基于ITS系列分析鑒定野生靈芝屬菌種*

袁 濱，嚴(yán)俊杰，柯麗娜，張志鴻，賴碧梅

（1.漳州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，福建 漳州 363005；2.福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，菌物研究中心，福建 福州 350002）

漳州位于福建省東南部，地處東經(jīng)117～118、北緯23.8～25之間，轄區(qū)地勢由北西向東南傾斜，西北多山，東南瀕海，氣候溫和，屬亞熱帶季風(fēng)性濕潤氣候，自然條件獨特，環(huán)境條件復(fù)雜多樣，食用、藥用菌資源豐富[1]。筆者從南靖等地采集、分離到多個野生大型真菌菌種，同時成功馴化栽培部分菌株，如編號為西靈5的靈芝屬（Ganoderma）菌株，其子實體朵形漂亮，出芝整齊，產(chǎn)量較高，極具開發(fā)利用價值。該試驗以分離菌種為材料，通過ITS序列克隆與分析，對其進(jìn)行分子鑒定和栽培出菇試驗，旨在鑒定其遺傳進(jìn)化關(guān)系，進(jìn)而為開發(fā)利用當(dāng)?shù)匾吧秤?、藥用菌的菌種資源提供研究基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1　試驗材料

1.1.1供試菌種

試驗菌種如表1所示。

1.1.2培養(yǎng)基

表1　供試菌種Tab.1　Introduction of tested strains

液體培養(yǎng)基：去皮土豆200 g，切塊后加水煮爛（約25 min），再用紗布過濾去掉土豆渣，定容至1 L，然后加入葡萄糖 5 g·L-1、蔗糖 15 g·L-1、磷酸二氫鉀2 g·L-1、硫酸鎂1 g·L-1，熔化后再定容至1 L即可。固體培養(yǎng)基：液體培養(yǎng)基中加入瓊脂粉18 g·L-1。pH 自然，121℃滅菌 20min。

1.1.3試劑

DNA提取試劑：CTAB抽提液：2%CTAB，EDTA （pH8.0） 20 mmol·L-1， Tris-HCl（pH8.0） 100 mmol·L-1， NaCl 1.4 mol·L-1； CTAB 沉 淀 液 ： 1%CTAB， EDTA （pH8.0）10 mmol·L-1， Tris-HCl（pH8.0） 50 mmol·L-1；CTAB/NaCl（200 mL）：去離子水 150 mL，NaCl 8.2 g，CTAB 20 g，65℃加熱攪拌，定容至200mL；TE緩沖液：EDTA 1mmol·L-1，Tris-HCl 10 mmol·L-1。其他：DNA Marker、10×buffer、rTaq酶、dNTPs等均購自寶生物工程（大連）有限公司，其它試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純試劑。ITS引物和內(nèi)切酶，購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司，稀釋后濃度為10mol·L-1。

1.2　方法

1.2.1菌絲體分離純化

將采集回來的子實體進(jìn)行組織分離，挑尖端菌絲2次，獲得純培養(yǎng)物，保藏于冰箱，工作溫度4℃。

1.2.2菌株的分子鑒定

（1） 基因組DNA的提取

將7個菌株接種于液體培養(yǎng)基，26℃培養(yǎng)12 d后，收集菌絲1.5 g。各菌株基因組DNA的提取參考CTAB法[2-3]，改進(jìn)后提取各供試菌株的DNA。

（2） ITS系列PCR擴(kuò)增

采用真菌通用引物ITS1、ITS4對樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR體系如表2所示。

ITS-PCR程序：94℃預(yù)變性5min；94℃變性45s，54℃退火45 s，72℃延伸1 min，35個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。

表2　PCR擴(kuò)增體系Tab.2　Reaction systems of PCR

ITS-PCR產(chǎn)物的檢測：取ITS-PCR產(chǎn)物6μL加入1μL 6×溴酚藍(lán)上樣緩沖液，混勻，1.0%瓊脂糖凝膠（含0.5μg·mL-1GoldviewTMDNA染料） 進(jìn)行電泳，電壓為4 V·cm-1，電泳1 h后通過凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照。

（3）ITS片段的克隆與測序

按照pMD18-TVector的說明書進(jìn)行操作。陽性克隆經(jīng)PCR驗證后，委托上海生工進(jìn)行測序。在GenBank上對所得序列進(jìn)行BLAST比對分析[4-6]，采用MEGA5.10軟件，Clustalw進(jìn)行多序列比對，NJ法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，自檢值（Bootstrap） 設(shè)置為1000，確定供試菌株的分類地位。

（4） 栽培出芝試驗

為初步探索野生菌株代料栽培的可能性與開發(fā)利用潛力，于2016年8月進(jìn)行大棚栽培試驗。栽培料配方：闊葉樹雜木屑85%、麩皮10%、豆粕2%、輕質(zhì)碳酸鈣3%，各物料混合均勻后堆積發(fā)酵30 d，期間翻堆4次，處理方法同參考文獻(xiàn)[7]。裝袋后常壓滅菌12 h，（25±1）℃室內(nèi)養(yǎng)菌，28 d左右菌絲滿袋，統(tǒng)一后熟7 d，之后在大棚內(nèi)開袋進(jìn)行出芝管理[8-10]。

2　結(jié)果與分析

2.1　野生菌種基因組DNA的提取和PCR擴(kuò)增結(jié)果

采用CTAB改良法提取各菌株的基因組DNA，用分光光度計檢測OD260/OD280的比值在1.8～2.0，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示DNA純度較高，結(jié)構(gòu)完整，無明顯降解。各野生菌種DNA的電泳圖見圖1，從左至右依次為：MK、白靈芝、白芝2號、西靈1、西靈5、長泰靈芝、松杉靈芝、農(nóng)大靈芝。

從圖1可以看出，供試菌株西靈5、農(nóng)大靈芝的PCR產(chǎn)物片段大小為700 bp～750 bp，與預(yù)期結(jié)果較為一致，表明該方法提取獲得的DNA質(zhì)量較好，可以用于后續(xù)分子鑒定。

圖1　野生菌種DNA電泳圖Fig.1　DNA electrophoretogram ofwild strains

2.2　構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹

將PCR產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序，并將各菌株測序后的結(jié)果在Gen Bank上進(jìn)行比對，同時采用MEGA5.10軟件，Clustalw進(jìn)行多序列比對，NJ法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，自檢值（Bootstrap） 設(shè)置為1000，上述7種真菌的BLAST比對結(jié)果見表3和圖2。

表3　7種真菌的BLAST比對結(jié)果Tab.3　BLAST comparison of 7 fungi

測序結(jié)果顯示白靈芝、白芝2號、西靈1、西靈5、長泰靈芝、松杉靈芝、農(nóng)大靈芝的ITS序列分別為 655 bp、696 bp、638 bp、734 bp、669 bp、684 bp、705 bp?；究梢悦鞔_白芝2號為雅致栓孔菌（Trametes elegans），西靈 1為假芝 （Amauroderma rugosum），西靈5和長泰靈芝為韋伯靈芝（Ganoderma weberianum），松杉靈芝為赤芝（Ganoderma lucidum），農(nóng)大靈芝與四川靈芝（Ganoderma sichuanense）接近，白靈芝與Nemania bipapillata較接近。

2.3　栽培試驗結(jié)果及子實體形態(tài)特征

初步對7個供試菌株進(jìn)行栽培出芝試驗，具體見圖3。

圖3　野生靈芝子實體Fig.3　Wild Ganoderma lucidum fruiting body

從圖3可以看出，白芝2號、西靈5、農(nóng)大靈芝、西靈1等4個菌株成功培育出子實體。西靈5子實體單生，菌蓋半圓形，菌蓋表面新鮮時紫褐色，有漆樣光澤；菌蓋上表面生長初期和邊緣為白色，觸摸后變?yōu)楹稚?；菌柄偏短，?cè)生，與菌蓋同色；朵形漂亮，出芝整齊，產(chǎn)量較高。白芝2號子實體無明顯菌柄，新鮮時革質(zhì)，干后硬革質(zhì)，與培養(yǎng)基連接緊密；菌蓋半圓形、扇形；菌蓋表面白色、乳白色或淺灰白色，近基部有瘤狀突起。西靈1子實體單生，有菌柄，干后木栓質(zhì)；菌蓋近圓形，表面灰褐色至褐色，無光澤，具明顯同心環(huán)紋，無絨毛，中心部分凹陷；孔口表面新鮮時灰白色，手觸后變血紅色、黑色；菌肉褐色至深褐色。農(nóng)大靈芝分化不好。盡管還有3個菌株沒能培育出子實體，但4個出菇菌株的形態(tài)特征從側(cè)面佐證了分子生物學(xué)鑒定結(jié)果是可信的。

3　結(jié)論與討論

本研究通過ITS序列測序與分析，對采集到的6個野生真菌菌種進(jìn)行分子鑒定，結(jié)合傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)研究，初步確定西靈5等菌株的分類地位，并進(jìn)行了栽培出菇試驗，為西靈5、白芝2號、西靈1等菌株的開發(fā)利用提供了重要依據(jù)。

圖2　基于ITS構(gòu)建的NJ進(jìn)化樹Fig.2　NJevolutionary tree based on ITS

野生生物資源為生物資源的有效利用和開發(fā)奠定基礎(chǔ)，對野生大型真菌種質(zhì)資源的收集、馴化，已成為當(dāng)前科研工作的一個重點[11]。但單純依據(jù)形態(tài)學(xué)對野生大型真菌進(jìn)行分離鑒定存在諸多缺陷，尤其是一些形態(tài)特征相似的種，區(qū)分起來難度很大，這就需要結(jié)合分子生物學(xué)手段來進(jìn)行鑒定。在野生大型真菌的分類鑒定中，一般認(rèn)為菌株的ITS序列相似性達(dá)到或超過99%，可以認(rèn)為他們是同一個種。本研究結(jié)合形態(tài)學(xué)特征和ITS序列測序，可以確定西靈5等菌株的具體種屬，但并不能肯定白靈芝等的種屬，需要進(jìn)一步研究。

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