束24 h后進(jìn)入測試階段，大鼠在相同環(huán)境下進(jìn)行5 min FST測試，并用攝像機(jī)記錄該過程。由2位對(duì)實(shí)驗(yàn)不知情者統(tǒng)計(jì)5 min內(nèi)大鼠的累計(jì)不動(dòng)時(shí)間。當(dāng)大鼠停止掙扎，浮在水中保持不動(dòng)或僅做一些必要的輕微動(dòng)作保持頭部浮在水面上時(shí)即可視為不動(dòng)狀態(tài)。

1.2.3大理石掩埋實(shí)驗(yàn)（marble-burying task，MBT）：采用MBT來評(píng)估藥物的抗焦慮樣作用。參照文獻(xiàn)[12]所描述的方法稍許改動(dòng)：在鋪有5 cm厚度玉米芯墊料的盒子（45 cm×30 cm×40 cm）上以“3+3+3”的形式擺放9顆直徑為2.3 cm的玻璃彈珠。將大鼠單獨(dú)依次放入盒中，記錄大鼠10 min內(nèi)掩埋玻璃彈珠顆數(shù)，其中彈珠至少50%體積被墊料覆蓋后才能視為被掩埋。

1.2.4腸道動(dòng)力學(xué)測試：按照文獻(xiàn)[13]所述方法，評(píng)估實(shí)驗(yàn)大鼠腸道動(dòng)力。用束縛器固定大鼠，在確保大鼠不受其他傷害的條件下，限制大鼠的正?；顒?dòng)。記錄1 h內(nèi)大鼠的排便顆數(shù)。

1.2.5內(nèi)臟敏感性實(shí)驗(yàn)：采用腹壁撤退反射（abdominal withdrawal reflex，AWR）評(píng)分評(píng)價(jià)大鼠內(nèi)臟敏感程度。具體實(shí)驗(yàn)過程如下[14]：實(shí)驗(yàn)前大鼠禁食24 h、不禁水，使其排出殘余糞便。實(shí)驗(yàn)過程中大鼠用乙醚淺麻醉后，自肛門內(nèi)置入誘發(fā)刺激直腸擴(kuò)張的血管造影導(dǎo)管（導(dǎo)管上系有橡膠手指套制成的5 cm長的球囊，導(dǎo)管另一端通過三通閥連接血壓計(jì)和注射器），置入深度為6 cm。待大鼠蘇醒適應(yīng)20 min后，通過注射器注氣增加球囊壓力，并通過血壓計(jì)控制壓力分別為20、40、60、80 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）。每個(gè)不同壓力分別重復(fù)5次，每次持續(xù)20 s，不同壓力間隔4 min。由對(duì)實(shí)驗(yàn)不知情者觀察并記錄大鼠的AWR評(píng)分，評(píng)分如下：無反應(yīng)（0分）；頭部輕微晃動(dòng)（1分）；腹肌收縮（2分）；腹肌收縮和抬起（3分）；腹肌強(qiáng)烈收縮，腹部抬起和身體拱起（4分）。

1.2.6Western blot法測定海馬、額葉皮層和回腸、結(jié)腸中BDNF蛋白表達(dá)：行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，用10%水合氯醛麻醉大鼠，0.9%氯化鈉溶液灌注，斷頭剝離全腦，在-40 ℃冰板上分離出海馬和額葉皮層兩個(gè)腦區(qū)。以盲腸為標(biāo)志，盲腸以上4 cm切取回腸組織，以下6 cm切取結(jié)腸組織，并用冰0.9%氯化鈉溶液沖洗腸道內(nèi)容物。每個(gè)組織樣本加入500 μL含蛋白酶抑制劑（PMSF）的細(xì)胞裂解液（RIPA）（PMSF∶RIPA=1∶100）勻漿并靜置1.5 h使其充分裂解。在4 ℃，12000 r/min轉(zhuǎn)速下離心20 min，取出上清液后，在相同條件下再次離心取上清，并用BCA試劑盒測定上清液的蛋白濃度。各組樣本用裂解液和loading buffer（5×）配成4 μg/μL的體系，控制每組樣本上樣體積15 μL，12% SDS-PAGE凝膠電泳分離，濕法轉(zhuǎn)膜電轉(zhuǎn)1 h。室溫下0.5%脫脂牛奶封閉1.5 h，用TBST稀釋后的一抗β-actin（1∶1000稀釋）、GAPDH（1∶5000稀釋）或BDNF（1∶2500稀釋）4 ℃搖床過夜。回收一抗，洗膜（7 min×3次）結(jié)束后倒入辣根過氧化物酶偶聯(lián)的IgG二抗（1∶10000稀釋）室溫?fù)u床1 h，洗膜（7 min×3次）結(jié)束后ECL法顯色，條帶用Quantity one軟件分析。以目的蛋白（BDNF）與內(nèi)參蛋白（β-actin、GAPDH）的吸光度積分的比值表示蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。所有數(shù)據(jù)均以±s表示，正常對(duì)照組與CACS模型組間用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，藥物作用采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Dunnett’s t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1RES對(duì)CACS大鼠FST實(shí)驗(yàn)的影響 與正常對(duì)照組比，CACS模型組大鼠的不動(dòng)時(shí)間顯著增加（P＜0.01），20、40 mg/kg的RES均能明顯減少應(yīng)激后大鼠FST的不動(dòng)時(shí)間，其高劑量RES作用效果與經(jīng)典抗抑郁藥物氟西?。≒＜0.01）作用相似，該結(jié)果表明高劑量的RES能夠在一定程度上改善大鼠在CACS后所呈現(xiàn)出的抑郁樣癥狀。見圖1。

圖1　各組大鼠FST不動(dòng)時(shí)間比較（n=6）

2.2RES對(duì)CACS大鼠MBT實(shí)驗(yàn)的影響 在MBT中，CACS模型組大鼠掩埋顆數(shù)（5.00±0.63）較正常對(duì)照組大鼠（1.67±0.52）顯著增加（P＜0.01）。在給予RES或地西泮治療后可逆轉(zhuǎn)此現(xiàn)象（P＜0.01），且RES的作用呈劑量依賴性（P＜0.01）。同時(shí)結(jié)果也表明高劑量的RES（P＜0.01）在改善CACS大鼠焦慮樣表現(xiàn)的作用與陽性對(duì)照藥地西泮（P＜0.01）作用相似。見圖2。

圖2　各組大鼠大理石掩埋顆數(shù)比較（n=6）

2.3RES對(duì)CACS大鼠腸道動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)的影響在持續(xù)21 d的慢性應(yīng)激加上第22天3 h急性束縛應(yīng)激后，CACS模型組大鼠在1 h束縛后較正常對(duì)照組的排便顆數(shù)明顯增加（P＜0.01）。給予RES（10、20、40 mg/kg）和氟西汀后，大鼠排便顆數(shù)均減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），說明RES在一定程度上能改善應(yīng)激大鼠腸道動(dòng)力紊亂狀態(tài)。見圖3。

圖3　各組大鼠糞便顆數(shù)比較（n=6）

2.4RES對(duì)CACS大鼠內(nèi)臟敏感性實(shí)驗(yàn)的影響與正常對(duì)照組大鼠相比，CACS模型組大鼠在40、60、80 mmHg壓力直腸擴(kuò)張下AWR評(píng)分明顯增高（P＜0.05），表明實(shí)驗(yàn)大鼠在CACS后內(nèi)臟疼痛閾值下降，腸道敏感性增加。在給予RES治療后AWR評(píng)分不同程度降低，RES在40、60、80 mmHg壓力下均能明顯逆轉(zhuǎn)CACS大鼠AWR評(píng)分增高現(xiàn)象（P＜0.05），體現(xiàn)RES在一定程度上具有改善IBS大鼠腸道高敏狀態(tài)的作用。見圖4。

圖4　各組大鼠AWR評(píng)分比較（n=6）

2.5RES對(duì)CACS大鼠海馬、額葉皮層、回腸及結(jié)腸中BDNF表達(dá)量的影響CACS模型組大鼠腦內(nèi)海馬和額葉皮層BDNF表達(dá)水平較正常對(duì)照組明顯下降（P＜0.01），而腸道內(nèi)回腸和結(jié)腸BDNF表達(dá)水平較正常對(duì)照組明顯上升（P＜0.05）。其中較高劑量（20、40 mg/kg）RES對(duì)應(yīng)激大鼠腦內(nèi)BDNF表達(dá)水平影響顯著，而低劑量RES（10 mg/kg）則對(duì)腸道內(nèi)BDNF表達(dá)水平的影響較為明顯（P＜0.01）。見圖5。

3　討論

圖5　各組大鼠不同部位BDNF表達(dá)水平比較（n=6）

IBS是臨床上常見的功能性胃腸疾病，其疼痛癥狀的持續(xù)性，病情的反復(fù)性以及常常至少伴有一種以上的精神疾病的特點(diǎn)導(dǎo)致臨床治愈難度增加，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[15]。環(huán)境因素（應(yīng)激、飲食）、遺傳因素、生物因素（感染、腸道菌群、免疫激活）等都可能誘發(fā)或加重IBS癥狀[16]，與其他疾病的高度共病性嚴(yán)重影響了IBS的診斷和治療。CAMILLERI等[17]研究指出不同分型的IBS患者（IBSD，IBS-C，IBS-M）焦慮、抑郁評(píng)分都高于健康受試者。另據(jù)報(bào)道，大量精神疾病障礙患者出現(xiàn)腸道動(dòng)力異常、內(nèi)臟感覺過敏等腸道不適癥狀[18]，LIU等[19]研究表明抑郁癥患者和腹瀉型IBS患者存在相似的糞便菌群特征。IBS發(fā)病機(jī)制尚未明確，有報(bào)道指出展開針對(duì)腸道和中樞的藥物治療，加上心理治療，有助于減輕IBS關(guān)鍵癥狀[20]。目前IBS治療手段也由傳統(tǒng)的腸道對(duì)癥治療轉(zhuǎn)向包括患者精神狀態(tài)在內(nèi)的胃腸道和中樞相互關(guān)聯(lián)的整體治療[21]，這也揭示了維持腦-腸軸互動(dòng)穩(wěn)態(tài)在IBS治療過程中的重要性。已有眾多研究報(bào)道多酚類化合物RES在情緒障礙疾病中的作用，其中涉及對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)作用[22]、抗抑郁活性[6]以及對(duì)神經(jīng)退行性疾病的預(yù)防作用[23]等。結(jié)合IBS精神情緒方面的病理特點(diǎn)與RES的藥理作用特點(diǎn)，推測RES能夠改善IBS癥狀。而這一推測也被我們的研究所證實(shí)。本研究行為學(xué)結(jié)果表明，在經(jīng)過連續(xù)22 d CACS后，應(yīng)激大鼠在FST中的不動(dòng)時(shí)間明顯增加（P＜0.01），大理石掩埋顆數(shù)顯著增多（P＜0.01），腸道動(dòng)力測定試驗(yàn)中排便顆數(shù)增加（P＜0.01），AWR評(píng)分增加（P＜0.05）。RES連續(xù)給予22 d能明顯改善應(yīng)激大鼠抑郁、焦慮癥狀，改善腸道動(dòng)力紊亂狀態(tài)以及提高腸道疼痛閾值，分別體現(xiàn)在減少FST行為學(xué)中的不動(dòng)時(shí)間，增加大理石掩埋顆數(shù)，減少排便顆數(shù)，降低AWR評(píng)分4個(gè)行為學(xué)中。表明RES對(duì)CACS大鼠的IBS癥狀有明顯的治療作用，在一定程度上緩解IBS大鼠的消化道紊亂癥狀和抑郁焦慮情緒。

為進(jìn)一步研究RES治療IBS的分子機(jī)制，本研究檢測了BDNF在大鼠腦、腸中的表達(dá)情況。BDNF是一類能夠促進(jìn)神經(jīng)元生長和存活、再生與修復(fù)的多肽或蛋白質(zhì)[24]，是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族重要組成部分，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和胃腸道組織中廣泛表達(dá)[25]。BDNF除了參與應(yīng)激相關(guān)的情緒障礙疾病的病理生理過程外[26]，同時(shí)還與維持內(nèi)臟敏感性和調(diào)節(jié)腸道動(dòng)力相關(guān)[25]，但目前研究主要集中于BDNF對(duì)中樞或外周的單獨(dú)作用上，其在腦-腸傳導(dǎo)中的共同作用鮮有報(bào)道。GAWALI等[27]通過實(shí)驗(yàn)表明慢性不可預(yù)知應(yīng)激模型小鼠的焦慮、抑郁樣行為和認(rèn)知障礙與低BDNF水平相關(guān)。此外有大量體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)具有抗抑郁樣作用的藥物其中一作用環(huán)節(jié)就是激活BDNF系統(tǒng)表達(dá)，改善抑郁癥狀[28]。在本研究中，Western blot結(jié)果表明BDNF在CACS大鼠海馬、額葉皮層蛋白表達(dá)明顯減少。給予22 d RES灌胃給藥后，CACS大鼠海馬和額葉皮層中BDNF表達(dá)水平顯著回升，結(jié)果與上述報(bào)道一致，提示高劑量RES可能通過提升CACS大鼠腦內(nèi)BDNF水平從而發(fā)揮抗焦慮、抗抑郁的作用，從而逆轉(zhuǎn)CACS大鼠在MBT中掩埋顆數(shù)增多，F(xiàn)ST測試中不動(dòng)時(shí)間增加的行為表現(xiàn)。然而趙宏宇等[29]的研究結(jié)果表明，母嬰分離大鼠IBS模型，海馬區(qū)BDNF高表達(dá)，IBS焦慮程度提高，呈現(xiàn)與本實(shí)驗(yàn)不同的研究結(jié)果。我們推測可能是由應(yīng)激不同所導(dǎo)致的，同時(shí)也提示IBS的病因并不是單一的，需要我們進(jìn)一步的研究。無論是大鼠反復(fù)避水應(yīng)激[30]還是在CACS誘導(dǎo)[9]的IBS中，都有研究人員發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)大鼠糞便排出量增加并伴有結(jié)腸BDNF表達(dá)增加，而DELAFOY等[31]通過大鼠腹腔注射BDNF或BDNF抗體觀察其疼痛閾值改變情況的研究中，發(fā)現(xiàn)腸道內(nèi)BDNF過表達(dá)可導(dǎo)致疼痛閾值降低，腸道敏感性增強(qiáng)，以上報(bào)道分別證實(shí)IBS腸道動(dòng)力紊亂、內(nèi)臟敏感性變化與BDNF表達(dá)水平異常相關(guān)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，10 mg/kg劑量RES可以逆轉(zhuǎn)IBS大鼠回腸、結(jié)腸BDNF高表達(dá)狀態(tài)，而這一結(jié)果與RES改善應(yīng)激大鼠糞便排出量與腸道高敏狀態(tài)的劑量不完全對(duì)應(yīng)，提示IBS中勢必存在更多神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)功能的損傷，RES對(duì)IBS的治療可能涉及另外的調(diào)控機(jī)制。有研究報(bào)道指出BDNF的表達(dá)水平受cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（CREB）磷酸化水平所介導(dǎo)[32]。胞內(nèi)cAMP水平與磷酸二酯酶活性相關(guān)[23]，且RES可通過抑制磷酸二酯酶活性上調(diào)cAMP水平，從而放大由cAMP介導(dǎo)的生物效應(yīng)[33]。RES對(duì)IBS大鼠腦腸BDNF系統(tǒng)的紊亂的調(diào)節(jié)作用可能與其參與調(diào)節(jié)了cAMP-CREB-BDNF系統(tǒng)有關(guān)，但仍需要進(jìn)一步研究證實(shí)。在本研究中IBS大鼠腦、腸中BDNF表達(dá)水平相反，這一結(jié)果與YU等[9]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似，而不同劑量RES能分別逆轉(zhuǎn)BDNF在腦腸中的表達(dá)，其中可能涉及RES對(duì)腦-腸的共同調(diào)節(jié)作用，維持腦-腸互動(dòng)穩(wěn)態(tài)。

綜上所述，本研究采取CACS建立大鼠IBS模型，發(fā)現(xiàn)RES對(duì)IBS大鼠抑郁焦慮樣行為、腸道動(dòng)力紊亂及腸道高敏狀態(tài)的改善作用可能涉及了其對(duì)“腦”“腸”中BDNF表達(dá)系統(tǒng)的調(diào)控，所影響的具體信號(hào)通路有待于深入研究。

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