FISH技術(shù)檢測(cè)hTERC基因表達(dá)在宮頸病變?cè)\治中的意義

陳露露，王毓莉，周清，周凱，朱華，胡燕

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院　婦科，浙江　溫州　325015）

宮頸癌是女性第二大惡性腫瘤，每年新發(fā)病例超過(guò)150萬(wàn)，死亡人數(shù)超過(guò)30萬(wàn)[1]。近10年來(lái)發(fā)病率以每年平均約8.7%的速度遞增[2]。宮頸癌是目前唯一病因明確并可以預(yù)防的惡性腫瘤，人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）感染是本病的病因[3]，若早發(fā)現(xiàn)早治療，宮頸癌的治愈率幾乎可達(dá)100%[4]。

人類染色體端粒酶RNA（human telomerase RNA component，hTERC）基因的擴(kuò)增在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，宮頸病變向?qū)m頸癌的轉(zhuǎn)變過(guò)程中幾乎都伴有hTERC基因的異常擴(kuò)增[5-6]。本研究應(yīng)用熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）技術(shù)檢測(cè)hTERC基因在宮頸脫落細(xì)胞中的表達(dá)情況，以期為宮頸癌的篩查、診治及預(yù)后評(píng)估提供幫助。

1　資料和方法

1.1一般資料回顧性分析2014年12月至2016年10月因?qū)m頸疾病在溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院宮頸門診行FISH檢查的235例患者的HPV分型、液基細(xì)胞學(xué)（liquid-based cytology test，LCT）、陰道鏡活檢病理組織學(xué)資料。其中61例患者行FISH檢測(cè)后選擇宮頸錐切手術(shù)治療?；颊吣挲g21～77歲，平均（41.3±11.0）歲，均為已婚或有性生活史女性，非孕期，無(wú)自身免疫性疾病及全身其他惡性腫瘤病史，取材前3 d內(nèi)無(wú)性生活、陰道沖洗及用藥史。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2試劑人乳頭瘤病毒核酸分型檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海透景生命科技股份有限公司。細(xì)胞學(xué)檢查試劑及耗材均購(gòu)自美國(guó)TriPath Imaging公司。hTERC基因檢測(cè)試劑GLP TERC/CSP3探針、CSP雜交緩沖液購(gòu)自北京金菩嘉醫(yī)療科技有限公司。

1.3方法HPV分型檢測(cè)采用流式熒光雜交法。細(xì)胞學(xué)檢查采用美國(guó)BD SurePath液基細(xì)胞學(xué)制片技術(shù)。細(xì)胞學(xué)診斷采用伯塞斯達(dá)系統(tǒng)（the bethesda system，TBS），結(jié)果分為：正常范圍（negative for intraepithelial lesion or malignancy，NILM）、意義不明的不典型鱗狀細(xì)胞（atypical squamous cells of undetermined signification，ASCUS）、鱗狀上皮內(nèi)病變（squamous intraepithelial lesions，SIL）、低度鱗狀上皮內(nèi)病變（low grade squamous intraepithelial lesions，LSIL）、高度鱗狀上皮內(nèi)病變（high grade squamous intraepithelial lesions，HSIL）、鱗狀細(xì)胞癌（squamous cell carcinoma，SCC）、不典型腺上皮細(xì)胞（atypical glandular cells，AGC）、原位腺癌（adenocarcinoma in situ，AIS）、腺癌（adenocarcinoma，ACA）。細(xì)胞學(xué)陽(yáng)性診斷包括ASCUS及以上病變。陰道鏡檢查由專業(yè)的婦產(chǎn)科醫(yī)師操作。細(xì)胞學(xué)及組織病理學(xué)結(jié)果由2名專業(yè)病理科醫(yī)師盲法判讀結(jié)果。病理結(jié)果參照2013年美國(guó)陰道鏡檢查與宮頸病理學(xué)會(huì)（American Society for Colposcopy and Cervical Pathology，ASCCP）標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行診斷。hTERC基因檢測(cè)采用FISH技術(shù)，參照國(guó)內(nèi)外研究[6-9]，確立FISH閾值為5%，如hTERC基因擴(kuò)增率大于5%，即FISH檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性，提示hTERC基因異常擴(kuò)增，當(dāng)擴(kuò)增率為5%時(shí)加大觀測(cè)樣本細(xì)胞數(shù)目，以判斷最后結(jié)果。FISH結(jié)果由2名專業(yè)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員盲法判讀結(jié)果。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。細(xì)胞學(xué)類型和組織病理學(xué)級(jí)別與hTERC基因擴(kuò)增率的關(guān)系行Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)。細(xì)胞學(xué)類型和組織病理學(xué)級(jí)別與FISH檢測(cè)結(jié)果的關(guān)系行趨勢(shì)χ2檢驗(yàn)，當(dāng)出現(xiàn)任意一個(gè)格子理論頻數(shù)小于5時(shí)采用Fisher確切概率法校正。FISH檢測(cè)結(jié)果和宮頸術(shù)后病理升級(jí)情況的比較采用卡方檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1細(xì)胞學(xué)類型與hTERC基因表達(dá)情況分析細(xì)胞學(xué)類型與hTERC基因擴(kuò)增率行Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)，結(jié)果顯示組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.001），細(xì)胞學(xué)類型與FISH檢測(cè)結(jié)果關(guān)系經(jīng)趨勢(shì)χ2檢驗(yàn)，結(jié)果顯示組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.003），由表1可看出隨細(xì)胞學(xué)病變程度增加，hTERC基因異常擴(kuò)增率呈上升趨勢(shì)。

2.2陰道鏡病理與hTERC基因表達(dá)情況分析組織病理學(xué)級(jí)別與hTERC基因擴(kuò)增率行Kruskal-Wal-lis秩和檢驗(yàn)，結(jié)果顯示組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.001），組織病理學(xué)級(jí)別與FISH檢測(cè)結(jié)果關(guān)系經(jīng)趨勢(shì)χ2檢驗(yàn)，結(jié)果顯示組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。由表2可看出，隨組織病理級(jí)別的上升，hTERC基因擴(kuò)增率和異常擴(kuò)增率均呈上升趨勢(shì)。

表1　細(xì)胞學(xué)類型和hTERC基因表達(dá)的關(guān)系

2.3hTERC基因表達(dá)與術(shù)后病理升級(jí)情況分析行FISH檢測(cè)后共63例患者選擇行手術(shù)治療，其中2例FISH檢測(cè)陽(yáng)性患者的術(shù)前病理為宮頸腺癌，已為病理最高級(jí)別且該患者選擇手術(shù)方式均為宮頸癌根治術(shù)，無(wú)法評(píng)定術(shù)后病理升級(jí)情況，故未納入，對(duì)其余61例行宮頸錐形切除的患者分析其術(shù)后病理升級(jí)情況。61例患者FISH檢測(cè)結(jié)果及其相應(yīng)病理級(jí)別的分布情況詳見(jiàn)表3。

表2　陰道鏡組織病理學(xué)類型和hTERC基因表達(dá)情況

表3　FISH檢測(cè)結(jié)果及其相應(yīng)術(shù)前陰道鏡病理級(jí)別分布情況（n）

FISH檢測(cè)結(jié)果與術(shù)后病理升級(jí)情況的關(guān)系行χ2檢驗(yàn)，結(jié)果顯示組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），由表4看出hTERC基因異常擴(kuò)增患者術(shù)后病理升級(jí)率明顯高于hTERC未異常擴(kuò)增患者。

表4　FISH檢測(cè)結(jié)果和術(shù)后病理升級(jí)情況分布[ n（%）]

3　討論

hTERC基因是端粒酶的重要組成部分，定位于人染色體3q26.3，長(zhǎng)度450 bp，是合成端粒重復(fù)系列的模板，編碼的蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量為380 kDa[10]，該蛋白可以維持端粒長(zhǎng)度、調(diào)節(jié)端粒酶活性，如該基因擴(kuò)增可阻止細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致細(xì)胞的永生化和腫瘤的發(fā)生[11]。2003年，HESELMEYER-HADDAD等[9]首次研究57例LCT標(biāo)本中的hTERC基因擴(kuò)增情況，發(fā)現(xiàn)63%的宮頸上皮內(nèi)瘤變（cervical intraepithelial neopla-sia，CIN）I樣本出現(xiàn)hTERC基因擴(kuò)增，76%的CIN I I I樣本出現(xiàn)hTERC基因擴(kuò)增，認(rèn)為hTERC基因的擴(kuò)增率隨細(xì)胞學(xué)病變的加重而增多，可作為宮頸癌篩查的指標(biāo)。2008年CARAWAY等[12]研究發(fā)現(xiàn)在高級(jí)別CIN/SCC組hTERC基因擴(kuò)增率明顯高于NILM/ASCUS組。明蕾等[13]發(fā)現(xiàn)在正常組、炎癥或伴濕疣組、CIN I組、CIN I I組、CIN I I I組及宮頸鱗癌組中hTERC基因陽(yáng)性表達(dá)率分別為1.7%、2.6%、55.6%、87.5%、100%和100%。本研究表明，hTERC基因擴(kuò)增率在宮頸病變不同級(jí)別組中存在差異，隨著宮頸病變程度的加重，hTERC基因擴(kuò)增率和異常擴(kuò)增率均呈上升趨勢(shì)，與上述研究一致。

本研究通過(guò)觀察61例行宮頸錐切手術(shù)治療患者h(yuǎn)TERC基因表達(dá)情況與術(shù)后病理升級(jí)的情況，發(fā)現(xiàn)hTERC基因異常擴(kuò)增患者術(shù)后病理級(jí)別升級(jí)的可能性更大。因此在宮頸病變的早期階段檢測(cè)hTERC基因擴(kuò)增率對(duì)預(yù)測(cè)疾病的轉(zhuǎn)歸具有一定的作用，F(xiàn)ISH陽(yáng)性患者需引起重視，必要時(shí)行診斷性宮頸錐切手術(shù)。

目前臨床通用的宮頸癌篩查三階梯式診斷流程為：細(xì)胞學(xué)和（或）HPV異常則進(jìn)一步行陰道鏡檢查和（或）宮頸病理組織學(xué)活檢。宮頸脫落細(xì)胞學(xué)檢查聯(lián)合HPV檢測(cè)是宮頸癌篩查的主要手段，但脫落細(xì)胞學(xué)篩查敏感性低，存在不明意義涂片結(jié)果較多、檢測(cè)結(jié)果受觀察者主觀影響等問(wèn)題，難以作出客觀、確切的診斷[4]。HPV檢測(cè)敏感性高但特異度較低，可檢出當(dāng)時(shí)HPV感染狀態(tài)，但大多數(shù)性生活活躍的年輕婦女，HPV感染在一段時(shí)間內(nèi)可自然轉(zhuǎn)陰，導(dǎo)致HPV陽(yáng)性的預(yù)測(cè)意義較低[14]。陰道鏡下CIN的檢出率與很多因素有關(guān)，包括操作者熟練程度、檢查指征、活檢區(qū)域等，且該檢查為有創(chuàng)檢查，存在出血、感染等風(fēng)險(xiǎn)，導(dǎo)致部分患者拒絕行該項(xiàng)檢查。部分CIN患者存在因?qū)m頸病灶本身微小、可被陰道活檢完全去除的可能，對(duì)宮頸術(shù)后存在病理陰性的診斷產(chǎn)生影響[15]，提示陰道鏡作為宮頸癌篩查的方法尚存在一些不足之處。因此，需探求更特異的生物學(xué)標(biāo)記來(lái)輔助宮頸疾病的早期診斷。

FISH技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于基因定位、細(xì)胞遺傳學(xué)等領(lǐng)域，具有較高的敏感性及特異性。目前國(guó)內(nèi)外均有報(bào)道關(guān)于應(yīng)用FISH技術(shù)檢測(cè)hTERC基因在宮頸疾病的表達(dá)情況，但hTERC基因的表達(dá)情況與宮頸疾病轉(zhuǎn)歸關(guān)系的前瞻性研究報(bào)道并不多。本研究應(yīng)用FISH技術(shù)檢測(cè)hTERC基因在宮頸病變中的表達(dá)情況，為hTERC基因在宮頸疾病中的診治及預(yù)測(cè)價(jià)值提供了依據(jù)。

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