擬南芥轉(zhuǎn)錄共激活子ANGUSTIFOLIA3(AN3)調(diào)控花的雄蕊的形成

李　丹　徐夢(mèng)珂　蔣繼宏　孟來(lái)生

(江蘇師范大學(xué)江蘇省藥食植物生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育點(diǎn)/生命科學(xué)學(xué)院，徐州　221116)

花是被子植物主要的繁殖器官,在繁育后代的過(guò)程中,發(fā)揮著極其重要的作用[1]，而授粉是種子植物繁殖發(fā)育必經(jīng)的過(guò)程，植物的雄蕊是種子植物產(chǎn)生花粉的器官，雌蕊是種子植物的雌性繁殖器官，雌蕊的柱頭有粘液可以粘附花粉[2]，花粉落到雌蕊的柱頭上[3]就開(kāi)始生長(zhǎng)，穿過(guò)雌蕊到達(dá)子房與卵子結(jié)合，并發(fā)育形成種子。植物的花能否正常授粉直接影響到作物的產(chǎn)量和傳種，其雄蕊和雌蕊的正常發(fā)育是重要因素，研究基因調(diào)控雄蕊發(fā)育對(duì)改良農(nóng)作物育種及增加產(chǎn)量具有十分重要的意義。

擬南芥ANGUSTIFOLIA3(AN3)與編碼人轉(zhuǎn)錄共激活因子和滑膜肉瘤易位蛋白(SYT)是同源基因[4]。AN3是擬南芥[3]中一個(gè)小基因家族的成員，有許多重要功能，如涉及調(diào)節(jié)葉原基中的細(xì)胞增殖，近遠(yuǎn)軸面的決定和建立子葉同一性[3～6]。AN3的表達(dá)僅限于葉肉細(xì)胞內(nèi)，在葉片表皮細(xì)胞內(nèi)未檢測(cè)到[5]。AN3-MINI3基因級(jí)聯(lián)可通過(guò)調(diào)控種子胚胎發(fā)育控制細(xì)胞分裂和細(xì)胞伸長(zhǎng)[7]。AN3是涉及調(diào)節(jié)葉片和花瓣的生長(zhǎng)以及形狀的組成部分[8]。最近，我們的研究發(fā)現(xiàn)AN3轉(zhuǎn)錄共激活子在種子發(fā)育[7]，花青素生物合成[9]，根系統(tǒng)發(fā)育[10]，干旱脅迫和水分利用[11]等方面都發(fā)揮著重要作用。AN3的這些功能表明它參與擬南芥生長(zhǎng)發(fā)育，代謝和非生物脅迫等重要生理過(guò)程，是一個(gè)重要的遺傳因子。然而AN3基因是否調(diào)控?cái)M南芥花的雄蕊發(fā)育目前尚未研究。

本研究發(fā)現(xiàn)突變體an3-1和an3-4植株的雄蕊均比野生型短，而雌蕊卻無(wú)明顯變化。AN3的GUS染色實(shí)驗(yàn)表明，AN3基因在花器官中明顯表達(dá)。綜合以上結(jié)果，我們得出結(jié)論，AN3基因參與調(diào)控?cái)M南芥花的雄蕊形成。

1　材料與方法

1.1　實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)植物

本研究所用到的擬南芥材料均為哥倫比亞(Columbia)生態(tài)型背景，有擬南芥野生型Col-0、an3-4敲除突變體[由G.Horiguchi教授(日本豐島市立興大學(xué))熱情提供]，an3-1(CS241)敲除突變體[購(gòu)自擬南芥生物研究中心(ABRC)(俄亥俄州立大學(xué)，俄亥俄州哥倫布市)提供]。AN3基因敲除靶位點(diǎn)引物序列設(shè)計(jì)，AN3基因敲除所用的載體,構(gòu)建的情況請(qǐng)參看[3]。

1.1.2實(shí)驗(yàn)試劑

UNIQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒；AMV第一鏈cDNA合成試劑盒；PCR(Taq)擴(kuò)增試劑盒。以上試劑盒均購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2　實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1擬南芥的培養(yǎng)

將野生型和突變體擬南芥的種子在4℃下進(jìn)行處理3天后，以2.5%次氯酸鈉消毒10 min后，用高溫高壓滅菌的去離子水蕩洗4次，播種在含1%蔗糖和0.8%瓊脂且pH5.8的MS培養(yǎng)基上，并在21±2℃，16 h/8 h光暗周期，光照強(qiáng)度6 000～8 000 lx，濕度75%的環(huán)境中培養(yǎng)，每天觀察。待幼苗長(zhǎng)出4片左右真葉后，便將其移栽到浸透MS營(yíng)養(yǎng)液的滅菌的基質(zhì)土中，同等溫度、光照和濕度的條件下繼續(xù)培養(yǎng)，每周澆一次MS營(yíng)養(yǎng)液[12]。

1.2.2RT-PCR檢測(cè)AN3基因的表達(dá)量

通過(guò)UNIQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒，利用孟[11～12]等人描述的方法，從待測(cè)樣品葉片中提取總RNA，使用AMV第一鏈cDNA合成試劑盒對(duì)總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生的cDNA用作基于RT-PCR的基因表達(dá)分析的模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。使用的引物如下：

TUB4(F-GACGCTTCATCTCGTCC；R-GTAAACGTAGGTGAGTCCA)；AN3(F-5′-GCCTCAGCCACCAAGTGTGCAT-3′ and R-5′-ACCGCCACCACCACTTCCCA-3′)。

1.2.3花的雄蕊和雌蕊長(zhǎng)度測(cè)量方法

使用HIROX三維視頻顯微鏡在相應(yīng)放大倍率下拍攝花的雄蕊和雌蕊，通過(guò)掃描器官形成數(shù)字圖像，然后使用Image J軟件測(cè)量雄蕊和雌蕊的長(zhǎng)度。

1.2.4AN3基因敲除靶位引物序列設(shè)計(jì)

AN3F-5′-GCC TCA GCC ACC AAG TGT GCA T-3′；R-5′-ACC GCC ACC ACC ACT TCC CA-3′。

1.2.5擬南芥AN3啟動(dòng)子GUS表達(dá)載體構(gòu)建

通過(guò)啟動(dòng)子分析，插入2.0 kB的啟動(dòng)子片段構(gòu)建擬南芥AN3(At5g28640)啟動(dòng)子-GUS表達(dá)載體，擴(kuò)增引物為(P1-ggg gac aag ttt gta caa aaa agc agg ct TTT GTA AGC GTT TCA GAA TCC T,P2- ggg gac cac ttt gta caa gaa agc tgg gt TAA CTA TTG AAG ATG TGT ATC TC)。并將這些片段插入到pCB308R質(zhì)粒中[11～12]。之后，濃桿菌轉(zhuǎn)化擬南芥植物，抗生素卡納霉素篩選轉(zhuǎn)基因苗，從而獲得Pro-AN3-GUS植株。

1.2.6GUS染色

β-葡糖苷酸酶(GUS)，使用混合緩沖液(1 mmol·L-1X-gluc，60 mmol·L-1NaPO4緩沖液，0.4 mmol·L-1K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6和0.1%(v/v)Triton X-100)，將樣品(Pro-AN3-GUS)染色，然后在37℃下培養(yǎng)8個(gè)小時(shí)。GUS染色后，使用30%、50%、70%、90%和100%濃度梯度的乙醇約30分鐘處理每個(gè)樣品，使其除去葉綠素[12～13]。最后，使用HIROX三維視頻顯微鏡在相關(guān)放大倍數(shù)下拍攝材料[14]。

2　結(jié)果與分析

2.1　野生型與突變體AN3基因的表達(dá)

以持家基因TUB4作為對(duì)照進(jìn)行RT-PCR，擴(kuò)增循環(huán)數(shù)為30。由圖1可知，野生型擬南芥(WT)中明顯擴(kuò)增出了300 bp的片段，則表明WT中AN3基因正常表達(dá)；突變體an3-1中沒(méi)有擴(kuò)增條帶，說(shuō)明該突變體中AN3基因的表達(dá)缺失，則突變體an3-1中AN3基因已被敲除；同樣的，突變體an3-4中也沒(méi)有擴(kuò)增條帶，說(shuō)明該突變體中AN3基因的表達(dá)缺失，突變體an3-4中AN3基因已被敲除。以上實(shí)驗(yàn)證明，我們已經(jīng)獲得了所需要的研究材料。

2.2　突變體表型分析

測(cè)量出具體的雄蕊和雌蕊的長(zhǎng)度(圖2)。擬南芥為自花授粉植物，自花授粉植物必然是兼有雄蕊和雌蕊的完全花，而且雌蕊雄蕊基本上同時(shí)成熟，授粉需將花粉從花藥到柱頭移動(dòng)。從表型上觀察發(fā)現(xiàn)野生型(Col-0)植株的雄蕊和雌蕊生長(zhǎng)正常，即可正常授粉，正常繁殖發(fā)育；然而突變體an3-1和an3-4的雄蕊較野生型明顯變短，突變體an3-1和an3-4的雌蕊也較野生型變短，但無(wú)明顯變化。結(jié)果初步表明：AN3基因可能參與擬南芥的花的雄蕊發(fā)育的調(diào)控。

圖1　用RT-PCR檢測(cè)AN3在an3-1和an3-4中的表達(dá)情況　WT.野生型Col-0擬南芥；TUB4.持家基因，作為對(duì)照　以此檢測(cè)AN3在野生型、突變體an3-1和突變體an3-4中的表達(dá)量。Fig.1　RT-PCR assays AN3 expression in an3-1 and an3-4 mutants　WT. Wild-type Col-0 A.thaliana; TUB4.Housekeeping gene,as a control　The expression levels of AN3 in wild-type,mutant an3-1 and mutant an3-4 were examined.

圖2　突變體an3-1和an3-4的雄蕊和雌蕊表型特征　A.野生型和突變體雄蕊的生長(zhǎng)狀態(tài)；B.野生型和突變體雄蕊的長(zhǎng)度(以野生型的雄蕊長(zhǎng)度為1.0；n>12；**P<0.01)；C.野生型和突變體雌蕊的長(zhǎng)度(以野生型的雄蕊長(zhǎng)度為1.0)Fig.2　AN3 phenotypic characteristics of stamens and pistils in an3-1 and an3-4 mutants　A.The growth status of wild-type and mutant stamens; B.The length of wild-type and mutant stamens(Col-0 is set as 1.0；n>12；**P<0.01); C.The length of wild-type and mutant pistils(Col-0 is set as 1.0)

2.3　AN3基因在種子胚、柱頭、成熟的花粉和花瓣均有表達(dá)(Pro-AN3-GUS)

以上實(shí)驗(yàn)證明AN3基因可能對(duì)花發(fā)育過(guò)程有調(diào)控作用，這必定要求AN3基因在花器官中表達(dá)。為明確AN3基因可能參與擬南芥的生殖發(fā)育的調(diào)控，本研究構(gòu)建了AN3啟動(dòng)子GUS表達(dá)載體，GUS染色表明，擬南芥AN3基因在種子胚、柱頭、成熟的花粉及花中都能表達(dá)(圖3)，這個(gè)結(jié)果與AN3基因的敲除突變體花器官的發(fā)育異常一致。這一結(jié)果暗示著該基因可能在整個(gè)雄蕊生長(zhǎng)過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。

既然an3-1和an3-4的雄蕊變短，是否這個(gè)異常的表型影響果莢的形成。的確，這個(gè)發(fā)育異常的表型嚴(yán)重地影響了授粉，從而導(dǎo)致果莢變小，變短 (圖4)，單個(gè)果莢內(nèi)種子數(shù)目變少(圖5)，甚至有的難以形成果莢。這將嚴(yán)重影響產(chǎn)量。

圖3　GUS染色　A.擬南芥種子胚中AN3的表達(dá)；B.擬南芥柱頭中AN3的表達(dá)；C.擬南芥成熟的花粉中AN3的表達(dá)；D.擬南芥花中AN3的表達(dá)Fig.3　GUS staining　A. Expression of AN3 in A.thaliana seed embryo; B. Expression of AN3 in stigma of A.thaliana; C. Expression of AN3 in mature pollen of A.thaliana; D. Expression of AN3 in A.thaliana flower

3　討論

已有研究表明，AN3對(duì)花青素的積累有正向調(diào)節(jié)作用[10]，AN3基因僅在葉肉細(xì)胞內(nèi)有表達(dá),在表皮細(xì)胞內(nèi)未檢測(cè)到[5]，并且AN3-MINI3基因級(jí)聯(lián)可通過(guò)調(diào)控種子胚胎發(fā)育控制細(xì)胞分裂和細(xì)胞伸長(zhǎng)[7]。而本研究發(fā)現(xiàn)AN3基因在種子胚、柱頭、成熟的花粉和花瓣均有表達(dá)，證明了AN3基因很可能在調(diào)控花器官的發(fā)育過(guò)程中起一定作用。的確AN3缺失的突變體的花器官發(fā)育異常，主要表現(xiàn)在雄蕊長(zhǎng)度較短。何卓娜[15]等人發(fā)現(xiàn)野生型Col-0比chalcll1cll2三突變體雄蕊的長(zhǎng)度明顯長(zhǎng)，此外，突變體雄蕊的柱頭上未看到有黃色成熟花粉的粘附。周鵲[16]等人發(fā)現(xiàn)ms1521突變體的花缺失部分花瓣,雄蕊比較短,花藥肥大,部分雄蕊的花藥成絲狀。成志鵬[17]研究表明，突變體ems1227與野生型相比，ems1227突變體的長(zhǎng)角果短小，不含種子。這些研究與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果突變體較野生型雄蕊長(zhǎng)度短小一致。另外，劉彩霞[1]等人發(fā)現(xiàn)，過(guò)量表達(dá)PI的轉(zhuǎn)基因煙草在花器官中存在明顯表型,與野生型相比主要表現(xiàn)為轉(zhuǎn)基因植株花冠變小,雄蕊縮短,果實(shí)畸形。AN3基因的缺失導(dǎo)致擬南芥雄蕊發(fā)育的異常，即擬南芥轉(zhuǎn)錄共激活子AN3調(diào)控花的雄蕊的形成，這一結(jié)果可能會(huì)造成后期花的敗育，減少種子數(shù)目，影響果莢發(fā)育，從而造成產(chǎn)量降低。因此，本研究結(jié)果對(duì)改良農(nóng)作物育種及增加產(chǎn)量具有十分重要的意義，但是AN3作為轉(zhuǎn)錄共激活子調(diào)控雄蕊形成的下游靶標(biāo)基因是什么，以及這個(gè)調(diào)控通路由什么信號(hào)所介導(dǎo)都是未知的，需要進(jìn)一步深入研究。

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