靈芝孢子粉多糖含量檢測方法的優(yōu)化*

楊偉君，馬詩經(jīng)，焦春偉，楊詠善，陳家明，梁慧嘉，李良秋，謝意珍,**

（1.廣東粵微食用菌技術(shù)有限公司，廣東 廣州 510663；2.廣東省微生物研究所，廣東 廣州 510070）

靈芝孢子（Ganoderma lucidumspore） 是靈芝成熟時從菌蓋中彈射出來的極微小部分，是靈芝的生殖細胞，具有靈芝全部的遺傳活性物質(zhì)[1]。靈芝孢子粉含有多糖類、三萜類、核苷類、甾醇類等活性物質(zhì)以及有機鍺和硒等多種礦物元素（如K、Mg、Ca、Mn、Fe、Mo）[2]，具有補氣安神、健脾益肺作用，臨床上用于調(diào)節(jié)免疫[3]、抗腫瘤[4]、調(diào)節(jié)血脂、降低血糖[5]、保護神經(jīng)系統(tǒng)及心血管系統(tǒng)等[6]。近年來，靈芝栽培技術(shù)日趨成熟，靈芝孢子粉產(chǎn)量也逐步提高。國內(nèi)學(xué)者不斷深入研究靈芝孢子粉的活性成分和藥理作用，并以其為原料開發(fā)具調(diào)節(jié)免疫力等功能的保健食品。

目前，行業(yè)內(nèi)尚未制定靈芝孢子粉多糖含量檢測方法的國家標準，文獻報道測定靈芝孢子粉多糖含量的方法主要有苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法，部分研究者對以上2種方法的適用性、局限性等進行一些研究[7-8]，并發(fā)現(xiàn)苯酚-硫酸法在試驗數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性方面要優(yōu)于蒽酮-硫酸法[9-10]，由于苯酚-硫酸法所采用苯酚和濃硫酸試劑具有一定危害性，加之苯酚和硫酸的用量與多糖的組成結(jié)構(gòu)有關(guān)，過量的硫酸會造成顯色物質(zhì)的分解，影響測定結(jié)果[11-12]。因此，有必要對苯酚-硫酸法的檢測條件進行優(yōu)化。

本文在苯酚-硫酸法檢測條件的基礎(chǔ)上，通過單因素和正交試驗優(yōu)化了苯酚、濃硫酸用量，以及提取溫度、提取時間、料液比、乙醇濃度6個檢測條件對多糖含量的影響，確定了靈芝孢子粉多糖的最佳檢測條件，并分析了優(yōu)化后的檢測方法與現(xiàn)行的農(nóng)業(yè)標準《NY/T 1676-2008食用菌中粗多糖含量的測定》的差異，優(yōu)化后的靈芝孢子粉多糖檢測方法能有效減少檢測試劑苯酚和濃硫酸的使用量，具有實際應(yīng)用意義。

1　材料與方法

1.1　試劑與儀器

靈芝孢子粉，破壁處理，由廣東粵微食用菌技術(shù)有限公司提供；無水葡萄糖、苯酚、濃硫酸、無水乙醇等，分析純，購于廣州化學(xué)試劑廠。

5840R離心機，Eppendorf公司；UV-1750紫外分光光度計，島津公司；DK-8D恒溫水浴鍋，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；DHG-9053A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.2　材料

1.2.1靈芝孢子粉多糖的制備

分別稱取2份靈芝孢子粉40 g，加蒸餾水400 mL，浸潤15 min，加熱回流提取3 h，提取2次，過濾，合并濾液，減壓濃縮至50 mL，經(jīng)噴霧干燥即得靈芝孢子粉多糖提取物。另一份濃縮液加入3倍體積的無水乙醇溶液，于4℃冰箱中靜置過夜，抽濾，依次用無水乙醇溶液、丙酮、乙醚洗滌沉淀2次～3次，60℃干燥，得靈芝孢子粉多糖。

1.2.2溶液的配制

葡萄糖標準溶液配制：精密稱取105℃干燥恒重葡萄糖10mg，置于100 mL量瓶中，用純化水溶解并定容至100 mL，搖勻即得0.1 mg·mL-1標準儲備液，備用。

5%苯酚溶液配制：取苯酚150 g，加鋅粉0.2 g和無水碳酸鈉0.1 g，蒸餾收集182℃餾分，稱取此餾分50.0 g置于1000 mL容量瓶中，加水溶解定容，搖勻后置于棕色瓶中，放入冰箱避光保存，備用。

1.3　靈芝孢子粉多糖檢測方法的優(yōu)化

1.3.1最大吸收波長的確定

分別吸取“1.2.2”中制備的葡萄糖標準液和“1.2.1”中制備的靈芝孢子粉多糖溶液各1.0mL，置于25 mL具塞試管中，分別加入5%苯酚溶液1.5 mL，搖勻后分別迅速加入濃硫酸7.0 mL，30℃水浴30 min，以相應(yīng)試劑空白為參比，采用紫外可見分光光度計進行掃描，波長范圍400 nm～600 nm，確定其最大吸收波長。

1.3.2分光光度法測定靈芝孢子粉多糖含量

分別稱取“1.2.1”中制備的0.25 g靈芝孢子粉粗多糖提取物，按料液比1:40加入水，置于90℃水浴3 h，5000 r·min-1離心15min后取上清液，加5倍量無水乙醇，于4℃冰箱中靜置過夜，沉淀物加水溶解至100 mL，即得靈芝孢子粉多糖溶液。取1.0 mL靈芝孢子粉多糖溶液于25mL具塞試管中，加入5%苯酚溶液0.5mL和濃硫酸溶液2.5mL，搖勻，沸水浴反應(yīng)30 min，冷卻后測其吸光度值，平行測定3次，在“1.3.1”項確定的檢測波長處測定吸光度，多糖含量按文獻[13]方法計算。

1.3.3單因素試驗

（1）苯酚和濃硫酸用量的確定

分別取2份“1.3.2”中制備的靈芝孢子粉多糖溶液1.0mL于25 mL具塞試管中，加入1.5 mL 5%苯酚溶液、7.0 mL濃硫酸溶液為體系A(chǔ)，加入0.5 mL 5%苯酚溶液、2.5 mL濃硫酸溶液為體系B，搖勻，沸水浴反應(yīng)30 min，冷卻后測其吸光度值，平行測定3次，確定檢測試劑苯酚和濃硫酸的使用量。

（2） 提取溫度

稱取3份靈芝孢子粉粗多糖提取物樣品0.25 g，按“1.3.2”項中的方法提取多糖，固定提取時間為3 h，提取料液比為1:40，加入5倍量無水乙醇，0.5 mL 5%苯酚溶液，2.5 mL濃硫酸溶液，搖勻，沸水浴反應(yīng)30 min，冷卻后測其吸光度值。設(shè)置提取溫度為80℃、90℃、100℃，考察不同提取溫度對多糖檢測的影響。

（3） 提取時間

稱取3份靈芝孢子粉粗多糖提取物樣品0.25 g，按“1.3.2”項中方法提取多糖，固定提取溫度為90℃，提取料液比為1:40，加入5倍量無水乙醇，其余操作同1.3.3（2） 項。設(shè)置提取時間為1 h、2 h、3 h，考察不同提取時間對多糖檢測的影響。

（4） 提取料液比

稱取3份靈芝孢子粉粗多糖提取物樣品0.25 g，按“1.3.2”項中方法提取多糖，固定提取溫度為90℃，提取時間為3 h，加入5倍量無水乙醇，其余操作同1.3.3（2） 項。設(shè)置不同料液比1:20、1:40、1:60，考察不同料液比對多糖檢測的影響。

（5） 乙醇濃度

稱取3份靈芝孢子粉粗多糖提取物樣品0.25 g，按“1.3.2”項中方法提取多糖，固定提取溫度為90℃，料液比為1:40，提取時間為3 h，無水乙醇，其余操作同1.3.3（2） 項。設(shè)置加入5倍量濃度為75%、85%和無水乙醇，考察不同乙醇濃度對多糖檢測的影響。

1.3.4正交試驗

根據(jù)單因素試驗，擬定對測定靈芝孢子粉多糖含量影響的3個因素，提取溫度（a）、提取時間（b）、提取料液比（c） 為優(yōu)選因素，進一步考察以上因素對靈芝孢子粉多糖含量的影響，優(yōu)化檢測方法。正交試驗因素水平見表1。

表1　正交試驗因素水平表Tab.1　Factors and levels of orthogonal test

1.3.5標準曲線的繪制

精密吸取葡萄糖標準液0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL，加水至1 mL，加入 0.5 mL 5%苯酚和2.5 mL濃硫酸，搖勻，沸水浴反應(yīng)30 min，冷卻后，以空白試劑作為參比，在由1.3.1項確定的最大吸收波長處測定其吸光度值。以葡萄糖質(zhì)量濃度（C） 為橫坐標，吸光度（A） 為縱坐標，繪制葡萄糖標準液濃度與吸光度的標準曲線。

1.3.6精密度試驗

取適量“1.3.5”項中的葡萄糖標準液于試管中，加水至1 mL，按“1.3.5”項中方法測定吸光度，連續(xù)進樣測定5次，計算RSD值。

1.3.7穩(wěn)定性試驗

取“1.3.2”項中制備的靈芝孢子粉多糖溶液適量，按照“1.3.5”項下方法顯色，分別放置0、10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min 進樣測定，記錄吸光度。

1.3.8重復(fù)性試驗

精密稱取“1.3.2”項下同一批靈芝孢子粉多糖適量，共6份，按照“1.3.5”項下方法顯色，進樣測定，記錄吸光度。

1.3.9加標回收率試驗

取“1.2.1”中制備的已知靈芝孢子粉多糖含量的樣品6份，每份約0.1 g，精密稱取，分別加入葡萄糖儲備液適量，按照“1.3.5”項下方法顯色，測定吸光度，計算加標回收率[14]。

1.3.10不同檢測方法對多糖含量的研究

目前尚未頒布關(guān)于多糖檢測方法的國家標準，食用菌企業(yè)制定多糖類產(chǎn)品的質(zhì)量標準時多采用食用菌農(nóng)業(yè)標準《NY/T 1676-2008食用菌中粗多糖含量的測定》。因此，本文在確定靈芝孢子粉最優(yōu)檢測方法的基礎(chǔ)上，與食用菌農(nóng)業(yè)標準方法進行比較研究，進一步探討不同檢測方法對靈芝孢子粉多糖含量的影響。

2　結(jié)果與討論

2.1　最大吸收波長的確定

葡萄糖和靈芝孢子粉多糖的最大吸收波長如圖1所示。

圖1　葡萄糖和靈芝孢子粉多糖的最大吸收波長Fig.1　Maximum absorption wavelength of glucose and Ganoderma lucidum spore powder polysaccharides

由圖1結(jié)果可知，葡萄糖標準溶液和靈芝孢子粉多糖溶液均在489 nm附近處有最大吸收度，說明以葡萄糖為標品測定靈芝孢子粉多糖含量的方法可靠。故選取489 nm作為靈芝孢子粉多糖的檢測波長。

2.2　苯酚和濃硫酸用量的確定

不同苯酚與濃硫酸用量的影響如表2所示。

表2苯酚與濃硫酸用量對靈芝孢子粉多糖含量的影響Tab.2 Effect of phenol and concentrated sulfuric acid on the contents of Ganoderma lucidum spore powder polysaccharides

表2結(jié)果表明，2個體系中苯酚與濃硫酸的添加量均能有效測定靈芝孢子粉多糖的含量，但體系B測得的靈芝孢子粉多糖含量高于體系A(chǔ)，說明苯酚和濃硫酸使用量越大時，靈芝孢子粉多糖含量呈下降趨勢，可能是由于加入過多的濃硫酸會使得多糖碳化嚴重[15]，同時大量使用濃硫酸存在安全隱患。因此，選擇體系B作為后續(xù)檢測的用量。

2.3　提取溫度對多糖含量的影響

提取溫度對靈芝孢子粉多糖含量的影響見圖2。

圖2　提取溫度對靈芝孢子粉多糖含量的影響Fig.2　Effectof extraction temperatures on the contents of Ganoderma lucidum spore powder polysaccharides

由圖2結(jié)果可知，提取溫度對靈芝孢子粉多糖檢測的影響較大，多糖含量隨溫度升高而增加，提取溫度為80℃時，靈芝孢子粉多糖含量較低，而溫度從90℃升至100℃時，多糖含量的增幅較小。因此，選擇90℃作為后續(xù)檢測試驗的提取溫度。

2.4　提取時間對多糖含量的影響

提取時間對測定靈芝孢子粉多糖含量影響，見圖3。

由圖3結(jié)果可知，在提取溫度90℃、料液比1:40條件下，延長提取時間，有利于增加靈芝孢子粉提取物中多糖的溶出，提取時間3 h時，多糖含量比提取時間2 h增加明顯，因此，選擇3 h為測定靈芝孢子粉多糖含量的提取時間。

圖3　提取時間對靈芝孢子粉多糖含量的影響Fig.3　Effectof extraction times on the contents of Ganoderma lucidum spore powder polysaccharides

2.5　提取料液比對多糖含量的影響

提取料液比對靈芝孢子粉多糖含量的影響，見圖4。

圖4　提取料液比對靈芝孢子粉多糖含量的影響Fig.4　Effectof extraction solid-liquid ratios on the contents of Ganoderma lucidum spore powder polysaccharides

由圖4結(jié)果可知，隨著提取料液比的增加，靈芝孢子粉多糖含量呈增加的趨勢，說明增加水溶劑，能使更多的靈芝孢子粉提取物中多糖溶解，而料液比1:60較1:40增加不明顯，即料液比為1:40時，靈芝孢子粉提取物中的多糖已基本提取完全。

2.6　乙醇濃度對多糖含量的影響

乙醇濃度對靈芝孢子粉多糖含量影響見圖5。

由圖5可知，隨著乙醇濃度的增加，獲得靈芝孢子粉多糖也隨之增加。采用無水乙醇進行醇沉?xí)r，獲得靈芝孢子粉多糖較乙醇濃度為75%、85%時量多，因此，選擇無水乙醇作為多糖醇沉溶劑。

2.7　正交試驗結(jié)果

正交試驗及直觀分析和方差分析結(jié)果，見表3、表4。

由表3、表4可知，影響因素主次順序為提取時間＞提取溫度＞提取料液比。其中a因素中以k2最大，b因素中以k3最大，c因素中以k2最大，故選擇最佳檢測條件為b2a3c2，即提取溫度90℃，料液比注：F0.05（2，2） =19。Note:F0.05（2，2） =19.為1:40，提取時間3.0 h，采用無水乙醇沉淀靈芝孢子粉多糖。

圖5　乙醇濃度對靈芝孢子粉多糖含量的影響Fig.5　Effectof ethanol concentrations on the contents of Ganoderma lucidum spore powder polysaccharides

表3　正交試驗結(jié)果及其直觀分析表Tab.3　The results of orthogonal testand intuitive analysis

表4　方差分析結(jié)果Tab.4　Variance analysis results

2.8　標準曲線的繪制

以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標，吸光度A為縱坐標，繪制葡萄糖標準曲線見圖6所示。由結(jié)果可知，葡萄糖濃度在 0.02mg·mL-1～0.1mg·mL-1的范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。其回歸方程為y=14.595x-0.0009，R2=0.9993。

圖6　葡萄糖標準曲線Fig.6　Standard curve of glucose

2.9　方法學(xué)試驗結(jié)果

2.9.1精密度試驗

精密度試驗結(jié)果見表5。

表5　精密度試驗結(jié)果Tab.5　Results of precision test

由表5結(jié)果可知，吸光度RSD值為0.74%，表明儀器精密度良好。

2.9.2穩(wěn)定性試驗

穩(wěn)定性試驗結(jié)果見表6。由表6可知，多糖含量的RSD值為0.38%，說明該方法在60min內(nèi)穩(wěn)定。

表6　穩(wěn)定性試驗結(jié)果Tab.6　Results of stability test

2.9.3重復(fù)性試驗

重復(fù)性試驗結(jié)果見表7。

表7　重復(fù)性試驗結(jié)果Tab.7　Results of repeatability test

由表7結(jié)果可知，多糖含量的RSD值為0.44%，表明優(yōu)化后的方法重現(xiàn)性良好。

2.9.4加標回收試驗

加標回收率試驗結(jié)果見表8。

表8　加標回收率試驗結(jié)果Tab.8　Sample recovery test for the determination

由表8結(jié)果可知，加標回收率為99.54%，RSD值為0.90%，表明優(yōu)化后的方法準確性良好。

2.10　不同檢測方法對靈芝孢子粉多糖含量的影響

不同檢測方法對多糖含量的影響見表9。

表9　不同檢測方法對靈芝孢子粉多糖含量的影響Tab.9　Effectof different detectionmethods on contentof Ganoderma lucidum spore powder polysaccharide

由表9結(jié)果可知，本文優(yōu)化后的檢測方法所測得的靈芝孢子粉多糖含量與農(nóng)業(yè)標準《NY/T 1676-2008食用菌中粗多糖含量的測定》所規(guī)定的方法結(jié)果相差較小，說明減少檢測試劑苯酚濃硫酸的使用量，仍能有效檢測出靈芝孢子粉多糖，且不影響其含量測定結(jié)果。

3　結(jié)論

目前，國內(nèi)大多數(shù)食用菌企業(yè)采用農(nóng)業(yè)標準《NY/T 1676-2008食用菌中粗多糖含量的測定》中苯酚-硫酸法檢測食用菌及其多糖含量，但苯酚-硫酸法在實際檢測過程中檢測試劑苯酚及濃硫酸的使用量過大，既不符合“綠色經(jīng)濟”的理念，也不利于檢測操作安全。因此，本文采用單因素試驗考察了苯酚濃硫酸用量、提取溫度、提取時間、提取料液比以及乙醇濃度對測定靈芝孢子粉多糖含量的影響，并且在此基礎(chǔ)上，利用正交試驗優(yōu)化了反應(yīng)條件，進一步分析優(yōu)化后的檢測方法，與農(nóng)業(yè)標準NY/T 1676-2008對測定靈芝孢子粉多糖含量的影響一致。

靈芝孢子粉多糖的最佳測定條件為：5%苯酚0.5 mL、濃硫酸2.5 mL，提取溫度90℃，提取3 h，料液比為1:40。結(jié)果表明，經(jīng)過優(yōu)化后的苯酚-硫酸法測定靈芝孢子粉多糖準確可靠，穩(wěn)定性和重復(fù)性較好，與農(nóng)業(yè)標準《NY/T 1676-2008食用菌中粗多糖含量的測定》所規(guī)定的方法結(jié)果相差較小。然而后者方法中所使用苯酚與濃硫酸的量為前者的一倍，可見優(yōu)化后的檢測方法不僅能降低有危害性試劑（苯酚、濃硫酸）的使用量，同時也能夠準確測定靈芝孢子粉中多糖含量，具有較好的應(yīng)用價值。

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