salen-Mn通過(guò)LKB1/AMPK信號(hào)通路抑制膀胱癌T24細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化

寇　博,劉　偉,寇青山

(1西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部第一附屬醫(yī)院心血管外科,西安　710061;2西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部第一附屬醫(yī)院泌尿外科;3咸陽(yáng)市第一人民醫(yī)院體檢中心;*通訊作者,E-mail:821957325@qq.com)

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最為常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。一般將膀胱癌分為非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌和肌層浸潤(rùn)性膀胱癌兩種。據(jù)報(bào)道,10%-20%的非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌會(huì)進(jìn)展為肌層浸潤(rùn)性膀胱癌,而肌層浸潤(rùn)性膀胱癌的特點(diǎn)是進(jìn)展快,且生存率低,易發(fā)生轉(zhuǎn)移[1,2]。當(dāng)膀胱癌發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移時(shí),其5年存活率不超過(guò)10%[3]。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是指上皮細(xì)胞變?yōu)殚g質(zhì)細(xì)胞,并具備間質(zhì)細(xì)胞特性的一種生物學(xué)現(xiàn)象,也是腫瘤細(xì)胞能夠局部浸潤(rùn)和遠(yuǎn)處遷移的重要機(jī)制。腫瘤細(xì)胞可以通過(guò)EMT來(lái)獲取間質(zhì)細(xì)胞的侵襲性,并浸潤(rùn)至鄰近組織,隨后遠(yuǎn)處種植形成轉(zhuǎn)移病灶[4]。由此可知,抑制EMT是抗腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的研究方向之一。

Schiff堿是一類含有碳氮雙鍵的化合物,根據(jù)碳氮雙鍵的數(shù)目將其分為三類:希夫堿,雙希夫堿(salen)以及大環(huán)希夫堿[5]。由于希夫堿含有碳氮雙鍵,其可以和多種金屬離子配合,并形成金屬配合物。這些金屬配合物具有抑菌、抑癌、抗炎等多種作用[6]。salen是一類含有兩個(gè)碳氮雙鍵的希夫堿化合物,于1889年首次被Combers等學(xué)者合成。目前,關(guān)于金屬salen配合體在腫瘤內(nèi)的研究較少,且尚無(wú)其對(duì)膀胱癌細(xì)胞作用的報(bào)道。本研究旨在探究salen-Mn(錳-雙希夫堿復(fù)合物)對(duì)膀胱癌侵襲轉(zhuǎn)移的作用及其機(jī)制,以期為salen-Mn的臨床應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　細(xì)胞培養(yǎng)和主要試劑

人膀胱癌T24細(xì)胞為西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院公共平臺(tái)實(shí)驗(yàn)室所保有,salen-Mn由西安交通大學(xué)藥學(xué)院合成。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司,Transwell小室購(gòu)于美國(guó)Millcell公司,X-tremeGene siRNA轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自Roche公司,單克隆抗體E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、p-LKB1、LKB1、p-AMPK、AMPK、β-actin購(gòu)自美國(guó)CST公司,PCR引物、反轉(zhuǎn)錄試劑盒均由日本Takara公司合成。

細(xì)胞常規(guī)用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng),培養(yǎng)基預(yù)先加入青霉素(100 U/ml)和鏈霉素(100 U/ml),置于37℃、含5% CO2的細(xì)胞孵育箱內(nèi)培養(yǎng)。細(xì)胞需要定期換液,待細(xì)胞密度長(zhǎng)至80%-90%可傳代。

1.2　MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力

膀胱癌T24細(xì)胞經(jīng)消化重懸后以每孔1×104個(gè)接種到96孔板內(nèi),設(shè)置5個(gè)平行孔。待細(xì)胞密度長(zhǎng)至90%時(shí)給予不同濃度的salen-Mn處理(1.25,2.5,5.0,10,20,30 μmol/L),在37 ℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h,每孔加入含20 μl MTT和180 μl培養(yǎng)基的混液并繼續(xù)培養(yǎng)4 h,棄廢液后每孔加入150 μl DMSO,漩渦振蕩器振蕩10 min,在490 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)細(xì)胞的OD值。

1.3　細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力

細(xì)胞經(jīng)胰酶消化重懸后接種至6孔板內(nèi),待細(xì)胞密度長(zhǎng)至90%,用滅菌PBS緩沖液清洗,并用200 μl槍頭沿直線劃痕,加入2 ml無(wú)血清培養(yǎng)基并作相應(yīng)處理,顯微鏡下觀察并拍照。

1.4　Transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力

細(xì)胞經(jīng)胰酶消化,用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基重懸,并用計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。將Transwell小室置于24孔板內(nèi),其上室加入200 μl含3×104的T24細(xì)胞,并加入salen-Mn處理,而24孔板內(nèi)則加入800 μl含10%胎牛血清的培養(yǎng)基。隨后在37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h,取出后用4%多聚甲醛固定10 min,0.1%結(jié)晶紫染液染色10 min,PBS緩沖液清洗后,用棉簽擦拭Transwell上室以及側(cè)壁,最后用倒置顯微鏡下觀察,選擇5個(gè)隨機(jī)視野拍照計(jì)數(shù),統(tǒng)計(jì)分析。

1.5　Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力

在Transwell上室預(yù)先加入60 μl的Matrigel混液(Matrigel ∶無(wú)血清培養(yǎng)基=1 ∶5),后續(xù)處理同Transwell遷移實(shí)驗(yàn)。最后也需用倒置顯微鏡觀察,選擇5個(gè)隨機(jī)視野拍照計(jì)數(shù),統(tǒng)計(jì)分析。

1.6　實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)基因轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)變化

細(xì)胞經(jīng)處理后用Trizol法提取總RNA,定量后按照Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書合成cDNA。PCR所需引物由日本Takara公司合成。引物序列為E-cadherin正義5′-CGAGAGCTACACGTTCACGG-3′,反義5′-GGGTGTCGAGGGAAAAATAGG-3′;N-cadherin正義5′-TCAGGCGTCTGTAGAGGCTT-3′,反義5′-ATGCACATCCTTCGATAAGACTG-3′;Vimentin正義5′-GACGCCATCAACACCGAGTT-3′,反義5′-CTTTGTCGTTGGTTAGCTGGT-3′;β-actin正義5′-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3′,反義5′-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3′。隨后通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR進(jìn)行擴(kuò)增,并利用BioRad CFX Manager軟件進(jìn)行定量分析。

1.7　Western檢測(cè)蛋白水平的表達(dá)變化

細(xì)胞經(jīng)處理后用PBS緩沖液清洗,棄廢液,用RIPA裂解液裂解細(xì)胞。離心后提取上清蛋白,并行蛋白定量。取15 μg變性后的蛋白樣品行聚丙烯酰胺凝膠電泳,用PVDF膜轉(zhuǎn)膜2 h,5%脫脂奶粉封閉1 h,隨后加入一抗(稀釋比例均為1 ∶1 000)4 ℃孵育過(guò)夜。TBST液洗膜3次,每次5 min,再室溫孵育二抗(稀釋比例1 ∶1 000)1 h。TBST液洗膜3次,每次5 min,滴加顯影液(美國(guó)Bio-Rad公司)顯影,用凝膠成像軟件Image Lab(美國(guó)Bio-Rad公司)分析。

1.8　siRNA轉(zhuǎn)染用于靶基因的表達(dá)沉默

取兩個(gè)1.5 ml無(wú)酶離心管,各加入100 μl無(wú)血清培養(yǎng)基,隨后1個(gè)離心管內(nèi)加入2 μl LKB1的siRNA試劑,另1個(gè)離心管內(nèi)加入10 μl X-treme GENE siRNA轉(zhuǎn)染試劑,吹打混勻后均靜置5 min,隨后兩離心管內(nèi)混液混勻再靜置15 min,加入至6孔板內(nèi),補(bǔ)足培養(yǎng)基至2 ml,在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h,再做后續(xù)的細(xì)胞劃痕、Transwell侵襲遷移以及Western blot等實(shí)驗(yàn)。

1.9　統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)通過(guò)GraphPad 5.2軟件進(jìn)行分析,并用均值±標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)表示。組間差異采用t檢驗(yàn),P<0.05視為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1　salen-Mn對(duì)膀胱癌細(xì)胞增殖的影響

首先通過(guò)MTT檢測(cè)salen-Mn對(duì)膀胱癌細(xì)胞的增殖能力以排除增殖對(duì)salen-Mn的抗侵襲遷移能力影響。結(jié)果顯示salen-Mn可以劑量依賴性地抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖(見(jiàn)圖1)。且在濃度≤10 μmol/L時(shí)salen-Mn對(duì)膀胱癌細(xì)胞的抑制率小于10%,因此選取10 μmol/L作為salen-Mn在膀胱癌侵襲遷移作用的用藥濃度。

A.細(xì)胞的活性變化　 　　　B.生長(zhǎng)抑制率　圖1　MTT法檢測(cè)salen-Mn對(duì)膀胱癌T24細(xì)胞增殖的影響Figure 1　Effect of salen-Mn on the proliferation of human bladder cancer T24 cells by MTT

2.2　salen-Mn對(duì)膀胱癌細(xì)胞侵襲遷移的影響

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)提示,salen-Mn處理組的劃痕間距明顯寬于未處理組(見(jiàn)圖2A)。而隨后的Transwell遷移實(shí)驗(yàn)則顯示salen-Mn處理組的遷移細(xì)胞數(shù)少于其對(duì)照組,這充分提示salen-Mn可以抑制膀胱癌T24細(xì)胞的遷移能力(見(jiàn)圖2B)。而Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)則顯示salen-Mn處理組的侵襲細(xì)胞數(shù)少于其對(duì)照組,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見(jiàn)圖2B)。說(shuō)明salen-Mn也能夠抑制膀胱癌T24細(xì)胞的侵襲能力。

A.細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)　　　　　　　　　　　　B.Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)(與對(duì)照比較，*P<0.000 1)圖2　salen-Mn作用24 h對(duì)膀胱癌T24細(xì)胞侵襲遷移的影響Figure 2　Effect of salen-Mn on migration and invasion of human bladder cancer cells

2.3　salen-Mn對(duì)膀胱癌細(xì)胞EMT的影響

實(shí)時(shí)定量PCR顯示,salen-Mn可以上調(diào)E-cadherin的mRNA水平,同時(shí)下調(diào)N-Cadherin和Vimentin的mRNA水平(P<0.05,見(jiàn)圖3A)。隨后通過(guò)Western blot進(jìn)一步檢測(cè)salen-Mn處理后的EMT指標(biāo)蛋白水平的變化。結(jié)果顯示,膀胱癌T24細(xì)胞經(jīng)salen-Mn處理后,細(xì)胞內(nèi)的E-cadherin蛋白表達(dá)上調(diào),而N-Cadherin和Vimentin蛋白水平則呈劑量依賴性的下調(diào)(見(jiàn)圖3B)。這表明salen-Mn能抑制膀胱癌T24細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。

A. PCR結(jié)果　 　　B. Western blot結(jié)果圖3　salen-Mn對(duì)膀胱癌T24細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響Figure 3　Effect of salen-Mn on epithelial-mesenchymal transition of human bladder cancer cells

2.4　LKB1/AMPK信號(hào)通路參與了salen-Mn對(duì)膀胱癌EMT和侵襲遷移的調(diào)控

通過(guò)Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)LKB1/AMPK信號(hào)通路蛋白在salen-Mn處理的T24細(xì)胞內(nèi)的表達(dá),結(jié)果顯示p-LKB1和p-AMPK蛋白水平呈逐漸升高,而總LKB1和AMPK并無(wú)變化(見(jiàn)圖4A)。隨后用siRNA轉(zhuǎn)染技術(shù)敲低LKB1,結(jié)果顯示salen-Mn所引起的E-cadherin上調(diào)會(huì)被抑制,而N-cadherin的下調(diào)會(huì)有所回復(fù)(見(jiàn)圖4B)。隨后通過(guò)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)我們進(jìn)一步得知LKB1的敲低可以一定程度上逆轉(zhuǎn)salen-Mn對(duì)膀胱癌T24細(xì)胞的抗侵襲遷移作用(見(jiàn)圖4C和D)。這提示salen-Mn通過(guò)LKB1/AMPK信號(hào)通路抑制膀胱癌T24細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和侵襲遷移。

3　討論

文獻(xiàn)報(bào)道salen-Mn衍生物對(duì)癌細(xì)胞的細(xì)胞毒作用強(qiáng)于正常細(xì)胞[7],這說(shuō)明salen-Mn對(duì)癌細(xì)胞的高選擇性。salen-Mn可以誘導(dǎo)乳腺癌MCF7細(xì)胞的凋亡[7]。而在結(jié)腸癌CCL228細(xì)胞中salen-Mn可以促進(jìn)線粒體內(nèi)的細(xì)胞色素轉(zhuǎn)位至胞質(zhì)內(nèi),并增加caspase3/7的活性[8]。在本研究中salen-Mn可以顯著抑制膀胱癌T24細(xì)胞的增殖,以及侵襲轉(zhuǎn)移。多項(xiàng)研究證實(shí)EMT在膀胱癌的侵襲轉(zhuǎn)移中扮演著重要的角色[9]。有學(xué)者通過(guò)免疫組織化學(xué)以及PCR檢測(cè)了膀胱癌組織中EMT指標(biāo)的變化,結(jié)果顯示膀胱癌組織中E-cadherin表達(dá)水平下調(diào),而Snail、Slug等間質(zhì)性指標(biāo)則表達(dá)升高,且與腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)關(guān)系[10,11]。而本研究則通過(guò)Western blot和實(shí)時(shí)定量PCR證實(shí)salen-Mn可以抑制膀胱癌細(xì)胞T24的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,這進(jìn)一步表明salen-Mn具有抗侵襲轉(zhuǎn)移作用。

關(guān)于金屬-salen抗癌機(jī)制尚不十分明確。研究顯示金屬-salen復(fù)合物合可以下調(diào)Wnt-1的表達(dá),進(jìn)而降解細(xì)胞內(nèi)的β-catenin,從而導(dǎo)致肝癌細(xì)胞的增殖受到抑制[12]。同時(shí)金屬-salen復(fù)合物也可以誘導(dǎo)DNA損傷,使癌細(xì)胞增殖受限[13,14]。而在本研究中salen-Mn可以上調(diào)p-LKB1和p-AMPK蛋白的表達(dá)。LKB1是一種抑癌基因,大量文獻(xiàn)表明LKB1可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡和周期阻滯[15,16]。也有文獻(xiàn)報(bào)道LKB1/AMPK可以參與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程[17]。LKB1的敲低可以上調(diào)EMT指標(biāo)snail的表達(dá)[18]。在本研究中LKB1的敲低可以逆轉(zhuǎn)salen-Mn所引起的E-cadherin的上調(diào),以及N-cadherin的下調(diào)。salen-Mn對(duì)膀胱癌T24細(xì)胞侵襲遷移的抑制作用一定程度上被LKB1的敲低所逆轉(zhuǎn)。這說(shuō)明salen-Mn對(duì)膀胱癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化以及侵襲遷移的調(diào)控是由LKB1介導(dǎo)。

總之,salen-Mn能夠抑制膀胱癌T24細(xì)胞的侵襲遷移,也能夠逆轉(zhuǎn)膀胱癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,且salen-Mn極有可能是通過(guò)上調(diào)LKB1/AMPK信號(hào)通路來(lái)發(fā)揮其抗侵襲轉(zhuǎn)移作用。

圖4　LKB1/AMPK信號(hào)通路參與了salen-Mn對(duì)EMT和侵襲遷移的調(diào)控Figure 4　LKB1/AMPK signaling is involved in the regulation of salen-Mn on epithelial-mesenchymal transition, migration and invasion of human bladder cancer cells

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