銀杏葉提取物對體外混合培養(yǎng)大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞保護作用有效濃度的研究

李強　王紅義　段俊國

近年來，大量的臨床及實驗研究報道了單味中藥或其提取物具有視功能保護作用，在治療效果和不良反應等方面較西藥更具綜合優(yōu)勢。其中，銀杏葉提取成分(Ginkgo biloba Extract，GBE )用于視神經(jīng)保護的研究引起了人們極大的興趣。本實驗通過建立體外混合培養(yǎng)大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞模型，采用MTT比色法，進行了銀杏葉提物對保護作用有效濃度的篩選，為下一步在離子通道水平研究其保護作用提供實驗依據(jù)。

1　材料和方法

1.1　材料

1.1.1動物

SD乳鼠(1日齡)，由成都中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供(生產合格證：川實動管質第99～11號)，2只，雌雄不拘，質量約5g～7g，母乳喂養(yǎng)。飼養(yǎng)條件保持在室溫18℃～24℃，相對濕度50%～70%，空氣流通。自然光線照明，12小時明-暗交替光照，晝夜循環(huán)。

SD乳大鼠的納入標準為：①選擇同窩乳鼠；②皮膚無咬痕、潰瘍等損傷。

1.1.2儀器設備

Ti-U倒置相差顯微鏡(美國Nikon)；MDF- 382E型超低溫冰箱(日本SANYO)；BT125D電子天平(德國Sartorius)；Phenix型普通光學顯微鏡(江西鳳凰光學集團有限公司)；Milli-Q型去離子水系統(tǒng)(美國Millipore)；Megafuge1.0R型離心機(美國KendroHeraeus)； FORMA3110型二氧化碳培養(yǎng)箱(美國Thermo)；25cm2培養(yǎng)瓶(美國COSTAR)；XB-K-25型血球計數(shù)板(浙江玉環(huán)五金光學儀器廠)；PB-10型精密PH計(德國Sartorius)；35mm培養(yǎng)皿(美國COSTAR)體式顯微鏡(日本Nikon)；DP-12型顯微數(shù)碼照相系統(tǒng)(日本OLYMPUS)；ZHJH-C1209B型超凈工作臺(上海智城分析儀器制造有限公司)； 96孔培養(yǎng)板(美國COSTAR)；針芯式濾器(ф0.22um)(美國Millipore)；200目篩網(wǎng)(上海元象器械廠)等。

1.1.3試劑

Neurobasal Medium(美國Invitrogen Corporation)，Trypsin(美國Invitrogen Corporation)，Poly-D-lysine hydrobromide(美國SIGMA Corporation)，F(xiàn)etal Bovine Serum(美國Invitrogen Corporation)，DMEM(High Glucose)(美國Invitrogen Corporation)， HEPES(美國SIGMA Corporation)，B27(美國Invitrogen Corporation)， New Born Calf Serum(美國Invitrogen Corporation)，PBS(美國Invitrogen Corporation)，Hank's Balanced Salt Solution(美國Invitrogen Corporation)， Penicillin-Streptomycin(美國SIGMA Corporation)，Laminin(美國SIGMA Corporation)，L-Glutamine(美國Invitrogen Corporation)，銀杏葉提取物(GBE，由上海信誼百路達藥業(yè)有限公司提供)，腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF，美國Peprotech Corporation)，二甲基亞砜(DMSO，美國SIGMA Corporation)，噻唑蘭(MTT，美國SIGMA Corporation)等。

1.2　方法

1.2.1體外混合培養(yǎng)大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞模型的建立

大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞體外培養(yǎng)：借鑒Kitano S等[1-4]和其他實驗室的方法，并加以改進。

1.2.1.1培養(yǎng)器皿的鋪板

以0.1mg/ml多聚賴氨酸(Poly-D-lysine hydrobromide，PBS緩沖液稀釋)37℃包被96孔板、2cm×2cm蓋玻片、25cm2培養(yǎng)瓶、直徑35mm培養(yǎng)皿及直徑100mm培養(yǎng)皿，要完全覆蓋整個皿底。室溫包被2小時后，回收多聚賴氨酸；用PBS液漂洗3次，在通風櫥內干燥，待用。再以4ug/ml層粘連蛋白(laminin，PBS液稀釋)包被，也要完全覆蓋整個皿底。37℃過夜備用。

1.2.1.2大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞的培養(yǎng)

將出生1天SD乳鼠2只浸在75%酒精中30s，注意全身浸濕，但注意頭部要適時晾干。用大剪刀迅速剪取頭部，置空的皿中稍晾干殘余酒精。左手夾持頭部，右手用直剪剪開眼裂周圍組織，暴露眼球。用彎剪彎鑷夾取眼球，放入已冰浴的且加有Penicillin-Streptomycin的 Hank's Balanced Salt Solution液中，體式顯微鏡下鈍性分離視網(wǎng)膜，用venus 剪剪碎組織，收集并轉移到離心管中，待組織沉降3min，吸除上層液體。用終濃度為0.125% Trypsin在孵育箱中消化15分鐘，其間搖兩次。然后取出，加含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液，以終止酶解。吹打數(shù)次。用220目網(wǎng)眼無菌鋼網(wǎng)濾過，1000r/min離心3分鐘。去上清液，加10%FBS的DMEM培養(yǎng)液，小心用吸管反復吹打，使細胞分散均勻，制成細胞懸液，盡量避免氣泡產生。計數(shù)，調整細胞密度至1×106/ml加入96孔板和預先置入2cm×2cm蓋玻片的培養(yǎng)皿中，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。24h后用維持培養(yǎng)(97.5% Neurobasal Medium、2% B27、0.5% 200mM/L L-Glutamine)換液1次。2天后開始用維持培養(yǎng)基。并觀察其生長狀態(tài)及形態(tài)學變化。

1.2.2銀杏葉提取物對體外混合培養(yǎng)大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞保護作用有效濃度的研究

1.2.2.1體外混合培養(yǎng)大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞保護作有效濃度的篩選

采用MTT法(噻唑蘭比色法)測定銀杏葉提取物對體外混合培養(yǎng)的視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞的保護作用。MTT法，又稱MTT比色法，是一種檢測細胞存活和生長的方法。其檢測原理為活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結晶甲瓚(Formazan)并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。二甲基亞砜(DMSO)能溶解細胞中的甲瓚，用酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細胞數(shù)量。在一定細胞數(shù)范圍內，MTT結晶形成的量與細胞數(shù)成正比。

MTT法實驗步驟：(1)取出生1天的SD乳鼠2只，制備成視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞懸液，調整細胞密度至1×105/ml加入預先包被Poly-D-lysine的96孔板。37℃、5%二氧化碳孵箱內培養(yǎng)。(2)48小時(細胞已貼壁)后，無血清培養(yǎng)液洗滌3次。隨機分組進行實驗，共分9個組：0.01μg/ml GBE組，0.1μg/ml GBE組，1μg/ml GBE組，10μg/ml GBE組，100μg/ml GBE組，500μg/ml GBE組，1000μg/ml GBE組，50ng/ml BDNF組，空白對照組(control組)，每組10孔，每孔加入各100ul濃度梯度的藥物、陽性對照藥物(50ng/ml BDNF)、培養(yǎng)液(空白對照)，37℃孵箱培養(yǎng)，并在倒置顯微鏡下觀察。(3)48小時后，加入100ul MTT(5mg/ml，即0.5%MTT)，繼續(xù)37℃孵箱培養(yǎng)，并在倒置顯微鏡下觀察。(4)4小時后終止培養(yǎng)，小心吸去孔內培養(yǎng)液。(5)每孔加入150ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩5min，使結晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀490nm處測量各孔的OD值，并在倒置顯微鏡下觀察(注：設置調零孔2個)。

1.2.2.2銀杏葉提取物對混合培養(yǎng)大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞存活率的測定

根據(jù)OD值計算細胞存活率。細胞存活率=(試驗組OD值-空白組OD值)/空白組OD值×100%

1.3　統(tǒng)計方法

數(shù)據(jù)結果采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，多組間比較用單因素方差分析，多組間兩兩比較用q檢驗(LSD法)。

2　結果

2.1　體外混合培養(yǎng)大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞模型的建立

2.1.1大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞的生長狀況

相差顯微鏡下觀察，細胞于培養(yǎng)的3～4小時開始貼壁，貼壁后的細胞呈圓形，胞體中部較暗，光暈明顯。24～48小時細胞開始伸出粗細長短不等的突起。細胞呈多邊形，大多數(shù)細胞折光強，有聚集生長的現(xiàn)象；72小時后突起增多，并伸長。培養(yǎng)一周后，胞體折光降低。培養(yǎng)2～3周后存活細胞逐漸減少。見圖1～圖10。

2.1.2大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的形態(tài)學變化

圖1細胞于培養(yǎng)的4小時開始貼壁，貼壁后的細胞呈圓形，胞體中部較暗，光暈明顯(×200)圖2培養(yǎng)24h，細胞開始伸出粗細長短不等的突起，有聚集生長的現(xiàn)象(×200)圖3培養(yǎng)2d，細胞呈多邊形，突起漸長，大多數(shù)細胞質折光強，有聚集生長的現(xiàn)象(×200)圖4培養(yǎng)4d，細胞開始突起增多，并伸長；有聚集生長的現(xiàn)象(×200)圖5培養(yǎng)6d后，突起增多，并伸長，形成網(wǎng)狀(×200)圖6培養(yǎng)8d后，胞體折光降低(×200)圖7培養(yǎng)10d后，胞體折光降低開始有細胞凋亡(×200)圖8培養(yǎng)12d后，凋亡細胞增加(×200)圖9培養(yǎng)14d后凋亡細胞進一步增加(×200)圖10培養(yǎng)16d后，存活細胞較少(×200)

2.2　不同濃度銀杏葉提取物對體外混合培養(yǎng)大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞存活的影響

MTT比色法對RNCs保護作用有效濃度進行篩選，1000μg/mlGBE、500μg/mlGBE、100μg/mlGBE、10μg/mlGBE、1μg/mlGBE、0.1μg/mlGBE、0.01μg/mlGBE，50ng/mlBDNF各組與空白對照組的OD值分別為(0.57 ±0.09，0.74 ±0.10，0.74 ±0.12，0.57 ±0.07，0.58 ±0.10，0.46 ±0.10，0.34 ±0.07，0.81 ±0.06，0.35 ±0.06)。其中1000μg/mlGBE、500μg/mlGBE、100μg/mlGBE、10μg/mlGBE、1μg/mlGBE、0.1μg/ml GBE和50ng/ml BDNF各組與空白對照組比較，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見表1，圖11。

2.3　MTT結晶沉積于視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞的觀察

銀杏葉提取物對體外混合培養(yǎng)大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞保護作用有效濃度為0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml、500μg/ml、1000μg/ml。

3　討論

銀杏葉系銀杏科銀杏屬植物銀杏葉，是我國的特產植物。含黃酮類(約20余種)、萜類、酚類，有益微量元素和17種氨基酸等有效成分。國外較早生產的銀杏葉提取物商品名為金納多，其有效成份是24%的總黃酮和6%的萜類(銀杏內酯和銀杏苦內酯)。黃酮類化合物具有抗氧化作用而內酯類具有抗血小板激活因子的作用[5]。自20世紀60年代以來各國學者對銀杏的成份及其藥理作用做了大量的工作。最初，人們用它治療冠心病、高血壓、心絞痛、動脈硬化等循環(huán)障礙疾病及腦功能減退、老年性癡呆、老年性記憶減退、衰老等與腦內興奮毒性損傷相關的神經(jīng)系統(tǒng)疾病[6, 7]，得了一定的效果[8, 9]。后來經(jīng)過大量實驗和臨床證明，GBE還有顯著的視功能保護作用。目前GBE成為倍受關注的藥品[10]。

圖121000μg/mlGBE組加入MTT后生成不溶于水的藍紫色結晶甲瓚并沉積在細胞中(×200)圖13100μg/mlGBE組加入MTT后生成不溶于水的藍紫色結晶甲瓚并沉積在細胞中(×100)圖1410μg/mlGBE組加入MTT后生成不溶于水的藍紫色結晶甲瓚并沉積在細胞中(×200)圖1550ng/mlBDNF組加入MTT后生成不溶于水的藍紫色結晶甲瓚并沉積在細胞中(×400)圖16空白組加入MTT后，生成不溶于水的藍紫色結晶甲瓚并沉積在細胞中(×200)圖17二甲基亞砜溶解細胞中的甲瓚(×100)

表1不同濃度銀杏葉提取物對體外混合培養(yǎng)大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞存活的影響

GroupnODvalueLivability(%)50ng/mlBDNF100．81±0．06#1．331000μg/mlGBE100．57±0．09#0．65500μg/mlGBE100．74±0．10#1．12100μg/mlGBE100．74±0．12#1．1210μg/mlGBE100．57±0．07#0．651μg/mlGBE100．58±0．10#0．660．1μg/mlGBE100．46±0．10#0．320．01μg/mlGBE100．34±0．07-0．01control100．35±0．06-F38．64P0．0001

#P<0.01 vs control group(One-way ANOVA，LSD-t test)

圖11不同濃度銀杏葉提取物對體外混合培養(yǎng)大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞存活的影響

檢驗細胞存活的方法很多，如同位素釋放法、乳酸脫氫酶釋放改良法、三磷酸腺苷發(fā)光法等。MTT比色法由于簡單經(jīng)濟、快速、無放射性污染，其檢測結果與同位素摻入法有良好的一致性[11]，故可有效地應用于視神經(jīng)保護藥物篩選等研究。

MTT比色分析法是由Mosmann[12]在1983年首創(chuàng)，MTT法測定細胞活性的機制[13]：MTT(噻唑蘭)是一種淡黃色可溶性化合物，是顯示線粒體中的琥珀酸脫氫酶的試劑，MTT能被活的細胞吸收，通過組織化學反應可產生不溶性的針狀藍色結晶甲瓚沉積于細胞內或細胞周圍[14]，而形成甲瓚的量與細胞存活數(shù)量成正比[15]，由于死亡的細胞并不著色，也不生成結晶，故判斷細胞活性的指標是藍色產物的多少。細胞存活且生長活躍，藍色產物就多。在定量細胞活性上有應用價值。

我們首先應用MTT方法，篩選了銀杏葉提取物對體外混合培養(yǎng)大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞保護作用的有效濃度，結果顯示：1000μg/ml GBE、500μg/ml GBE、100μg/ml GBE、10μg/ml GBE、1μg/ml GBE、0.1μg/ml GBE和50ng/mlBDNF各組與空白對照組比較，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。各濃度的銀杏葉提取物均有不同程度的保護大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞的作用，且隨濃度的增加保護作用加強。這樣就為我們在細胞離子通道水平研究其保護作用提供了依據(jù)。

我們在實驗中體會到用MTT法檢測銀杏葉提取物對體外混合培養(yǎng)大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞保護作用，有以下優(yōu)點：①快速、靈敏、操作簡單；②低成本、人為誤差較?。虎壑貜托院?、實驗條件易控制；④可批量實驗；⑤沒有放射性污染。

[1]Kitano S, Morgan J, Caprioli J. Hypoxic and excitotoxic damage to cultured rat retinal ganglion cells[J]. Exp Eye Res,1996,63(1):105-112.

[2]Caprioli J, Kitano S, Morgan JE. Hyperthermia and hypoxia increase tolerance of retinal ganglion cells to anoxia and excitotoxicity[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci,1996,37(12):2376-2381.

[3]Nichol KA, Schulz MW, Bennett MR. Nitric oxide-mediated death of cultured neonatal retinal ganglion cells: neuroprotective properties of glutamate and chondroitin sulfate proteoglycan[J]. Brain Res,1995,697(1-2):1-16.

[4]Guenther E, Schmid S, Grantyn R, et al. In vitro identification of retinal ganglion cells in culture without the need of dye labeling[J]. J Neurosci Methods, 1994,51(2): 177-181.

[5]Drago F, Floriddia ML, Cro M, et al. Pharmacokinetics and bioavailability of a Ginkgo biloba extract[J]. J Ocul Pharmacol Ther,2002,18(2):197-202.

[6]Ahlemeyer B, Krieglstein J. Neuroprotective effects of Ginkgo biloba extract[J]. Cell Mol Life Sci,2003,60(9):1779-1792.

[7]Chandrasekaran K, Mehrabian Z, Spinnewyn B, et al. Neuroprotective effects of bilobalide, a component of Ginkgo biloba extract (EGb 761) in global brain ischemia and in excitotoxicity-induced neuronal death[J]. Pharmacopsychiatry,2003,36 Suppl 1:S89-S94.

[8]Ahlemeyer B, Krieglstein J. Pharmacological studies supporting the therapeutic use of Ginkgo biloba extract for Alzheimer's disease[J]. Pharmacopsychiatry,2003,36 Suppl 1:S8-S14.

[9]Beal MF. Bioenergetic approaches for neuroprotection in Parkinson's disease[J]. Ann Neurol,2003,53 Suppl 3:S39-S47, S47-S48.

[10] 李強，王紅義，劉立夏，程琳，鄧永紅，馬鵬飛，段俊國. 銀杏葉制劑及其提取物對神經(jīng)保護的研究進展[J]. 中醫(yī)眼耳喉鼻雜志，2011，1(1)：51-54.

[11] Mueller H, Kassack MU, Wiese M. Comparison of the usefulness of the MTT, ATP, and calcein assays to predict the potency of cytotoxic agents in various human cancer cell lines[J]. J Biomol Screen,2004,9(6):506-515.

[12] Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays[J]. J Immunol Methods, 1983,65 (1-2):55-63.

[13] 方蓉，李芳秋，武建國. MTT比色法的條件探討[J]. 臨床檢驗雜志,2003(1):34-35.

[14] Green LM, Reade JL, Ware CF. Rapid colorimetric assay for cell viability: application to the quantitation of cytotoxic and growth inhibitory lymphokines[J]. J Immunol Methods,1984,70(2):257-268.

[15] Pauwels R, Balzarini J, Baba M, et al. Rapid and automated tetrazolium-based colorimetric assay for the detection of anti-HIV compounds[J]. J Virol Methods, 1988, 20(4):309-321.