結核感染T細胞斑點試驗在惡性腫瘤并發(fā)結核病患者中的應用價值

廉娟雯　黨麗云　許家玲　樊宇

結核病是由結核分枝桿菌引起的一種慢性傳染性疾病，以肺結核為主。WHO發(fā)布的2016年全球結核病報告中指出，結核病仍然排在全部死亡原因中的前10名，我國是全球結核病高負擔國家之一，結核感染及發(fā)病人數(shù)眾多[1]。惡性腫瘤嚴重危害人類健康，在我國的發(fā)病率和死亡率居高不下，成為中國人群死亡的首要原因和主要的公共健康問題[2]。近年來，惡性腫瘤并發(fā)結核病的患者呈遞增趨勢，特別是肺結核并發(fā)肺癌，已經(jīng)成為危害人們健康的嚴重疾病之一[3]。結核病與惡性腫瘤的病因、組織病理學變化、臨床進程、治療與預后迥然不同，但臨床癥狀、影像學檢查表現(xiàn)及實驗室檢查之間又有相似[4]，例如肺結核與肺癌、淋巴結結核與淋巴瘤、結核性漿膜腔積液與惡性漿膜腔積液等。臨床治療過程中，及時準確地判斷惡性腫瘤患者是否并發(fā)結核感染，對患者治療方案的選擇、經(jīng)濟花費及預后均有重要意義。γ干擾素釋放試驗(interferon-γ release assay，IGRA)作為診斷結核分枝桿菌潛伏感染的新方法，近年來被廣泛應用于臨床。IGRA主要用于對缺少細菌學診斷依據(jù)的活動性結核病的輔助診斷，結核分枝桿菌潛伏感染的檢測及免疫抑制或缺陷者的結核分枝桿菌潛伏感染的篩查[5]。筆者以惡性腫瘤并發(fā)結核病患者、初診疑似結核病但經(jīng)病理診斷為惡性腫瘤的患者、單純結核病患者為研究對象，評價結核感染T細胞斑點試驗(T-SPOT.TB)檢測惡性腫瘤并發(fā)結核病患者的應用價值。

對象和方法

一、研究對象

1.對象選擇：選取西安市胸科醫(yī)院2016年1—12月期間收治的確診為惡性腫瘤并發(fā)結核病的患者102例，最初懷疑結核但最后確診為惡性腫瘤的患者64例，單純結核病患者80例。102例惡性腫瘤并發(fā)結核病患者中，45例為肺癌并發(fā)結核病，19例為消化道惡性腫瘤并發(fā)結核病，14例為血液系統(tǒng)惡性腫瘤并發(fā)結核病，11例為乳腺癌并發(fā)結核病，6例為泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤并發(fā)結核病，5例為縱隔惡性腫瘤并發(fā)結核病，2例為甲狀腺癌并發(fā)結核病。惡性腫瘤并發(fā)結核病患者的平均年齡為(63.25±8.15)歲，惡性腫瘤患者的年齡為(61.38±6.80)歲，單純結核病患者的平均年齡為(42.76±11.24)歲。

2.結核病的判定標準[6]：(1)具有發(fā)熱、咳嗽、胸痛、氣短、淋巴結腫大等臨床表現(xiàn)及影像學表現(xiàn)，且涂片或培養(yǎng)抗酸染色陽性；(2)組織穿刺活檢病理提示結核?。?3)臨床表現(xiàn)、實驗室檢查及影像學檢查表現(xiàn)支持結核病，且抗結核藥物治療有效。滿足以上條件之一即診斷為結核病。

3.惡性腫瘤的判定標準：經(jīng)組織及細胞病理學檢查診斷為惡性腫瘤，包括穿刺活檢、切除組織活檢、支氣管鏡活檢標本和漿膜腔積液細胞塊，病理診斷參照WHO相關標準。

二、檢測方法

1. T-SPOT.TB檢測：T-SPOT.TB檢測應用結核分枝桿菌特異抗原，分別為早期分泌性抗原靶蛋白6(early secreted antigenic target 6，ESAT-6)和培養(yǎng)濾液蛋白10(culture filtrate protein10，CFP-10)，即A刺激原和B刺激原。A刺激原和B刺激原與患者外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)培養(yǎng)18～22 h后進行酶聯(lián)免疫斑點法(enzyme linked immunospot assay，ELISPOT)檢測。嚴格按照 T-SPOT.TB 試劑盒(購自英國Oxford Immunotec公司)的操作規(guī)范檢測 A、B 抗原對T細胞的刺激反應。取患者的靜脈血4 ml，采用 Ficoll分離法分離PBMC，用細胞培養(yǎng)基AIM-V重懸細胞，調整至2.5×106個/ml。在已包被抗γ干擾素(IFN-γ)抗體的96孔板中，加入細胞培養(yǎng)基為空白對照，以50 μl植物血凝素作為陽性對照，分別以結核分枝桿菌特異性ESAT-6和CFP-10肽段(終濃度為10 μg/ml)作為刺激原。孵化后用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌4次，應用ELISPOT計數(shù)儀進行斑點閱讀與統(tǒng)計。以ESAT-6或CFP-10檢測孔任一個達到以下標準者判定為陽性：如果空白對照孔斑點數(shù)<5個，以檢測孔斑點數(shù)減去空白對照孔斑點數(shù)≥6為陽性；如果空白對照孔斑點數(shù)≥6個，以檢測孔斑點數(shù)>2倍空白對照孔的斑點數(shù)為陽性。根據(jù)A和B抗原陽性反應類型分為A+B+、A+B-、A-B+和A-B-等4種T-SPOT.TB反應類型，按照試劑盒對T-SPOT.TB陽性的判定，將出現(xiàn)A+或B+或A+B+的患者都判讀為T-SPOT.TB反應陽性。

2.抗酸桿菌染色：抗酸桿菌染色法是在加熱條件下，患者體液、分泌物及穿刺物標本中的分枝桿菌與石碳酸復紅牢固結合成復合物，用鹽酸酒精處理也不脫色，當再加堿性美藍染色液復染后，分枝桿菌仍然為紅色，而其他細菌及背景中的物質為藍色?？顾崛旧噭┵徸陨虾＞鹕锛夹g有限公司。

3.卡介菌素純蛋白衍生物(purified protein derivative oftuberculin，PPD)試驗：PPD(50 IU/ml)0.1 ml前臂皮內注射72 h后觀察結果，判斷標準：浸潤硬結平均直徑<5 mm為陰性，>5 mm為陽性。試劑購自北京祥瑞生物制品有限公司。

4.結核抗體檢測：采用酶聯(lián)免疫吸附試驗。添加洗滌液后，觀察膜上斑點情況確定檢測結果，膜上出現(xiàn)紅色斑點則為陽性，否則為陰性。結核抗體檢測試劑購自武漢康珠生物制品有限公司。

三、統(tǒng)計學分析

采用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料采用率值(%)進行統(tǒng)計學描述，應用χ2檢驗進行統(tǒng)計學檢驗；采用中位數(shù)(四分位數(shù)：Q1，Q3)對呈偏態(tài)分布類型的計量資料進行統(tǒng)計學描述，應用秩和檢驗進行統(tǒng)計學檢驗。敏感度=真陽性人數(shù)/(真陽性人數(shù)+假陰性人數(shù))×100%；特異度=真陰性人數(shù)/(真陰性人數(shù)+假陽性人數(shù)))×100%。一致性檢驗采用Kappa檢驗，Kappa值大說明一致性好。統(tǒng)計學檢驗以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結　　果

一、T-SPOT.TB檢測結果

T-SPOT.TB檢測惡性腫瘤并發(fā)結核病組的總陽性率為85.29%，高于檢測惡性腫瘤組總陽性率(26.56%)，差異有統(tǒng)計學意義；惡性腫瘤并發(fā)結核病組檢測A、B抗原同時陽性的陽性率為69.61%，高于惡性腫瘤組的20.31%，差異有統(tǒng)計學意義；A抗原和B抗原檢測單一陽性率在兩組中比較差異無統(tǒng)計學意義，見表1。而惡性腫瘤并發(fā)結核病組及單純結核病組患者行T-SPOT.TB檢測結果的比較顯示，各種類型檢測結果的陽性率差異均未見統(tǒng)計學意義，見表2。進一步比較A、B抗原反應點數(shù)，惡性腫瘤并發(fā)結核病組與單純結核病組患者A抗原陽性斑點數(shù)的中位數(shù)(四分位數(shù)：Q1，Q3)分別為56.50(30.25，83.25)個和45.50(32.00，75.00)個；惡性腫瘤并發(fā)結核病組與單純結核病組患者B抗原陽性斑點數(shù)的中位數(shù)(四分位數(shù)：Q1，Q3)分別為63.50(43.25，98.00)個和55.00(24.00，101.50)個，兩組比較差異均未見統(tǒng)計學意義(Z值分別為-0.66 和-0.30，P值分別為 0.539和0.796)。

二、T-SPOT.TB 與其他檢測方法的比較

應用抗酸染色和(或)病理檢查、PPD試驗和結核抗體檢測對惡性腫瘤并發(fā)結核病組和惡性腫瘤組進行檢測，結果見表3。T-SPOT.TB檢測的敏感度為85.29%(87/102)，PPD試驗和結核抗體檢測的敏感度分別為41.18%(42/102)和56.86%(58/102)。T-SPOT.TB檢測、PPD試驗、結核抗體檢測的特異度分別為73.44%(47/64)、68.75%(44/64)、59.38%(38/64)。以抗酸染色和(或)病理檢查作為金標準，T-SPOT.TB、PPD試驗、結核抗體檢測的結果分別與之比較，Kappa值分別為0.61、0.06、0.20。

表1　T-SPOT.TB檢測惡性腫瘤并發(fā)結核病組及惡性腫瘤組患者結果的比較[例(陽性率，%)]

表2　T-SPOT.TB檢測惡性腫瘤并發(fā)結核病組及單純結核病組患者結果的比較[例(陽性率，%)]

表3　不同檢測方法對于惡性腫瘤并發(fā)結核病患者診斷情況的比較

討　　論

結核病是 T 細胞介導的保護性免疫反應和病理學免疫反應調控失衡的免疫疾病。機體的免疫功能尤其是細胞免疫狀態(tài)也是誘導發(fā)病、疾病進展和惡化至關重要的生物學因素[7]。有研究發(fā)現(xiàn)，肺結核患者有向高齡匯聚的趨勢[8]。與之相反，我國惡性腫瘤患者發(fā)病年齡趨于年輕化，隨著治療手段的提高，惡性腫瘤患者生存期延長，這使得惡性腫瘤并發(fā)結核病的患者增多，尤其肺結核并發(fā)肺癌的發(fā)病例數(shù)愈來愈多[9]。Simonsen等[10]、Nalbandian等[11]研究發(fā)現(xiàn)，肺結核患者并發(fā)肺癌、胸膜間皮瘤、霍奇金淋巴瘤等惡性腫瘤的概率高于正常人群，結核病變或可促進惡性腫瘤的發(fā)病。國內學者的研究也發(fā)現(xiàn)，惡性腫瘤患者結核病的患病率明顯高于正常人群[12-13]。惡性腫瘤并發(fā)結核病已成為危害人類健康的主要疾病之一，成為流行性疾病研究的重點[11-15]。

對于惡性腫瘤并發(fā)結核病患者，特別是惡性腫瘤診斷治療后出現(xiàn)疑似結核感染的患者，結核病的診斷是否成立對患者治療方案的選擇至關重要。但因惡性腫瘤并發(fā)結核病患者臨床癥狀及體征不典型，不具有特異性，且兩種疾病可出現(xiàn)某些相似的影像學表現(xiàn)，臨床上極易漏診或誤診[16]。現(xiàn)有的結核病診斷方法中，病理診斷及抗酸染色特異度高，但陽性率低?？顾釛U菌檢測陽性率在結核病患者中大約為30%左右，病理檢測因其有創(chuàng)性、病變部位及患者條件等各方面限制不能在所有患者中進行，有時也難以與其他肉芽腫病變相鑒別[17]。由于我國結核感染人數(shù)眾多，且廣泛接種卡介苗，PPD試驗及結核抗體檢測特異度較差。近年來，兩種商業(yè)化IGRA的興起為臨床診斷結核病提供了新的思路。T-SPOT.TB檢測PBMC中致敏淋巴細胞受到結核分枝桿菌特異性抗原刺激后釋放的IFN-γ水平，重點檢測活細胞的功能[18]，刺激原 ESAT-6 及CFP-10 抗原基因嚴格限制于結核分枝桿菌復合群及 4 種非結核分枝桿菌，保證了試驗的特異度。因為T-SPOT.TB在檢測結核分枝桿菌感染方面具有更好的特異度和敏感度，臨床廣泛用于篩查和輔助診斷結核病[19-20]。有學者觀察了T-SPOT.TB檢測陽性人群A、B抗原的點數(shù)，發(fā)現(xiàn)A抗原50%檢出率對應的陽性斑點數(shù)為72個，B抗原50%檢出率對應的陽性斑點數(shù)為67個。在低斑點數(shù)時B抗原陽性率高，高斑點數(shù)時A抗原陽性率高；A抗原陽性率在不同斑點數(shù)分布中較均勻，B抗原只在較低及較高斑點數(shù)陽性率高。據(jù)此推斷A抗原斑點數(shù)或與結核活動性呈正相關，B抗原或可在較低斑點數(shù)時篩出結核感染患者[21]。某些并發(fā)癥可造成T-SPOT.TB檢測敏感度及特異度的降低[22-23]，有研究對影響T-SPOT.TB檢測結果的因素進行了分析，認為年齡、肺部基礎病變、免疫抑制狀態(tài)及惡性腫瘤不會對檢測結果產(chǎn)生影響。T-SPOT.TB檢測在惡性腫瘤并發(fā)結核病患者中的應用目前報道較少。本次研究發(fā)現(xiàn)，在惡性腫瘤并發(fā)結核病患者與單純結核病患者比較中，T-SPOT.TB檢測陽性率差異無統(tǒng)計學意義，A、B抗原反應陽性斑點數(shù)差異無統(tǒng)計學意義。T-SPOT.TB檢測惡性腫瘤并發(fā)結核病患者的敏感度為85.29%，與Meta分析顯示T-SPOT.TB檢測結核病患者的敏感度(85%)相似[24]；在惡性腫瘤并發(fā)結核病患者中，T-SPOT.TB檢測的敏感度和特異度優(yōu)于PPD試驗和結核抗體檢測。與抗酸桿菌染色和(或)病理檢查比較，只有T-SPOT.TB的Kappa值大于0.6，其余均小于0.2，說明T-SPOT.TB與真實情況一致性比較高，準確性更好。

本研究中，PPD試驗的敏感度只有41.18%，明顯低于國內外的相關報道，這或許與納入腫瘤類型有關。如本研究納入了一些血液系統(tǒng)惡性腫瘤患者，這類患者的免疫情況普遍偏低，可能造成PPD試驗無反應或反應弱。本研究數(shù)據(jù)顯示，T-SPOT.TB檢測的特異度為73.44%，稍低于Meta分析中的特異度(84%)[22]。分析原因，或許與樣本量有關，或可能因為本研究在計算特異度時，納入的對照組人群為初診疑似結核但最后確診為惡性腫瘤的患者，因惡性腫瘤患者中結核病發(fā)病率較正常人群高，無法判定所入組的對照人群中是否含有潛伏感染者。這也可能導致T-SPOT.TB檢測結核病的特異度被低估及非結核組患者T-SPOT.TB檢測陽性率高于相關報道。關于各種原因對結果是否有影響，筆者將會在以后的研究中進一步進行分層分析。

綜合本研究結果，在惡性腫瘤并發(fā)結核病患者的診斷中，T-SPOT.TB顯示出較好的敏感度及特異度，并發(fā)惡性腫瘤對患者的T-SPOT.TB檢測結果未見明顯影響。T-SPOT.TB明顯優(yōu)于PPD試驗和結核抗體檢測，可廣泛應用于惡性腫瘤患者疑似并發(fā)結核感染的篩查，為患者診斷治療提供更多依據(jù)。

[1] World Health Organization. Global tuberculosis report 2016. Geneva: World Health Organization,2016.

[2] Cai Y,Xue M,Chen W, et al. Expenditure of hospital care on cancer in China, from 2011 to 2015. Chin J Cancer Res,2017, 29(3): 253-262.

[3] 李華, 梁博文, 卜建玲, 等. 肺結核合并肺癌156例臨床分析. 中國防癆雜志, 2013, 35(4): 268-272.

[4] 馬玙. 肺結核與肺癌. 中國實用內科雜志, 2015, 35(8): 675-678.

[5] 全國第五次結核病流行病學抽樣調查技術指導組, 全國第五次結核病流行病學抽樣調查辦公室. 2010年全國第五次結核病流行病學抽樣調查報告. 中國防癆雜志, 2012, 34(8): 485-508.

[6] 中華人民共和國衛(wèi)生部. 肺結核診斷標準(WS 288—2008). 北京: 人民衛(wèi)生出版社, 2008: 1-3.

[7] 呂子征, 王偉, 劉京銘, 等. 初治結核病患者自噬相關基因表達水平的研究. 中國防癆雜志, 2017, 39(1): 82-85.

[8] 黃麥玲, 馬麗萍. 肺結核合并肺癌的臨床研究進展. 臨床肺科雜志, 2013, 18(3): 523-525.

[9] 覃海園, 葉建忠. 老年人晚期肺癌合并肺結核的臨床回顧性研究. 中外醫(yī)療, 2016, 35(9): 19-21.

[10] Simonsen DF, Farkas DK, S?gaard M, et al. Tuberculosis and risk of cancer: a Danish nationwide cohort study. Int J Tuberc Lung Dis, 2014, 18(10): 1211-1219.

[11] Nalbandian A, Yan BS, Pichugin A, et al. Lung carcinogenesis induced by chronic tuberculosis infection: the experimental model and genetic control. Oncogene, 2009, 28(17): 1928-1938.

[12] 柴梅, 史清明, 顧康生. 合肥地區(qū)惡性腫瘤患者中肺結核的患病率調查. 中華疾病控制雜志, 2015, 19(6): 564-566.

[13] 高建飛, 趙勇, 朱宇澤, 等. 惡性腫瘤合并肺結核110例臨床分析. 實用醫(yī)學雜志, 2006, 22(3): 313-314.

[14] Kuo SC, Hu YW, Liu CJ, et al. Association between tuberculosis infections and non-pulmonary malignancies: a nationwide population-based study. Br J Cancer, 2013, 109(1): 229-234.

[15] 馬玙，朱莉貞，潘毓萱. 結核病. 北京: 人民衛(wèi)生出版社, 2009: 454-459.

[16] 李成海, 邱萬成, 周新華, 等. 71例肺結核并發(fā)肺癌患者的CT表現(xiàn)特征及臨床病理分析. 中國防癆雜志, 2017, 39(6): 576-580.

[17] 張登才, 劉斌, 張麗華, 等. 抗酸染色在結核病病理診斷中的價值. 中國防癆雜志, 2014, 36(4): 274-278.

[18] 吳雪瓊, 梁艷, 王國治. γ干擾素釋放試驗臨床應用的價值、問題與展望. 中國防癆雜志, 2015, 37(7): 722-727.

[19] 吳妍, 李琦, 張宗德. γ-干擾素釋放試驗對老年肺結核的輔助診斷價值. 中國防癆雜志, 2016, 38(2): 122-128.

[20] 李同心, 何瑛, 周剛, 等. 全血γ-干擾素釋放試驗在結核病輔助診斷中的價值. 中國防癆雜志, 2016, 38(8): 623-629.

[21] 藺詠梅, 江自成, 皇甫彤, 等. T細胞斑點試驗AB抗原檢測結果對結核感染患者診斷意義探討. 臨床和實驗醫(yī)學雜志, 2014, 13(20): 1674-1678.

[22] Yu Y, Zhao X, Wang W, et al. Diagnostic performance of interferon-gamma releasing assay in HIV-infected patients in China. PLoS One, 2013, 8(8): e70957.

[23] Santin M, Muoz L, Rigau D. Interferon-γ release assays for the diagnosis of tuberculosis and tuberculosis infection in HIV-infected adults: a systematic review and meta-analysis. PLoS One, 2012, 7(3): e32482.

[24] Dai Y, Feng Y, Xu R, et al. Evaluation of interferon-gamma release assays for the diagnosis of tuberculosis: an updated meta-analysis. Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 2012, 31(11): 3127-3137.