正交試驗(yàn)優(yōu)化黑輪層炭殼菌抗氧化活性成分提取工藝研究*

莫貴友，伍嬌琪，任青媛，賀新生，黃 毅

（西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川 綿陽(yáng) 621010）

黑輪層炭殼菌（Daldinia concentrica） 為炭角菌科（Xylariaceae） 炭輪菌屬 （Daldinia） 的1種高等真菌，在美洲、歐洲和亞洲等地區(qū)均有發(fā)現(xiàn)[1]。其主要生活于死亡和腐爛的木頭表面，危害樹(shù)木及建筑用木材，特別是生在栽培木耳、香菇、靈芝等經(jīng)濟(jì)真菌的椴木上，因而常被視為雜菌[2]。然而近年來(lái)，對(duì)該菌藥理活性和化學(xué)成分的研究發(fā)現(xiàn)，其具有廣泛的藥理學(xué)功效，其揮發(fā)油具有抗植物病原真菌作用[3]，香豆素和固醇類(lèi)成分具有抗癌和抗細(xì)菌作用[4]，特別是苯丙呋喃內(nèi)酯類(lèi)化合物Concentricolide還具有抗艾滋病病毒的作用[5]。這些研究均說(shuō)明該雜菌可能具有一定的開(kāi)發(fā)價(jià)值。

大量研究試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，過(guò)多的活性氧會(huì)損害機(jī)體，導(dǎo)致細(xì)胞DNA損傷，并可誘發(fā)心臟病、癌癥和衰老等[6]。而抗氧化劑是一類(lèi)能夠保護(hù)機(jī)體免受因自由基產(chǎn)生的氧化損傷的重要物質(zhì)。因此，抗氧化劑特別是天然抗氧化劑的發(fā)現(xiàn)近年來(lái)獲得科學(xué)和工業(yè)界愈來(lái)愈多的關(guān)注[7]。課題組在對(duì)天然大型真菌抗氧化劑的初步篩選系列工作中發(fā)現(xiàn)黑輪層炭殼菌有較強(qiáng)的抗氧化活性，由于氧化壓力與諸多疾病的成因有關(guān)，為了該菌生物活性評(píng)價(jià)的開(kāi)發(fā)以及抗氧化活性物質(zhì)后續(xù)分離工作的開(kāi)展，本試驗(yàn)采用正交試驗(yàn)對(duì)黑輪層炭殼菌抗氧化活性成分的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，為后續(xù)分離工作的開(kāi)展和該菌的應(yīng)用開(kāi)發(fā)提供一定的理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1　供試菌株

黑輪層炭殼菌子實(shí)體，見(jiàn)圖1。于2016年采自四川省綿陽(yáng)市北川縣，經(jīng)本文作者之一，菌物學(xué)教授賀新生鑒定為炭角菌科，炭輪菌屬的黑輪層炭殼菌，拉丁名Daldinia concentrica(Bolton)Ces.&De Not.,Comm.Soc.crittog.Ital.1(4):197(1863)?，F(xiàn)菌種憑證標(biāo)本保存于西南科技大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室。真菌子實(shí)體用純水清除外部雜質(zhì)，室外風(fēng)干后于50℃烘干至恒重。干燥的子實(shí)體粉碎過(guò)50目篩，避光干燥保存?zhèn)溆?。整個(gè)提取工藝優(yōu)化試驗(yàn)在1個(gè)月內(nèi)完成。

圖1　樹(shù)干上的野生子囊果和子囊果橫切面Fig.1　Wild ascocarp on the trunk and cross-section of the ascocarp

1.2　試劑

DPPH（1，1-二苯-2-苦肼自由基） 購(gòu)自梯希愛(ài)（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司，無(wú)水乙醇購(gòu)自成都市科龍化工試劑廠，以上試劑均為分析純。純水為實(shí)驗(yàn)室自制（電阻率為18 MΩ·cm）。

1.3　設(shè)備

可見(jiàn)光分光光度計(jì)，7200型，龍尼柯（上海）儀器有限公司；小型中藥材粉碎機(jī)，上海淀久中藥機(jī)械廠；渦旋混合器，XH-C型，金壇市天竟實(shí)驗(yàn)儀器廠；小型離心機(jī)，D1008E型，美國(guó)Scilogex有限公司；數(shù)控超聲波清洗器，KQ-200KDE型，昆山市超聲儀器有限公司；電子天平，BSA124S型，德國(guó)賽多利斯有限公司。

1.4　試驗(yàn)方法

1.4.1樣品提取

本試驗(yàn)采用超聲輔助提取方法（超聲功率恒定為200W），基本方案為準(zhǔn)確稱(chēng)取500 mg的黑輪層炭殼菌粉末于具塞錐形瓶中，加入10 mL無(wú)水乙醇，封口并記錄瓶重，超聲提取10min后，按記錄重量補(bǔ)充原溶劑后，將提取液于10000 r·min-1離心1 min，取上清液用于DPPH抗氧化活性檢測(cè)，每個(gè)樣品平行制樣3組。

1.4.2DPPH抗氧化活性檢測(cè)

提取物抗氧化活性通過(guò)DPPH自由基清除率進(jìn)行判定，采用文獻(xiàn) [8]的方法略作修改。準(zhǔn)確移取200μL樣品溶液與4 mL DPPH溶液（30 mg·mL-1，由無(wú)水乙醇配制，該溶液517 nm處吸光度值在0.8附近）置于試管中，渦旋混勻后避光5min，10000 r·min-1離心1 min，取上清轉(zhuǎn)入比色皿，室溫下測(cè)定517 nm處吸收值。該值伴隨自由基清除劑量的增多而減弱[9]，樣品抗氧化能力可用清除率（scavenging rate，簡(jiǎn)寫(xiě)為SR，%）來(lái)表示，計(jì)算公式如下：

式中：Ai為0.2 mL測(cè)試溶液與4 mL DPPH溶液混合后的吸光度值；Aj為0.2 mL測(cè)試溶液與4 mL無(wú)水乙醇溶劑混合后的吸光度值；A0：0.2 mL制備測(cè)試溶液時(shí)所用溶劑與4 mLDPPH溶液混合后的吸光度值。

1.4.3單因素試驗(yàn)

影響提取效果的因素主要包括乙醇濃度、浸提溫度、提取時(shí)間和固液比，通過(guò)初步考察發(fā)現(xiàn)浸提溫度對(duì)提取物抗氧化活性影響不大，因此選取剩余3因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)。在固定其他因素水平情況下，分別考察了提取液醇水比（即乙醇濃度，100%、60%、50%、40%和0），浸提時(shí)間（5min、30 min、60 min、90 min和120 min） 和固液比3:100（即30 mg·mL-1）、9:100（即90 mg·mL-1）、3:20（即150 mg·mL-1）和3:10（即300mg·mL-1）。為保證固液比測(cè)定的準(zhǔn)確性，不同固液比提取的最終溶液均稀釋到相同濃度進(jìn)行抗氧化活性測(cè)試比較。以上所有試驗(yàn)均同時(shí)制備3組。

1.4.4正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，在各因素試驗(yàn)的自由基清除率極大值附近選取4個(gè)水平，以DPPH自由基清除率為指標(biāo)，設(shè)計(jì)三因素四水平正交水平表L16（43）進(jìn)行正交試驗(yàn)（見(jiàn)表1），優(yōu)化黑輪層炭殼菌中抗氧化活性成分的提取工藝。

表1 L16（43）正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)Tab.1　Factors and levels in the L16(43)orthogonal test

2　試驗(yàn)結(jié)果

2.1　單因素試驗(yàn)

2.1.1乙醇濃度對(duì)抗氧化活性的影響

溶劑中乙醇濃度對(duì)抗氧化活性的影響情況，見(jiàn)圖2。

圖2　溶劑中乙醇濃度對(duì)抗氧化活性的影響Fig.2　Effectof ethanol concentrations on the antioxidative activity

從圖2可以看出，無(wú)水乙醇和純水均不能最大化提取黑輪層炭殼菌中的抗氧化活性物質(zhì)，伴隨著乙醇濃度的升高，DPPH自由基清除率逐步增大，在60%時(shí)該值基本達(dá)到最大值，所獲提取液抗氧化活性最強(qiáng)。

2.1.2提取時(shí)間對(duì)抗氧化活性的影響

提取時(shí)間對(duì)抗氧化活性的影響情況見(jiàn)圖3。

圖3　提取時(shí)間對(duì)抗氧化活性的影響Fig.3　Effectof extraction time on the antioxidative activity

從圖3可以看出，伴隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)（5 min～90 min），DPPH清除率逐漸增大，90 min后DPPH清除率隨時(shí)間的延長(zhǎng)增大不明顯且有所減少。該結(jié)果說(shuō)明提取時(shí)間對(duì)抗氧化活性成分的浸出有較大幫助，但過(guò)長(zhǎng)的時(shí)間并不能帶來(lái)提取效果的繼續(xù)增加且對(duì)工業(yè)生產(chǎn)成本不利。

2.1.3固液比對(duì)抗氧化活性的影響

固液比對(duì)抗氧化活性物質(zhì)提取的影響情況，見(jiàn)圖4。

圖4　固液比對(duì)抗氧化活性物質(zhì)提取的影響Fig.4　Effectof solid-liquid ratio on the antioxidative activity

從圖4可以看出，固液比在3:100（30mg·mL-1）～9:100（90 mg·mL-1）時(shí)，DPPH自由基的清除率隨著固液比的增大逐漸增大。當(dāng)固液比超過(guò)9:100（90 mg·mL-1）時(shí)，清除率反而隨之下降，說(shuō)明固液比過(guò)分增大時(shí)，不易從黑輪層炭殼菌中提取抗氧化活性成分。結(jié)合圖4顯示固液比在9:100（90 mg·mL-1）時(shí)，DPPH自由基清除率最大。

2.2　正交試驗(yàn)

正交試驗(yàn)結(jié)果和分析見(jiàn)表2和表3。

極差R值分析表明，3種因素的主次關(guān)系是RB>RC>RA，即乙醇濃度（B） ＞固液比（C） ＞提取時(shí)間（A）。因此最佳組合為A1B1C1，即浸泡超聲提取時(shí)間30 min，乙醇濃度100%，固液比為3:100（即30 mg·mL-1）。按照正交試驗(yàn)所確定的最佳提取條件進(jìn)行驗(yàn)證性試驗(yàn)，計(jì)算得到黑輪層炭殼菌抗氧化活性物質(zhì)DPPH自由基清除率為76.87%，對(duì)比自由基清除率最大值為60.38%，證明正交試驗(yàn)結(jié)果對(duì)黑輪層炭殼菌抗氧化活性成分提取的優(yōu)化作用明顯。

表2　正交試驗(yàn)結(jié)果Tab.2　Results of the orthogonal test

表3　正交試驗(yàn)結(jié)果分析Tab.3　Data analysis of the orthogonal test

3　結(jié)論

全球范圍內(nèi)真菌資源豐富[10]，是活性天然產(chǎn)物開(kāi)發(fā)的巨大源泉。由于抗氧化活性和很多疾病治療的聯(lián)動(dòng)效應(yīng)，真菌資源中的抗氧化活性化合物的發(fā)現(xiàn)更應(yīng)該成為科學(xué)和工業(yè)界關(guān)注的熱點(diǎn)。

在真菌中，常見(jiàn)的抗氧化活性成分主要有多酚類(lèi)、三聯(lián)苯類(lèi)、聚酮類(lèi)、生物堿、萜類(lèi)、甾體和多糖類(lèi)[11]。目前，黑輪層炭殼菌中已發(fā)現(xiàn)的化學(xué)成分包括倍半萜烯、角鯊烯型三萜類(lèi)化合物和麥角甾醇等[12-15]，但并沒(méi)有關(guān)于這些化學(xué)成分的抗氧化活性報(bào)道。唯一報(bào)道具有自由基清除作用的是Lee于2015年從該菌中分離出來(lái)的異吲哚啉酮衍生物 Daldinan A[16]。因此，該菌中抗氧化活性成分的物質(zhì)基礎(chǔ)是哪個(gè)或哪類(lèi)化合物實(shí)際還并不清晰。

本文通過(guò)單因素試驗(yàn)和L16（43）正交試驗(yàn)，得到了從黑輪層炭殼菌中獲得抗氧化活性成分的最佳提取條件：提取時(shí)間30min，乙醇濃度100%，固液比3:100（即30 mg·mL-1）。其中乙醇濃度對(duì)抗氧化活性物質(zhì)的提取影響最大。以上的試驗(yàn)結(jié)果，為該菌抗氧化活性成分未來(lái)分離工藝摸索和該菌作為食（藥）用保健品的開(kāi)發(fā)打下良好基礎(chǔ)。

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