丹參酮ⅡA抗乳腺癌細(xì)胞增殖的環(huán)氧合酶-2通路研究

趙俊云,楊曉敏,趙丕文

(北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029)

丹參酮ⅡA是從中藥丹參(Salvia miltiorrhiza Bunge)及其同屬植物中分離得到的一類脂溶性化合物，其在體內(nèi)外都表現(xiàn)出較好的抗腫瘤活性，可抑制包括乳腺癌、肺癌、肝癌、白血病、胃癌、結(jié)腸癌、前列腺癌等在內(nèi)的多種腫瘤細(xì)胞株的體外增殖[1-7]。本研究旨在探討丹參酮ⅡA對(duì)乳腺癌細(xì)胞系T47D、MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞增殖的影響，并從環(huán)氧合酶-2(COX-2)的表達(dá)及其主要轉(zhuǎn)錄因子核因子-κB(NF-κB)、激活蛋白-1(AP-1)的活性探討丹參酮ⅡA抑制乳腺癌細(xì)胞增殖的分子機(jī)制。

1　實(shí)驗(yàn)資料

1.1實(shí)驗(yàn)材料丹參酮ⅡA購自成都曼思特生物科技有限公司；塞來昔布(Celecoxib)購自Pfizer Pharmaceuticals LLC；乳腺癌細(xì)胞系T47D、MCF-7、MDA-MB-231、5種質(zhì)粒(pCOX2-Luc、pNFκB-Luc 、pAP1-Luc、pRL-CMV、EGFP質(zhì)粒)均為本實(shí)驗(yàn)室保存；Anti-human COX-2 antibody 購自Cell Signaling Technology；DMEM/High Glucose購自Hyclone；Fetal Bovine Serum、0.25%Trypsin-EDTA、Anti-anti、Lipofectamine 2000 Reagent均購自Invitrogen；MTT干粉購自Sigma；Dual-Luciferase Reporter Assay System購自Promega；LB液體培養(yǎng)基(干粉)、氨芐青霉素干粉、卡那霉素干粉均購自北京索萊寶科技有限公司；無內(nèi)毒素質(zhì)粒小提試劑盒購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.2主要儀器細(xì)胞培養(yǎng)箱(Binder生產(chǎn)，型號(hào)：XMTG-908)，超凈工作臺(tái)(北京昌平長(zhǎng)城空氣凈化工程公司生產(chǎn))，倒置顯微鏡(Olympus生產(chǎn)，型號(hào)：CKX41)，酶標(biāo)儀(Tecan生產(chǎn)，型號(hào)：Safire2)，高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf生產(chǎn)，型號(hào)：3K15)，熒光顯微鏡(Nikon生產(chǎn)，型號(hào)：TE2000)，發(fā)光檢測(cè)儀(Promega生產(chǎn)，型號(hào)：Glomax Multi Detection System)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1MTT實(shí)驗(yàn)常規(guī)培養(yǎng)T47D、MCF-7、MDA-MB-231，使用含EDTA的0.25%胰蛋白酶工作液消化細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液，于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔接種200 μL細(xì)胞懸液，每孔約含4×104個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24 h。除對(duì)照組外，丹參酮ⅡA 1～5組分別加入丹參酮ⅡA至終濃度為10-6mol/L、5×10-6mol/L、10-5mol/L、5×10-5mol/L 、10-4mol/L，每組設(shè)5復(fù)孔。分別于培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后加入終濃度為0.5 mg/mL的MTT，孵育4～6 h后，每孔吸棄上清液100 μL，每孔加入150 μL DMSO，避光混勻15 min，酶標(biāo)儀檢測(cè)OD570，計(jì)算抑制率。

1.3.2Westernblot檢測(cè)常規(guī)培養(yǎng)T47D、MCF-7、MDA-MB-231，使用含EDTA的0.25%胰蛋白酶工作液消化細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液，于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔接種2 mL細(xì)胞懸液，每孔約含5×105個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24 h。除對(duì)照組外，丹參酮ⅡA組分別加入丹參酮ⅡA至終濃度為5×10-5mol/L；于培養(yǎng)48 h后裂解細(xì)胞，提取總蛋白，定量后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，使用PVDF膜進(jìn)行轉(zhuǎn)移電泳，封閉后，加入稀釋后的Anti-human COX-2 antibody孵育過夜，二抗孵育1 h后曝光顯影。

1.3.3脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)按照常規(guī)方法擴(kuò)增質(zhì)粒，pCOX2-Luc、pNFκB-Luc、pAP1-Luc、pRL-CMV使用含0.1 mg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液，EGFP質(zhì)粒使用含0.05 mg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)液。搖床培養(yǎng)菌液24 h后，按照無內(nèi)毒素質(zhì)粒小提試劑盒說明抽提質(zhì)粒，使用紫外分光光度計(jì)測(cè)定各種質(zhì)粒的純度及濃度，-20 ℃保存?zhèn)溆?。?6孔板中每孔接種200 μL細(xì)胞懸液，每孔約含8×104個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后，細(xì)胞密度達(dá)90%左右時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將EGFP質(zhì)粒與適量轉(zhuǎn)染試劑用無血清無抗生素DMEM混勻，室溫孵育20 min后，按比例加入96孔板中，并設(shè)5孔未經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為對(duì)照組。培養(yǎng)36 h后于熒光顯微鏡下觀察綠色熒光，估計(jì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率。于48孔板中每孔接種250 μL細(xì)胞懸液，每孔約含2×105個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后，細(xì)胞密度達(dá)90%左右時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將pCOX2-Luc與pRL-CMV分別按10∶1，100∶1，1 000∶1比例混合，再用無血清無抗生素DMEM與適量轉(zhuǎn)染試劑混勻，室溫孵育20 min后，按比例加入48孔板中，并設(shè)5孔未經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為對(duì)照。同樣方法進(jìn)行pNFκB-Luc與pRL-CMV、pAP1-Luc與pRL-CMV雙轉(zhuǎn)染。

1.3.4雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)培養(yǎng)48 h后，按Dual-Luciferase Reporter Assay System說明處理細(xì)胞，在發(fā)光檢測(cè)儀上分別讀取螢火蟲熒光素酶與海腎熒光素酶活性數(shù)值，計(jì)算比值。選取適當(dāng)?shù)馁|(zhì)粒比例，再次進(jìn)行細(xì)胞的雙質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，同時(shí)加入一定量的丹參酮ⅡA處理，培養(yǎng)48 h后，在發(fā)光檢測(cè)儀上讀取熒光素酶活性數(shù)值，計(jì)算比值。

2　結(jié)　　果

2.1丹參酮ⅡA對(duì)乳腺癌細(xì)胞體外增殖的影響MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，丹參酮ⅡA對(duì)T47D、MCF-7、MDA-MB-231的體外增殖有抑制作用，且抑制率與丹參酮ⅡA的濃度及作用時(shí)長(zhǎng)呈正相關(guān)。見表1～3。綜合考慮藥效及細(xì)胞存活數(shù)量，選取抑制率接近50%的5×10-5mol/L作用48 h作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)中丹參酮ⅡA的濃度與作用時(shí)長(zhǎng)。

表1　丹參酮ⅡA對(duì)T47D增殖的影響

表2　丹參酮ⅡA對(duì)MCF-7增殖的影響

表3　丹參酮ⅡA對(duì)MDA-MB-231增殖的影響

2.2丹參酮ⅡA對(duì)乳腺癌細(xì)胞COX-2蛋白水平的影響使用終濃度為5×10-5mol/L的丹參酮ⅡA處理3種乳腺癌細(xì)胞48 h后，與對(duì)照組相比，3種細(xì)胞中COX-2的蛋白水平均明顯降低。見圖1。

圖1　3種乳腺癌細(xì)胞中COX-2蛋白表達(dá)水平

2.3丹參酮ⅡA對(duì)乳腺癌細(xì)胞COX-2轉(zhuǎn)錄活性的影響使用終濃度為5×10-5mol/L的丹參酮ⅡA處理轉(zhuǎn)染(pCOX2-Luc∶pRL-CMV=100∶1)后的3種乳腺癌細(xì)胞48 h后，與對(duì)照組相比，T47D和MCF-7細(xì)胞丹參酮ⅡA組的比值顯著降低(P均<0.05)。見表4。

表4　丹參酮ⅡA對(duì)乳腺癌細(xì)胞COX-2轉(zhuǎn)錄活性的影響

注：①與對(duì)照組比較，P<0.05。

2.4丹參酮ⅡA對(duì)乳腺癌細(xì)胞NF-κB活性的影響使用終濃度為5×10-5mol/L的丹參酮ⅡA處理轉(zhuǎn)染(pNFκB-Luc∶pRL-CMV=1 000∶1)后的3種乳腺癌細(xì)胞48 h后，與對(duì)照組相比，T47D和MCF-7細(xì)胞丹參酮ⅡA組的比值顯著降低(P均<0.05)。見表5。

表5　丹參酮ⅡA對(duì)乳腺癌細(xì)胞NF-κB活性的影響

注：①與對(duì)照組比較，P<0.05。

2.5丹參酮ⅡA對(duì)乳腺癌細(xì)胞AP-1活性的影響使用終濃度為5×10-5mol/L的丹參酮ⅡA處理轉(zhuǎn)染(pAP1-Luc∶pRL-CMV=1 000∶1)后的3種乳腺癌細(xì)胞48 h后，與對(duì)照組相比，3種細(xì)胞丹參酮ⅡA組的比值均顯著降低(P均<0.05)。見表6。

表6　丹參酮ⅡA對(duì)乳腺癌細(xì)胞AP-1活性的影響

注：①與對(duì)照組比較，P<0.05。

3　討　　論

丹參酮ⅡA是一種被證實(shí)具有抗腫瘤活性的中藥小分子單體化合物，可通過抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移等多途徑發(fā)揮抗腫瘤作用，其與某些化療藥物合用有減毒增效的作用[1-7]。本研究使用了3種乳腺癌細(xì)胞系，其中T47D和MCF-7是雌激素受體陽性細(xì)胞系，MDA-MB-231是三陰性細(xì)胞系，這3種乳腺癌細(xì)胞均有COX-2高表達(dá)的特性。丹參酮ⅡA等中藥單體對(duì)乳腺癌細(xì)胞系的抑制作用與雌激素受體陽性與否并無明顯關(guān)系。因此本文著重探討丹參酮ⅡA對(duì)與腫瘤密切相關(guān)的炎癥通路COX-2的抑制作用，進(jìn)一步闡明丹參酮ⅡA的抗腫瘤機(jī)制。

乳腺癌是女性最為常見的惡性腫瘤之一，乳腺癌的預(yù)防、早期發(fā)現(xiàn)及治療可有效降低群體發(fā)病率和提高患者生存質(zhì)量。目前乳腺癌的治療手段主要有手術(shù)治療、放化療、生物治療等，對(duì)乳腺癌進(jìn)行早期篩查診斷，并輔以抗腫瘤天然藥物干預(yù)，可有效改善患者的生存質(zhì)量。本研究結(jié)果顯示丹參酮ⅡA可有效抑制乳腺癌細(xì)胞的體外增殖，且呈明顯的量效關(guān)系和時(shí)間依賴性，其中終濃度5×10-6mol/L的丹參酮ⅡA處理乳腺癌細(xì)胞48 h后能達(dá)到近50%的抑制率，較低的濃度及其適當(dāng)?shù)钠鹦r(shí)間顯示了丹參酮ⅡA在腫瘤治療中的應(yīng)用前景。COX-2是COX家族的重要成員。COX主要有3種同工酶，其中COX-1是一種持續(xù)表達(dá)的結(jié)構(gòu)酶，發(fā)揮看家作用，主要調(diào)節(jié)生理性前列腺素合成[8]；COX-3是一種新型剪接異構(gòu)體，與COX-1源于同一基因，主要在心、腦組織持續(xù)表達(dá)[9]；COX-2又稱誘導(dǎo)型環(huán)氧化酶，在正常生理狀態(tài)下多數(shù)組織不表達(dá)或低表達(dá)，但在生長(zhǎng)因子、內(nèi)毒素及腫瘤促進(jìn)因子的作用下呈誘導(dǎo)性表達(dá)，尤其是在腫瘤組織中，COX-2的表達(dá)普遍有增強(qiáng)趨勢(shì)[8]。除此之外，COX-2還是重要的細(xì)胞凋亡抑制因子，與腫瘤細(xì)胞的命運(yùn)密切相關(guān)。大量研究表明，COX-2可通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、抑制腫瘤細(xì)胞凋亡、促進(jìn)腫瘤血管形成以及增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，從而促進(jìn)腫瘤的形成與發(fā)展[10-12]。相關(guān)臨床資料也表明，COX-2 與腫癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移關(guān)系密切, 對(duì)于腫瘤的早期診斷及預(yù)后預(yù)測(cè)有重要意義, 是多種腫瘤治療藥物的重要靶點(diǎn)之一[13]。COX-2抑制劑目前已廣泛應(yīng)用于腫瘤的臨床治療。本研究發(fā)現(xiàn)，丹參酮ⅡA可顯著降低乳腺癌細(xì)胞COX-2的蛋白水平，且在啟動(dòng)子水平有效抑制COX-2的轉(zhuǎn)錄，這顯示了丹參酮ⅡA在抑制乳腺癌發(fā)展、轉(zhuǎn)移以及預(yù)防中的應(yīng)用前景。與T47D、MCF-7不同，MDA-MB-231在COX-2轉(zhuǎn)錄水平上的降低不顯著，提示雌激素受體存在與否與丹參酮ⅡA對(duì)COX-2轉(zhuǎn)錄水平的影響有相關(guān)性。

COX-2基因的啟動(dòng)子序列上游除1個(gè)保守的啟動(dòng)子序列TATA盒以外，還包含一些早期應(yīng)答相關(guān)的順式作用元件，如轉(zhuǎn)錄因子NF-κB、AP-1的結(jié)合位點(diǎn)[8]。NF-κB可調(diào)控參與免疫反應(yīng)早期和炎癥反應(yīng)各階段的許多分子的調(diào)控，包括COX-2。AP-1是炎癥、腫瘤等情況下調(diào)節(jié)COX-2表達(dá)的重要轉(zhuǎn)錄因子，主要以磷酸化c-jun/c-fos二聚體形式與AP-1位點(diǎn)結(jié)合進(jìn)而增強(qiáng)COX-2的轉(zhuǎn)錄水平[14]。本研究中使用位點(diǎn)質(zhì)粒pAP1-Luc和pNFκB-Luc，可以直觀顯示發(fā)揮轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)作用的NF-κB、AP-1位點(diǎn)的活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示丹參酮ⅡA可有效降低乳腺癌細(xì)胞中該位點(diǎn)的活性。值得注意的是，丹參酮ⅡA主要對(duì)AP-1位點(diǎn)的活性有顯著降低，對(duì)于MDA-MB-231中NF-κB位點(diǎn)的活性無明顯改變，結(jié)合上述結(jié)果，可以推測(cè)丹參酮ⅡA作用于MDA-MB-231的機(jī)制不同于T47D、MCF-7，這是否與雌激素受體有無相關(guān)還有待驗(yàn)證。對(duì)于轉(zhuǎn)錄因子NF-κB、AP-1對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖的影響及丹參酮ⅡA對(duì)其的干預(yù)，還將在后續(xù)工作中進(jìn)一步探討。

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