大鼠子宮去細胞化支架的制備和評價

郭芳，楊潔，陳晶晶，劉麗，陳云志，鄭飛云

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)溫州市第三臨床學(xué)院　溫州市人民醫(yī)院　婦產(chǎn)科，浙江　溫州　325000；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院　普外科，浙江　溫州　325015；3.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院　婦科，浙江　溫州325015）

試管嬰兒技術(shù)作為生殖醫(yī)學(xué)的核心技術(shù)，為絕大多數(shù)不孕癥女性帶來了福音。然而，對于那些存在先天性子宮畸形、子宮腔廣泛粘連及子宮切除術(shù)后等女性，她們?nèi)匀幻媾R著不孕的困境[1]。子宮組織再生研究無疑為子宮缺陷引起的不孕癥患者帶來了一種充滿前景的治療希望。通過去細胞化技術(shù)獲得的天然細胞外基質(zhì)支架結(jié)構(gòu)已經(jīng)在眾多器官的再生研究中發(fā)揮重要的載體作用[2-3]。本研究通過動脈灌注途徑，結(jié)合各種去細胞化技術(shù)，成功制備天然子宮去細胞化外基質(zhì)支架，經(jīng)系統(tǒng)評價和鑒定，能夠作為子宮組織再生工程的研究應(yīng)用載體。

1　材料和方法

1.1材料

1.1.1實驗動物：清潔級的健康成年雌性SD大鼠，體質(zhì)量250～300 g，由中國科學(xué)院上海實驗動物中心提供，在溫州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心SPF級實驗環(huán)境中飼養(yǎng)，動物許可證號：SYXK（浙）2015-0009，相關(guān)的喂養(yǎng)和操作均在溫州醫(yī)科大學(xué)實驗動物倫理委員會監(jiān)督下進行。

1.1.2主要試劑：0.02%胰酶（北京索萊寶科技有限公司）/0.05%EDTA（美國Sigma公司）溶液：0.25%胰酶/0.5%EDTA溶液以O(shè).1 mol/L PBS稀釋lO倍。0.1%十二烷基硫酸鈉（SDS，美國Sigma公司）溶液：SDS 1 g，加1000 mL 0.1 mol/L PBS。1%曲亞通X-100（Triton-X100，北京索萊寶科技有限公司）/O.05%EDTA溶液：Triton-X10010 mL，EDTA 500 mg，加970 mL 0.1 mol/L PBS。轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factorβ，TGF-β）、堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）的ELISA試劑盒（上海博蘊生物科技有限公司）。組織基因組DNA提取試劑盒DP304（北京天根生化科技有限公司），羥脯氨酸測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

1.1.3主要實驗器材：顯微手術(shù)器械（上海金鐘金屬制品廠）；8F、24F、28F硅膠管以及橙蓋移液瓶、藍蓋瓶（海門市盛邦實驗器材有限公司）；BTl00-2J蠕動泵（保定蘭格公司）；掃描電鏡（日本日立公司）；超凈臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；多功能動物手術(shù)臺（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院外科研究所）。

1.2方法

1.2.1大鼠子宮去細胞化支架的制作∶成年雌性SD大鼠經(jīng)3%戊巴比妥鈉（1 mL/kg）腹腔注射麻醉成功后，正中切開進腹，經(jīng)下腔靜脈注射全身肝素化后，將腸管濕紗布包裹向上推開，顯露下腹部，腹主動脈分出卵巢動脈水平以下橫斷，找到髂內(nèi)動靜脈，結(jié)扎離斷髂內(nèi)動靜脈的其他屬支，僅保留子宮動靜脈，經(jīng)髂內(nèi)動脈斷端置入10號PE管直到髂內(nèi)動脈的子宮分支開口，妥善固定，游離管道周圍的結(jié)締組織，在子宮頸水平離斷陰道，從而完整移除包括子宮以及髂內(nèi)動、靜脈之間的血管通路，浸沒于0.1 mol/L PBS液內(nèi)，經(jīng)-80 ℃凍融過夜，并采用優(yōu)化流程組合依次經(jīng)導(dǎo)管灌注0.02%胰酶/0.05%EDTA溶液（30 min）、3% Triton-X100/0.05% EDTA（240 min）、0.1% SDS溶液（30 min）處理后，去離子水和0.2 mol/L PBS溶液各沖洗15 min完成去細胞化流程，再經(jīng)0.01%過氧乙酸/4%乙醇溶液、青霉素/鏈霉素/兩性霉素B溶液消毒后備用。以上過程中流速均為室溫下5 mL/min，嚴格注意無菌操作。

1.2.2大體觀察：觀察新鮮子宮組織及灌注后各時間點（90、180、330 min）整體器官的顏色和形態(tài)學(xué)改變；灌注流程結(jié)束后通過灌注美蘭溶液（2 mL美蘭+50 mL 0.9%氯化鈉溶液）觀察去細胞化后子宮支架的脈管網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。

1.2.3基因組DNA含量檢測：正常子宮和去細胞化子宮支架分別取30 mg干重，經(jīng)蛋白酶K酶解后，提取基因組DNA，在260 nm波長處檢測各樣本的DNA吸光度（OD）值，組織DNA的含量（ng/mg）按5倍的OD值計算。

1.2.4HE染色：正常子宮及去細胞化子宮支架，經(jīng)4%多聚甲醛固定，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，浸蠟、包埋、切片，常規(guī)HE染色后光鏡下觀察。

1.2.5免疫組織化學(xué)染色：依照操作說明對新鮮子宮和去細胞化子宮支架蠟塊組織切片中的膠原蛋白I、膠原IV、纖維連接蛋白、層粘連蛋白的表達進行免疫組織化學(xué)檢測，組織切片經(jīng)3%牛血清蛋白封閉后，分批加入以0.1 mol/L PBS按l∶200稀釋的兔抗大鼠層粘連蛋白抗體、兔抗大鼠I型膠原蛋白抗體、兔抗大鼠VI型膠原蛋白抗體、兔抗大鼠纖維連接蛋白抗體，室溫孵育2 h。滴加按1∶500稀釋的生物素化山羊抗兔二抗37 ℃孵育30 min，經(jīng)DAB顯色、蘇木素復(fù)染、乙醇脫水、樹膠封片后，光鏡下觀察各型蛋白的分布及含量。

1.2.6電鏡觀察：正常子宮及去細胞化子宮支架組織，分別切成1.0 mm3大小的組織塊，4 ℃ 2.5%戊二醛固定過夜，經(jīng)PBS沖洗，鋨酸后固定，一部分組織塊醋酸鈾染色，丙酮梯度脫水，環(huán)氧樹脂包埋劑浸透，包埋，制作超薄切片，透射電鏡下觀察。取另一部分用PBS清洗3次，每次15 min，隨后將樣品在梯度系列乙醇中脫水，每個步驟15 min。然后將樣品臨界點干燥并使用Cressington Coater 108A濺射涂布機涂覆Au/Pd，掃描電鏡下觀察。

1.2.7總膠原蛋白含量檢測：準(zhǔn)確稱取80～100 mg新鮮正常子宮組織及去細胞化子宮支架組織，剪碎，水解5 h。取3～4 mL稀釋的檢測液加適量活性炭于3500 r/min離心10 min，取上清1 mL，設(shè)置空白管、標(biāo)準(zhǔn)管，根據(jù)要求分別按順序加入試劑1、試劑2、試劑3，60 ℃水浴15 min，冷卻后3500 r/min離心10 min，取上清于波長550 nm處測OD值。組織總膠原蛋白含量按羥脯氨酸的含量占總膠原蛋白含量的13.4%來估算，羥脯氨酸含量計算公式：

1.2.8ELISA法檢測EGF、bFGF、TGF-β含量：待測樣品孔加入樣本40 μL，然后分別加入抗EGF、抗bFGF和抗TGF-β抗體10 μL，均加入鏈酶親和素-HRP 50 μL，蓋上封板膜，輕輕振蕩混勻，37 ℃溫育60 min。重復(fù)洗滌5次，甩干。每孔先加入顯色劑37 ℃避光顯色10 min。每孔加終止液50 μL，450 nm波長依序測量各孔的OD值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及對應(yīng)的OD值計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程，再根據(jù)樣品的OD值在回歸方程上計算出對應(yīng)的樣品濃度。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理方法采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。所有的實驗結(jié)果均重復(fù)3次，計量資料用±s表示，2組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，2組間比較采用Mann-Whitney U檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1去細胞化灌注入路進腹后于右下腹找到髂外動脈，成功置入10號PE管直到子宮動脈分支起始處，妥善固定，并結(jié)扎離斷其余分支，見圖1。

圖1　灌注入路示意圖

2.2大體觀察灌注前正常子宮大體外觀呈條形管狀，表面覆蓋有薄層結(jié)締組織被膜，內(nèi)側(cè)可見脂肪結(jié)締組織，相互之間連接緊密。而隨著去細胞化灌注的進行，子宮各層結(jié)構(gòu)逐漸疏松，組織逐漸變白、變透明，最后得到肉眼清晰可見呈透明樣的去細胞化子宮支架組織，見圖2。

美蘭染色后可見子宮支架逐步著色，美蘭由主干脈管逐步向各分支擴散直至末端分支，去細胞化后的子宮支架脈管結(jié)構(gòu)形態(tài)完整、脈絡(luò)顯示清晰，且支架外層包膜完整保留，見圖3。

圖2　去細胞化灌注過程中不同時間點子宮的大體變化

圖3　經(jīng)子宮動脈灌注美蘭溶液的染色觀察

2.3組織DNA含量比較新鮮子宮組織和去細胞化后的子宮支架組織DNA含量分析結(jié)果顯示，DNA含量由新鮮子宮中的（1515.3±243.9）ng/mg降至去細胞化支架中的（45.6±7.3）ng/mg，DNA殘留量不到新鮮子宮的5%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。表明灌注流程能夠有效地去除子宮的實質(zhì)細胞。

2.4HE染色正常子宮組織在HE染色下可見子宮壁各層的實質(zhì)細胞形態(tài)規(guī)則，排列緊湊，結(jié)構(gòu)清晰，細胞內(nèi)核深染，而胞質(zhì)著色較淺（見圖4A）；而去細胞化子宮支架整體呈透明“蜂窩狀”，細胞外基質(zhì)成分呈網(wǎng)格狀染色，脈管主干及微小分支結(jié)構(gòu)形態(tài)保存完整，未發(fā)現(xiàn)深染的細胞核結(jié)構(gòu)（見圖4B）。

2.5膠原蛋白表達的免疫組織化學(xué)分析正常子宮中可檢測到膠原蛋白I、膠原蛋白IV、纖維連接蛋白和層粘連蛋白。經(jīng)去細胞后獲得的子宮支架，上述4種主要膠原蛋白成分均保存完好，且各型膠原蛋白所形成的纖維網(wǎng)絡(luò)形態(tài)與正常子宮基本一致，見圖5。說明本研究的灌注流程能夠完整保留細胞外基質(zhì)的各種膠原成分。

2.6總膠原蛋白含量比較總膠原蛋白含量結(jié)果顯示，與新鮮子宮組織[（0.57±0.12）μg/mg]比較，去細胞化子宮支架的羥脯胺酸含量[（0.88±0.10）μg/mg]明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），說明去細胞化后子宮支架內(nèi)的膠原蛋白保留情況比較滿意。

圖5　各型膠原蛋白的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

2.7電鏡觀察正常子宮掃描電鏡下可見實質(zhì)細胞緊密排列，透射電鏡下細胞內(nèi)可見發(fā)達的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，細胞核邊界清晰，基底膜完整，間隙較窄。而去細胞化后掃描電鏡下可見清晰的脈管網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，包含細胞外基質(zhì)的各型膠原蛋白和基底膜，透射電鏡下細胞結(jié)構(gòu)以及細胞內(nèi)大型細胞器均已消失，見圖6。

2.8EGF、bFGF、TGF-β含量比較為了評估去細胞化后子宮支架的生物活性，檢測了新鮮子宮組織和去細胞化子宮支架中EGF、bFGF、TGF-β的含量。結(jié)果顯示，經(jīng)過去細胞灌注，支架中EGF、bFGF、TGF-β的含量較新鮮組織有所下降，但仍然保留了大部分，其中TGF-β保留了54%，EGF保留了66%，而bFGF保留了85%，見圖7。說明我們制備的去細胞化子宮支架仍具有較好的生物活性。

圖6　正常子宮和去細胞化子宮支架的掃描電鏡和透射電鏡觀察結(jié)果

圖7　正常子宮和去細胞化子宮支架中EGF、bFGF、TGF-β含量檢測結(jié)果

3　討論

子宮移植雖然在臨床上的應(yīng)用才處于新興起步階段，但是對于因子宮缺如或子宮功能缺陷而不孕的女性，子宮移植相比代孕等其他方式，更符合醫(yī)學(xué)道德倫理的需要[4]。但是供體的嚴重缺乏、免疫排斥反應(yīng)等問題限制了子宮移植的臨床應(yīng)用。近年來，去細胞化支架技術(shù)作為組織再生工程的核心技術(shù)之一，被廣泛應(yīng)用于器官的重建和再造研究。由于去細胞化生物支架獲取的天然細胞外基質(zhì)，對于介導(dǎo)細胞分化與成熟時所需的生物物理刺激、生物化學(xué)信號傳遞以及空間立體結(jié)構(gòu)的形成具有極其重要的作用[5]，目前利用去細胞化技術(shù)，已經(jīng)分別實現(xiàn)了心、肝、腎以及肺等器官的去細胞與再重建的研究[6-9]。而針對子宮的去細胞化支架的制備及其應(yīng)用研究在國內(nèi)外都少有報道，本研究運用去細胞化技術(shù)，優(yōu)化灌注策略，成功制備天然的大鼠子宮去細胞化支架，經(jīng)過全面的評價，可作為子宮組織再生工程研究良好的生物載體。

有研究報道去細胞化支架制作成功的關(guān)鍵包含兩方面，一方面要徹底洗脫出灌注主體內(nèi)的細胞及細胞結(jié)構(gòu)殘留物，另一方面則是盡可能地保留灌注主體內(nèi)部的細胞外基質(zhì)成分[10]。傳統(tǒng)的去細胞化流程側(cè)重機械攪動及凍融破碎的方法，去細胞化效能低，且尚不能保證可以完整保留細胞外基質(zhì)成分，隨著去細胞化技術(shù)的日益發(fā)展，物理法、化學(xué)試劑、酶學(xué)法、滲透壓法等不同方法可以多元組合，達到不同的去細胞效果[8，11-12]。結(jié)合目前的報道我們認為，灌注前的凍融操作及胰蛋白酶水解是必要的，化學(xué)試劑主要為SDS和TritonX-100，SDS是離子型洗脫劑，對腎臟、心臟等組織較厚的器官更有效，而TritonX-100是去離子型洗脫劑，對血管、皮膚等較薄的組織效率更高[13]。因為兩者對細胞外基質(zhì)均具有一定的破壞力，因此兩者的灌注比例如何組合較為關(guān)鍵。UYGUN等[14]以不同濃度梯度的SDS作為洗脫劑，成功制備了大鼠全肝臟去細胞化支架，但去細胞化效能較低，用時較長，達5 d，而且SDS做為一種離子型洗脫劑對細胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)的破壞也相當(dāng)大。此后，SOTO-GUTIERREZ等[15]提出了新的去細胞化灌注洗脫策略，他們以3%的TritonX-100作為主要試劑，結(jié)果表明TritonX-100作為一種較溫和的非離子型洗脫劑不僅達到與SDS相近的去細胞效果，同時也相應(yīng)地減少了對細胞外基質(zhì)的破壞。因此，本研究中為了盡可能減少洗脫劑對支架的損害，選定以TritonX-100作為主要洗脫劑，聯(lián)合SDS短時間灌注的灌注洗脫策略。

對獲得的去細胞化支架的鑒定和評價結(jié)果顯示，HE染色未見支架內(nèi)細胞及細胞殘體，組織DNA含量比較分析顯示去細胞化后DNA含量為（45.6±7.3）ng/mg，較正常子宮顯著降低。細胞外基質(zhì)成分是促進細胞分化、增殖的重要媒介，是去細胞化支架具備天然生化特性的基礎(chǔ)，而我們對總膠原蛋白含量的檢測及4種主要膠原成分的免疫組織化學(xué)分析表明，去細胞化后支架內(nèi)部的細胞外基質(zhì)成分均能完整保留。而美蘭染色和電鏡觀察結(jié)果也顯示了去細胞化后支架內(nèi)部清晰的脈管網(wǎng)絡(luò)和空間微環(huán)境，進一步證明了支架內(nèi)部特有的物理性能。此外，有多個研究表明細胞外基質(zhì)還包含促進細胞黏附和組織結(jié)構(gòu)整合、修復(fù)、增生的許多生長因子和生物誘導(dǎo)因子[16-17]。為了進一步評價支架的生物活性，我們檢測了支架內(nèi)部生長因子EGF、bFGF、TGF-β含量，結(jié)果表明去細胞化支架能夠較好地保留其內(nèi)部EGF、bFGF、TGF-β等生物活性因子，這些生長因子在血管生成中是必需的，能夠促進血管發(fā)生、細胞發(fā)育、神經(jīng)元生長和再生免疫調(diào)解[18]。

綜上分析，我們的去細胞化策略能夠成功制備理想的去細胞化子宮支架，并且該支架保留了促進細胞分化、成熟的細胞外基質(zhì)和脈管微環(huán)境，具有良好的生物活性，能夠作為子宮組織再生工程研究領(lǐng)域中良好的應(yīng)用載體，未來亦有望以去細胞化支架為基礎(chǔ)重建再生子宮組織，為子宮缺陷引起的不孕癥患者提供一種可能的治療方式。

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