特發(fā)性矮小患兒IGFBP-3 mRNA表達(dá)及基因外顯子突變的研究

李　靜,楊曉麗,高愛梅

(山西省人民醫(yī)院兒科,太原　030012;*通訊作者,E-mail:yangxlsx1989@163.com)

特發(fā)性矮小(idiopathic short stature,ISS)是一種暫時(shí)尚無明確原因的矮身材,其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。身高的線性增長(zhǎng)受營(yíng)養(yǎng)代謝軸和下丘腦生長(zhǎng)激素-胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(GH-IGF-1)軸的調(diào)節(jié),其中GH-IGF-1軸是調(diào)節(jié)兒童生長(zhǎng)發(fā)育中最重要的內(nèi)分泌通路[1]。研究顯示,生長(zhǎng)激素受體(growth hormone receptor,GHR)、矮小同源盒(short stature homeobox containing,SHOX)、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1受體(IGF-1 receptor,IGF-1R)基因與中國(guó)ISS發(fā)生有關(guān),且不同基因型與ISS患兒的生長(zhǎng)激素療效有關(guān)[2]。胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(insulin-like growth factor 1,IGF-1)直接作用于靶器官介導(dǎo)生長(zhǎng)激素促生長(zhǎng)效應(yīng),胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白3(insulin like growth factor binding protein 3,IGFBP-3)是IGF-1的主要載體,IGFBP-3與IGF-1結(jié)合后,延長(zhǎng)IGF-1半衰期[3],從而促進(jìn)身高的生長(zhǎng)。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)IGFBP-3基因表達(dá)異常與ISS身高增長(zhǎng)關(guān)系的研究較少。本文通過對(duì)血清中IGFBP-3 mRNA表達(dá)量及IGFBP-3基因突變的檢測(cè),了解IGFBP-3基因與ISS發(fā)生的關(guān)系。

1　資料與方法

1.1　臨床資料

選取2012-05～2014-10來山西省人民醫(yī)院兒科就診的26例4-14歲ISS患者為研究對(duì)象。其中男14例,女12例,另選取10例同時(shí)期來我院就診的生長(zhǎng)發(fā)育正常的健康兒童為對(duì)照組。兩組患者年齡、性別差異比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,具有可比性。

入選特發(fā)性矮小標(biāo)準(zhǔn):①身高低于同性別、同年齡正常參考值平均數(shù)減2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差;②兩項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)GH激發(fā)試驗(yàn)的GH峰值≥10 ng/ml;③出生時(shí)身長(zhǎng)和體質(zhì)量正常,而且身材勻稱;④無明顯的慢性器質(zhì)性疾病(肝腎心肺內(nèi)分泌代謝病和骨骼發(fā)育障礙);⑤無心理和嚴(yán)重的情感障礙,攝食正常;⑥染色體檢查正常;⑦骨齡正?；蜓舆t。

對(duì)所有受檢者及對(duì)照組兒童進(jìn)行詳細(xì)的體格檢查,測(cè)量身高、體質(zhì)量,計(jì)算BMI值,計(jì)算身高差,空腹用肝素抗凝管抽取靜脈血5 ml,離心棄上清,存放于-80 ℃冰箱保存。

1.2　血清IGFBP-3 mRNA的表達(dá)量

1.2.1引物設(shè)計(jì)引物序列如下:IGFBP-3-F,GAGTCCAAGCGGGAGACAGAA;IGFBP-3-R,GAGGCTGCCCATACTTATCCACA,引物來源為IGFBP-3 NM-001013398.1[4]。由primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì),引物的設(shè)計(jì)和合成均由英濰捷基公司完成。

1.2.2總RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄所有受檢者就診時(shí)空腹用肝素抗凝管抽取靜脈血5 ml,離心棄上清,存放于-80 ℃冰箱保存。實(shí)驗(yàn)時(shí)從-80 ℃冰箱拿出細(xì)胞沉淀后解凍,按試劑盒說明書提取全血RNA,使用分光光度計(jì)測(cè)定提取RNA的濃度和純度。接下來使用RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒表達(dá)的RR047A進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,完成后將得到的產(chǎn)物在-20 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)IGFBP-3 mRNA利用被SYBR熒光標(biāo)記的RT-PCR試劑盒測(cè)定IGFBP-3的Ct值,按照Ct值計(jì)算IGFBP-3的表達(dá)情況(按2-ddCt法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化,計(jì)算相對(duì)表達(dá)量,ddCt=dCt實(shí)驗(yàn)樣本-dCt校準(zhǔn)樣本,dCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)。

1.3　克隆測(cè)序檢測(cè)IGFBP-3基因外顯子

1.3.1引物設(shè)計(jì)引物序列IGFBP-3-F: GCTGACTCT- GCTGCTGCT,IGFBP-3-R:TAGCAGTGCACGTCCTC-CTT,引物來源為IGFBP-3 NM-001013398.1。由primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)。

1.3.2總RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄按上述方法提取血液中總RNA,使用RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒表達(dá)的RR047A進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。

1.3.3PCR擴(kuò)增將逆轉(zhuǎn)錄的DNA產(chǎn)物進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增,PCR反應(yīng)總體積50 μl(Template 5 μl,Forward Primer(10 μmol/L)1 μl,Reverse Primer(10 μmol/L)1 μl,10×EasyTaq Buffer 5 μl,2.5 mmol/L dNTPs 4 μl,EasyTaq DNA Polymerase 5 μl,ddH2O 33.5 μl),含TaqDNA聚合酶0.5 μl、10×反應(yīng)緩沖液,PCR反應(yīng)條件:94 ℃ 2-5 min;94 ℃ 30 s,50-60 ℃ 30 s,72 ℃ 1-2 kb/min,進(jìn)行32個(gè)循環(huán);72 ℃ 5-10 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳,凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)條帶。將電泳檢測(cè)有目的條帶的PCR產(chǎn)物送至賽默飛公司進(jìn)行測(cè)序檢測(cè)IGFBP-3基因外顯子。

1.4　統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2　結(jié)果

2.1　IGFBP-3 mRNA的表達(dá)與各項(xiàng)指標(biāo)的相關(guān)性

ISS組和對(duì)照組IGFBP-3 mRNA的表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,見表1)。對(duì)ISS組血清中IGFBP-3 mRNA的表達(dá)量和年齡、性別、身高差、BMI進(jìn)行雙變量相關(guān)分析,其中IGFBP-3 mRNA的表達(dá)量與年齡呈正相關(guān)(r=0.723,P=0.000),與性別、身高差及BMI無相關(guān)性(見表2)。

組別nIGFBP-3mRNAtP 對(duì)照組100.72±0.231.9180.060 ISS組260.88±0.43

表2IGFBP-3mRNA表達(dá)量和各臨床指標(biāo)的相關(guān)性分析

Table2CorrelationanalysisbetweentheexpressionofIGFBP-3mRNAandeachindex

臨床指標(biāo)IGFBP-3mRNArP 身高差0.0330.817 年齡0.7230.000 性別0.0690.626 BMI0.1480.294

2.2　IGFBP-3基因外顯子測(cè)序

在26例ISS患兒中均未檢測(cè)到IGFBP-3基因外顯子突變，典型測(cè)序見圖1。

圖1　IGFBP-3基因外顯子無突變Figure 1　No mutation of IGFBP-3 gene exon in a ISS child

3　討論

身高的線性增長(zhǎng)受營(yíng)養(yǎng)代謝軸和下丘腦GH-IGF的調(diào)節(jié)。其中GH-IGF軸被認(rèn)為是影響生長(zhǎng)發(fā)育最重要的內(nèi)分泌通路,該軸在任何水平出現(xiàn)異常都有可能導(dǎo)致矮小的發(fā)生,IGF-1直接作用于靶器官介導(dǎo)GH促生長(zhǎng)效應(yīng),IGFBP-3通過以下途徑作用于IGF-1,從而調(diào)節(jié)生長(zhǎng)發(fā)育:①IGFBP-3具有刺激IGF-1對(duì)骨的生長(zhǎng)作用[5];②IGFBP-3與IGF-1及IGF-2直接結(jié)合,可以延長(zhǎng)IGF-1及IGF-2的半衰期,從而增加IGF系統(tǒng)促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)及分化的作用[6];③IGFBP-3可以與IGF-lR競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合IGF-1及IGF-2,抑制IGF系統(tǒng)介導(dǎo)的促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)及分化的作用。因此,IGFBP-3對(duì)IGF系統(tǒng)促進(jìn)生長(zhǎng)起雙向調(diào)節(jié)作用。對(duì)青春期前ISS兒童測(cè)定血漿總IGF-l、游離IGF-1及IGFBP水平,結(jié)果顯示血漿總IGF-l和游離IGF-1水平均低于對(duì)照組,相反IGFBP水平卻明顯升高[7],推測(cè)IGFBP-3增高使IGF-1降低是導(dǎo)致某些青春期前ISS兒童生長(zhǎng)障礙的原因。此外,IGFBP-3除了對(duì)IGF-1生物利用度的影響,它還有其固有的抗增殖和促進(jìn)凋亡活性的作用,IGFBP-3可以不依賴于IGF系統(tǒng),直接被P53活化,通過P53途徑發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的作用[8]。

IGFBP-3基因位于7p12-p13區(qū)域,共16 028 bp(NG-011508),包含5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子,剪切修飾后的mRNA長(zhǎng)2.4 kb,編碼264個(gè)氨基酸。該基因在物種間具有高度的保守性,雙生子研究表明[9]:外周循環(huán)中的IGFBP-3水平大約一半以上是由遺傳決定的,但具體的決定因素尚不很清楚。IGFBP-3基因啟動(dòng)子區(qū)的多態(tài)性可改變IGFBP-3和IGF-1的表達(dá)水平,進(jìn)而影響多種疾病的發(fā)生、發(fā)展[8]。

國(guó)內(nèi)外對(duì)特發(fā)性矮小患兒IGFBP-3基因與生長(zhǎng)之間關(guān)系的研究報(bào)道較少,目前對(duì)IGFBP-3基因的研究主要集中在對(duì)牛、羊等動(dòng)物的IGFBP-3基因多態(tài)性的研究上。高雪等[10]采用PCR-SSCP技術(shù)分析了牛IGFBP-3基因在南陽牛、魯西牛和中國(guó)西門塔爾牛3個(gè)牛品種中的遺傳多態(tài)性,序列分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)位于IGFBP-3基因第8 069 bp處發(fā)生單堿基突變T/C,并導(dǎo)致了苯丙氨酸變?yōu)榱涟彼?并且與某些性狀相關(guān)。人與動(dòng)物之間存在同源性,因此我們推測(cè)人體中的IGFBP-3基因突變可能同樣影響了某些蛋白的表達(dá),進(jìn)而影響身高。IGFBP-3基因突變可能和特發(fā)性矮小的發(fā)生有關(guān)。

目前有研究發(fā)現(xiàn),在人的IGFBP-3基因啟動(dòng)子區(qū)域的-667G/A和-396C/T的多態(tài)性對(duì)基因轉(zhuǎn)錄或許有影響。-396C/T多態(tài)性增加了IGFBP-3基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性。-396 C/T多態(tài)性和小于胎齡兒(small for gestational age infant,SGA)兒童的低出生體質(zhì)量有關(guān),低或高水平的IGFBP-3都會(huì)影響身高,低水平的IGFBP-3會(huì)影響IGFs的活性,但是當(dāng)血清IGFBP-3增高后,它的抗增殖和促凋亡作用似乎更明顯[11]。

本研究中,IGFBP-3 mRNA的表達(dá)和年齡呈正相關(guān),說明IGFBP-3 mRNA表達(dá)量隨著生長(zhǎng)發(fā)育逐漸增多,這一點(diǎn)和IGFBP-3蛋白與年齡的關(guān)系是一致的。IGFBP-3 mRNA的表達(dá)量在ISS組和正常對(duì)照組中無差異,IGFBP-3 mRNA的表達(dá)和身高差、性別、BMI均無相關(guān)性,說明IGFBP-3 mRNA表達(dá)異常不是本組特發(fā)性矮小患兒的致病原因。本研究中用PCR-克隆測(cè)序的方法檢測(cè)了IGFBP-3基因5個(gè)外顯子,在26例ISS患兒中均無檢測(cè)到IGFBP-3外顯子基因突變,該結(jié)果與Guillaume等[12]的研究一致,他們對(duì)6 075個(gè)受試者進(jìn)行研究,檢測(cè)GH/IGF-1軸上基因多態(tài)性和身高的關(guān)系,沒有發(fā)現(xiàn)IGFBP-3基因多態(tài)性,也進(jìn)一步說明IGFBP-3基因多態(tài)性和特發(fā)性矮小患兒身高之間的關(guān)系不大。由此推測(cè),IGFBP-3基因突變可能不是本地區(qū)ISS患兒的突變特點(diǎn),也可能和實(shí)驗(yàn)樣本量少、種族等有關(guān),有待進(jìn)一步研究。

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