過(guò)表達(dá)CD82基因?qū)谇击[癌OSCC-25細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡的影響

柴　娟,孫沫逸,馬　超,李　昀,劉　寧,黃　碩

(1西安醫(yī)學(xué)院口腔系口腔頜面外科教研室,西安　710021;2第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院口腔頜面外科;*通訊作者,E-mail:chaijuan82@126.com)

頭頸惡性腫瘤包括唇癌、口腔癌、鼻腔癌、鼻竇癌、咽喉癌等,為世界第六大惡性腫瘤[1]。其中90%的頭頸惡性腫瘤為鱗狀細(xì)胞癌,其發(fā)生和發(fā)展主要是癌基因的存在和抑癌基因的缺失[2]。在全球惡性腫瘤中口腔鱗癌患者呈上升趨勢(shì)[3]。CD82也被稱為KAI1基因、R2抗原、C33、IA4、4F9。很多學(xué)者發(fā)現(xiàn)并證實(shí),CD82與多種組織腫瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展有相關(guān)性[4-7]。為了研究基因CD82在口腔鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展中的作用,課題組在前期成功構(gòu)建了真核表達(dá)質(zhì)粒pIRES2-EGFP-CD82[8],在本次實(shí)驗(yàn)中將其轉(zhuǎn)染至OSCC-25細(xì)胞中,利用MTT、Transwell小室及Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)其對(duì)OSCC-25細(xì)胞增殖、侵襲及周期的影響變化。

1　材料和方法

1.1　細(xì)胞株和質(zhì)粒

口腔鱗癌OSCC-25細(xì)胞購(gòu)于美國(guó)菌種保藏中心ATCC,真核表達(dá)質(zhì)粒pIRES2-EGFP-CD82由第四軍醫(yī)大學(xué)口腔頜面創(chuàng)傷實(shí)驗(yàn)室所保存。

1.2　主要試劑

胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Sigma公司,DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自英國(guó)Oxoid,倒置相差顯微鏡購(gòu)自國(guó)產(chǎn)Motic(型號(hào)AE31),FBS、LipofectamineTM2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司,質(zhì)粒pIRES2-EGFP-CD82課題組構(gòu)建,蛋白酶抑制劑RIPA裂解液購(gòu)自加拿大Norgen Biotek公司,anti-CD82、二抗羊抗鼠IgG-HRP購(gòu)自英國(guó)Abcam公司,GAPDH購(gòu)自美國(guó)Santa公司。MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京KGA公司(型號(hào):KGA312)。Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Corning公司,6孔,孔徑8 μm?；啄atrige購(gòu)自美國(guó)B.D公司。Annexin Ⅴ-FITC/PI試劑盒購(gòu)自上海Mbchem,型號(hào)M3021。

1.3　細(xì)胞培養(yǎng)及質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,用8 ml含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)OSCC-25細(xì)胞,并置于孵育箱中常規(guī)傳代培養(yǎng)。倒置相差顯微鏡觀察,當(dāng)90%的OSCC-25細(xì)胞聚縮靠攏,細(xì)胞間隙增大時(shí),可傳代擴(kuò)大培養(yǎng)。再將5×104的OSCC-25細(xì)胞接種在6孔板上,用含有FBS的基礎(chǔ)培養(yǎng)基2 ml培養(yǎng),當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)到80%時(shí)可以轉(zhuǎn)染。將稀釋的質(zhì)粒pIRES2-EGFP-CD82和LipofectamineTM2000混合均勻后,在室溫下孵育20 min,形成復(fù)合物后,按LipofectamineTM2000說(shuō)明書要求,將其加入到培養(yǎng)基的孔中,再將培養(yǎng)板置于37 ℃,5% CO2孵育箱中培養(yǎng)。分別于0,24,48,72 h用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染數(shù)量。

1.4　蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)CD82蛋白的表達(dá)

收集OSCC-25細(xì)胞,加入蛋白酶抑制劑RIPA裂解液,按照試劑說(shuō)明提取總蛋白后進(jìn)行SDS-PAGE電泳以分離蛋白。將目的蛋白條帶電轉(zhuǎn)NC膜,用含5%脫脂奶粉封閉2 h,加入一抗anti-CD82和二抗羊抗鼠IgG-HRP(稀釋濃度1 ∶2 000)各1 ml,室溫反應(yīng)1 h。按照電化學(xué)發(fā)光試劑盒說(shuō)明顯影,以CD82蛋白與內(nèi)參GAPDH條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.5　MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

在96孔培養(yǎng)板中加入約1×104細(xì)胞,并置于37 ℃,5% CO2孵育箱中培養(yǎng)72 h,不同時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞檢測(cè)。用Dilution Buffer將試劑盒中MTT稀釋后加200 μl DMSO后搖勻。用酶聯(lián)免疫監(jiān)測(cè)儀以570 nm波長(zhǎng)檢測(cè)每個(gè)孔的光密度。實(shí)驗(yàn)分為3組:未轉(zhuǎn)染組為空白對(duì)照組,轉(zhuǎn)染空載體pIRES2-EGFP為陰性對(duì)照組,轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP-CD82組為實(shí)驗(yàn)組。細(xì)胞增殖率(%)=(對(duì)照細(xì)胞OD值-受試孔OD值)/對(duì)照細(xì)胞OD值×100%。

1.6　Transwell檢測(cè)細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)

轉(zhuǎn)染72 h,收集各組細(xì)胞,接種細(xì)胞于96孔板中,每孔接種細(xì)胞數(shù)約為5×105個(gè),在Transwell小室的上室放置細(xì)胞懸液200 μl,下室放置500 μl含10% FBS的培養(yǎng)基。將其放于37 ℃環(huán)境中培養(yǎng)24 h，將濾紙用蘇木青染色10 min,再用95%乙醇溶液固定15 min,4 g/L結(jié)晶紫溶液進(jìn)行染色5 s。400倍顯微鏡下觀察照相,隨機(jī)選取6個(gè)視野計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.7　Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)

轉(zhuǎn)染72 h,收集各組細(xì)胞,并用1×PBS洗滌。用100 μl含5% Annexin Ⅴ-FITC的標(biāo)記液重懸細(xì)胞,并在暗處常溫下孵育15 min,每份標(biāo)本中再加入10 μl PI染色。統(tǒng)計(jì)早期凋亡率(右下象限)和晚期凋亡率(右上象限)及總凋亡率(早期凋亡率+晚期凋亡率)。

1.8　統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)保存在Window Excel數(shù)據(jù)庫(kù),統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果采用SPSS19.0軟件(美國(guó)SPSS公司)進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。組間比較選擇方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1　口腔癌細(xì)胞OSCC-25中CD82的高表達(dá)

蛋白質(zhì)印跡法Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè),隨著轉(zhuǎn)染時(shí)間的變化CD82在OSCC-25細(xì)胞中的表達(dá)量增加,在轉(zhuǎn)染后72 h CD82表達(dá)最強(qiáng)(見圖1),且與其他時(shí)間點(diǎn)比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),且此時(shí)在免疫熒光鏡下可以觀察到超過(guò)90%的OSCC-25細(xì)胞中有CD82的表達(dá)(見圖2)。

2.2　過(guò)表達(dá)CD82基因后口腔癌OSCC-25細(xì)胞的增殖能力下降

MTT實(shí)驗(yàn)方法測(cè)試各分組對(duì)OSCC-25細(xì)胞增殖能力的影響,時(shí)間分別為CD82基因轉(zhuǎn)染后0,24,48,72 h。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。實(shí)驗(yàn)分析:陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組相比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);培養(yǎng)72 h,轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)組的口腔癌OSCC-25細(xì)胞增殖活力明顯低于空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組(均P<0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,過(guò)表達(dá)CD82基因可使口腔癌OSCC-25細(xì)胞的增殖能力明顯降低(見表1,圖3)。

圖1　CD82蛋白在OSCC-25細(xì)胞中的表達(dá)Figure 1　Protein expression of CD82 in transfected OSCC-25 cells

2.3　CD82基因過(guò)表達(dá)口腔鱗癌OSCC-25細(xì)胞的侵襲能力下降

Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)分析:空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和CD82轉(zhuǎn)染組的穿膜細(xì)胞數(shù)分別為43.7±4.5,42.8±3.4,25.1±3.2個(gè);陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組沒(méi)有明顯差異(P>0.05);過(guò)表達(dá)CD82基因后口腔鱗癌OSCC-25細(xì)胞穿過(guò)小室膜的細(xì)胞數(shù)明顯減少(見圖3),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。

2.4　CD82基因過(guò)表達(dá)促進(jìn)口腔鱗癌OSCC-25細(xì)胞的凋亡

Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)分析:右上象限是晚期凋亡和壞死的細(xì)胞百分比(晚期凋亡率),右下象限是早期凋亡的細(xì)胞的百分比(早期凋亡率)(見圖4)。陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組相比,統(tǒng)計(jì)學(xué)沒(méi)有明顯差異(P>0.05);在培養(yǎng)72 h,轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)組的口腔癌OSCC-25早期及晚期凋亡明顯高于空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見表2)。

圖2　轉(zhuǎn)染72 h光學(xué)顯微鏡和熒光鏡CD82在OSCC-25細(xì)胞中的表達(dá)Figure 2　The protein expression of CD82 in transfected OSCC-25 cells under light and fluorescence microscope

表1各組MTT細(xì)胞增殖結(jié)果

Table1TheproliferationofOSCC-25inthedifferentgroups

組別0h24h48h72h 空白對(duì)照組0.3067±0.00640.3562±0.00810.4353±0.00530.7311±0.026 陰性對(duì)照組0.3061±0.00610.3621±0.00640.4331±0.00600.7321±0.035 轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)組0.3042±0.00530.3433±0.00720.4217±0.00730.4713±0.012*

與其他兩組比較，*P<0.05

圖3　CD82轉(zhuǎn)染對(duì)OSCC-25細(xì)胞侵襲能力的影響(光鏡,×200)Figure 3　Effect of CD82 transfection on invasion of OSCC-25 cells (light microscope,×200)

圖4　CD82轉(zhuǎn)染對(duì)OSCC-25細(xì)胞凋亡的影響Figure 4　Effect of CD82 transfection on apoptosis of OSCC-25 cells

組別n右上象限右下象限空白對(duì)照組33.0±0.31.3±0.1陰性對(duì)照組33.0±0.11.1±0.1實(shí)驗(yàn)組 36.4±0.2*2.3±0.1*

與其他兩組比較,*P<0.05

3　討論

TM4SF蛋白與腫瘤細(xì)胞的增殖、移動(dòng)、融合及免疫系統(tǒng)的調(diào)控有關(guān)[9,10]。CD82是TM4SF蛋白家族中的主要成員之一,最先是在Dunning兔子前列腺癌模型中發(fā)現(xiàn)的抑癌基因[11],隨后很多學(xué)者發(fā)現(xiàn)其與其他組織腫瘤細(xì)胞的表達(dá)和轉(zhuǎn)移有相關(guān)性。CD與其他跨膜蛋白、趨化因子相互作用可以調(diào)控腫瘤細(xì)胞的黏附、遷移和信號(hào)通路。

在本次實(shí)驗(yàn)中,首先將pIRES2-EGFP-CD82質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到口腔鱗狀細(xì)胞癌OSCC-25中,在普通光學(xué)顯微鏡及熒光顯微鏡中觀察到轉(zhuǎn)染72 h時(shí),細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率最高,為研究CD82在口腔鱗狀細(xì)胞癌OSCC-25生物學(xué)行為提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

Jee等[12]發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)CD82可以有效地抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲。Yang等[13]通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)CD82可以抑制體外乳腺癌細(xì)胞侵襲和體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移,但在國(guó)內(nèi)尚無(wú)報(bào)道過(guò)表達(dá)CD82會(huì)對(duì)口腔鱗狀細(xì)胞的生物學(xué)行為會(huì)有怎樣的影響。以往學(xué)者只是通過(guò)免疫組織化學(xué)發(fā)現(xiàn)CD82基因表達(dá)的缺失與口腔惡性腫瘤的發(fā)生、淋巴轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系。Uzawa等[14]通過(guò)組織切片、免疫組織化學(xué)方法等發(fā)現(xiàn),CD82的下調(diào)存在于原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性口腔鱗狀細(xì)胞癌中,且與淋巴轉(zhuǎn)移有相關(guān)性。Kawasaki等[15]通過(guò)免疫組織化學(xué)方法亦發(fā)現(xiàn)CD82的表達(dá)與口腔癌原發(fā)部位及轉(zhuǎn)移部位均有相關(guān)性。

MTT法是檢測(cè)細(xì)胞存活和生長(zhǎng)的方法,在本實(shí)驗(yàn)中,OSCC-25在轉(zhuǎn)染CD82后其細(xì)胞生長(zhǎng)速度明顯較空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組降低。表明過(guò)表達(dá)CD82后可以顯著抑制口腔鱗狀細(xì)胞的生長(zhǎng)。Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)可以區(qū)分凋亡早晚期的細(xì)胞以及死細(xì)胞區(qū)。本實(shí)驗(yàn)中通過(guò)Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡法發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染CD82組使細(xì)胞的總凋亡率明顯上升且較其他組有明顯區(qū)別。由實(shí)驗(yàn)可見過(guò)表達(dá)CD82后可以促進(jìn)OSCC-25細(xì)胞的調(diào)亡。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)用于檢測(cè)腫瘤細(xì)胞侵襲能力的實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)染CD82使OSCC-25細(xì)胞的侵襲能力降低,且較其他組有明顯區(qū)別，說(shuō)明過(guò)表達(dá)CD82能明顯抑制OSCC-25細(xì)胞的侵襲能力。

另外,過(guò)表達(dá)CD82也可以促進(jìn)口腔鱗癌細(xì)胞的凋亡,可能也與一定的信號(hào)通路有關(guān)。Odintsova等[16]發(fā)現(xiàn)CD82與上皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子EGF誘導(dǎo)的信號(hào)通路有關(guān),且與EGF受體和跨膜蛋白有關(guān)。Zhu等[17]發(fā)現(xiàn)CD82可能是通過(guò)抑制TGF-β1/Smad信號(hào)通路來(lái)抑制腎癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲。在本實(shí)驗(yàn)中通過(guò)Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)CD82加速了OSCC-25細(xì)胞的凋亡現(xiàn)象。而Schoenfeld等[18]發(fā)現(xiàn)CD82與細(xì)胞凋亡有關(guān),是因?yàn)槠淇梢援a(chǎn)生活性氧中間產(chǎn)物并且調(diào)控促凋亡cdc42通路。這也為我們后續(xù)研究CD82作用于口腔鱗狀細(xì)胞信號(hào)通路提供了線索和方向。

總之,本實(shí)驗(yàn)研究提示過(guò)表達(dá)CD82對(duì)口腔癌細(xì)胞OSCC-25細(xì)胞增殖、細(xì)胞侵襲有抑制作用,并且促進(jìn)口腔鱗癌細(xì)胞凋亡。這一現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)可能為口腔癌的靶向治療提供了一種新思想和新途徑。

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