松葉豬毛菜葉片原生質(zhì)體的制備及優(yōu)化

席昱欣，張玉慧，聞志彬

(1.中國科學(xué)院新疆生態(tài)與地理研究所,荒漠與綠洲生態(tài)國家重點實驗室，新疆 烏魯木齊 830011；2.新疆抗逆植物基因資源保育與利用重點實驗室，新疆 烏魯木齊 830011；3.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049；4.中國-塔吉克斯坦生物資源保育與利用聯(lián)合實驗室，新疆 烏魯木齊 830011；5.中國科學(xué)院新疆生態(tài)與地理研究所標本館，新疆 烏魯木齊 830011)

植物原生質(zhì)體是植物細胞去除細胞壁以外各種結(jié)構(gòu)的總稱，并且能夠進行一定的生命活動［1］。原生質(zhì)體由于失去了細胞壁的保護，可攝取DNA、質(zhì)粒、病毒等外源物質(zhì)［2］，實現(xiàn)外源基因功能、蛋白亞細胞定位以及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用等方面研究［3-5］，是植物分子遺傳和植物育種領(lǐng)域理想的實驗材料。獲得植物原生質(zhì)體的方法有機械法和酶解法，其中，酶解法是目前應(yīng)用最多最廣泛的分離方法。將植物材料置于能溶解細胞壁的酶解液中，待細胞壁溶解后釋放出原生質(zhì)體［6］。通過前人不斷優(yōu)化實驗條件，模式植物如擬南芥（Arabidopsis thaliana）［7-8］、煙草（Nicotiana tabacum）［9-10］、水稻(Oryza sativa)［11］的原生質(zhì)體制備技術(shù)、轉(zhuǎn)化及再生體系已較為完備并得到廣泛應(yīng)用，非模式植物如非洲菊（Gerbera hybrida）［12］、黑麥草（Lolium perenne）［13］、莧菜（Amaranthus tricolor）［14］、山茶花（Camellia sinensis）［15］、陸地棉(Gossypium hirsutum)［16］、油棕(Elaeis guineensis)［17］、葡萄（Vitis vinifera）［18］、甜櫻桃（Prunusavium）［19］的制備與轉(zhuǎn)化體系也不斷發(fā)展。雖然，模式植物如擬南芥、煙草的制備及轉(zhuǎn)化體系已經(jīng)十分完備且方便易得，但由于遺傳背景不同，基因在模式植物中異源表達可能與其在本底植物中的表達存在差異［20］。植物原生質(zhì)體分離的原理雖相似，但目前并沒有一種通用的原生質(zhì)體制備及轉(zhuǎn)化體系，僅有研究者建立了適用于被子植物花器官和果實的原生質(zhì)體制備和轉(zhuǎn)化體系［21］。因此，建立不同物種的原生質(zhì)體制備及轉(zhuǎn)化體系對于自身基因功能的驗證及挖掘具有重要的意義。

松葉豬毛菜（Salsola laricifolia）隸屬藜科豬毛菜族，小灌木，主要分布于蒙古、蘇聯(lián)、中亞地區(qū)及中國［22］，廣泛分布于礫質(zhì)山坡和礫質(zhì)荒漠［23］?；谒扇~豬毛菜的解剖結(jié)構(gòu)、超微結(jié)構(gòu)及酶活性等指標，確定松葉豬毛菜為C3-C4中間型植物（C3到C4途徑進化的中間類型）［24-26］。研究C3-C4中間型植物的解剖結(jié)構(gòu)、生理生化特性和特殊功能基因，有助于探究C4植物的高光效機制以及進化意義。因此，松葉豬毛菜作為典型的C3-C4中間型荒漠植物，建立完備的原生質(zhì)體制備體系是建立其他技術(shù)體系（如蛋白亞細胞定位、瞬時表達分析、蛋白質(zhì)間互作）的前提，這對于該物種特殊功能基因的挖掘以及進化意義的探索具有十分重要的意義。本研究以松葉豬毛菜無菌組培苗真葉為實驗材料，對纖維素酶、離析酶、甘露醇濃度以及酶解時間4 個因素進行正交實驗，探究酶解液組成與酶解時間對原生質(zhì)體制備的影響，并在此基礎(chǔ)上利用PEG介導(dǎo)法驗證松葉豬毛菜NADP-蘋果酸酶基因4(SaNADP-ME4)的亞細胞定位。

1 材料與方法

1.1 植物材料

松葉豬毛菜種子于2020年10月采自北疆，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩７N子用無菌水浸泡15 min，次氯酸鈉溶液洗滌8 min，無菌水沖洗5 次，75%酒精洗滌30 s，種衣劑福美雙（稱取1 g 福美雙溶于15～20 mL ddH2O）洗滌30 s，直接播種于1/2 MS 固體培養(yǎng)基上，在人工氣候箱中萌發(fā)7 d(白天：25 ℃，14 h；夜晚：18 ℃，10 h；光照6000 Lux)，挑選長勢好并且大小一致的幼苗移植入新的1/2 MS固體培養(yǎng)瓶中，人工氣候箱其他條件不變，光照設(shè)為12000 Lux。

1.2 載體及試劑

過表達載體pBI121-SaNADP-ME4 及pBI121-GFP空載的大腸菌株為本實驗室保存，具有卡那霉素抗性基因和GFP報告基因。已有研究表明，SaNADP-ME4［27］編碼一種646 個氨基酸的蛋白質(zhì)，前人利用擬南芥原生質(zhì)體進行激光共聚焦成像發(fā)現(xiàn)該蛋白質(zhì)定位于葉綠體中。纖維素酶Cellulase R-10、離析酶Macerozyme R-10、D-甘露醇、牛血清白蛋白（BSA）、質(zhì)粒小提試劑盒Plasmid Mini Kit 購自相關(guān)生物公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 酶解液配制

酶解液成分為：4.265 g·L-1MES、1.000 g·L-1BSA、1.110 g·L-1CaCl2、甘露醇、纖維素酶R-10、離析酶R-10（纖維素酶、離析酶和甘露醇濃度配比如表1 所示）。酶解液需現(xiàn)配現(xiàn)用，配置時甘露醇與MES溶解后于55 ℃水浴10 min，冷卻至室溫后加入BSA 和CaCl2，纖維素酶和離析酶最后加入，酶解液配置好后用0.22 μm無菌過濾器過濾除菌。

表1 原生質(zhì)體分離的正交實驗因素水平Tab.1 Orthogonal experiment factor level of protoplast isolation

1.4 原生質(zhì)體的分離

取100 mg松葉豬毛菜無菌組培苗真葉，在超凈工作臺里用無菌解剖刀將葉片從中間縱向剖開，置于0.7 mol·L-1甘露醇溶液中質(zhì)壁分離10 min，將葉片轉(zhuǎn)移至1 mL 酶解液（37 ℃水浴激活5 min）中，25 ℃避光酶解數(shù)小時（酶解時間如表1 所示），取出后輕柔顛倒幾次，充分釋放出原生質(zhì)體。

1.5 原生質(zhì)體的純化

用W5 溶液（成分為：0.900 g·L-1葡萄糖、9.000 g·L-1NaCl、13.875 g·L-1CaCl2、0.370 g·L-1KCl 及0.853 g·L-1MES；pH 5.8）提前潤洗200目篩網(wǎng)，過濾酶解液，去除殘余未分解的植物組織；向酶解過濾液中加入等體積的W5 溶液終止酶解反應(yīng)（剪去槍頭尖端，并沿管壁緩慢環(huán)加），4 ℃下800 rpm·min-1離心5 min；棄上清，加入500 μL W5 溶液懸浮清洗底部原生質(zhì)體；4 ℃下800 rpm·min-1離心5 min；棄上清，加入200 μL W5溶液重懸底部原生質(zhì)體（全程溫和操作，避免劇烈搖動原生質(zhì)體），即獲得松葉豬毛菜原生質(zhì)體懸浮液，置于4 ℃冰箱備用。

1.6 原生質(zhì)體的活力測定及計數(shù)

利用伊文思藍染色法測定原生質(zhì)體活力：用剪去槍頭尖端的移液器吸取50 μL原生質(zhì)體懸浮液置于載玻片上，滴加20 μL 0.25%伊文思藍染液，靜置5 min 后在光學(xué)顯微鏡下觀察，檢測原生質(zhì)體活性。原生質(zhì)體活力計算公式：原生質(zhì)體活力=（視野內(nèi)未被染色的原生質(zhì)體數(shù)÷視野內(nèi)原生質(zhì)體總數(shù)）×100%。

采用血球計數(shù)法計算原生質(zhì)體的產(chǎn)量：用乙醇溶液輕輕擦拭血球計數(shù)板，清水沖洗干凈，濾紙擦干；用擦鏡紙擦拭光學(xué)顯微鏡的物鏡及目鏡；將潔凈的蓋玻片蓋在血球計數(shù)板中央計數(shù)區(qū)，用剪去槍頭尖端的移液器吸取原生質(zhì)體懸浮液滴加于蓋玻片一側(cè)，讓其滲入計數(shù)室中，靜置片刻待原生質(zhì)體懸浮液不再流動且完全沉降至血球計數(shù)室內(nèi)，即可開始計數(shù)。25×16 規(guī)格的血球計數(shù)板，取視野中的左上、左下、右上、右下及中央中方格為計數(shù)區(qū)域，每個中方格包含16 個小方格，總計80 個小方格。計數(shù)80個小方格內(nèi)原生質(zhì)體的數(shù)目，每組原生質(zhì)體懸浮液進行3次計數(shù)。原生質(zhì)體數(shù)目計算方法參照25×16 規(guī)格血球計數(shù)板計算公式［28］。原生質(zhì)體數(shù)目/100 mg=5 個中方格內(nèi)的原生質(zhì)體數(shù)/80×400×104×稀釋倍數(shù)。

1.7 原生質(zhì)體分離正交實驗

在前期預(yù)實驗的基礎(chǔ)上，采用正交實驗設(shè)計四因素三水平，共計9 組處理，每組處理3 個重復(fù)，比較纖維素酶濃度、離析酶濃度、甘露醇濃度和酶解時間對松葉豬毛菜組培苗真葉原生質(zhì)體分離產(chǎn)量和活力的影響（表1）。

1.8 外源基因在原生質(zhì)體中的轉(zhuǎn)化

將制備好的原生質(zhì)體溶液在4 ℃下800 rpm·min-1離心5 min；棄上清，用1 mL MMG 溶液（成分為：73.000 g·L-1甘露醇、1.430 g·L-1MgCl2、0.853 g·L-1MES；pH 5.8）重懸原生質(zhì)體；利用廣泛使用且高效的PEG介導(dǎo)法［29］進行轉(zhuǎn)化：用剪去槍頭尖端的移液器吸取100 μL 的原生質(zhì)體溶液于1.5 mL 的離心管中，將10 μL pBI121-SaNADP-ME4-GFP質(zhì)粒載體加入管底，輕彈管底混勻；再加入110 μL PEG 溶液(成分為：400.000 g·L-1PEG4000、36.500 g·L-1甘露醇、11.100 g·L-1CaCl2；pH 5.8)，緩慢倒置幾次混勻；靜置20 min 完成轉(zhuǎn)化；加入440 μL W5 溶液混勻終止轉(zhuǎn)化反應(yīng)；800 rpm·min-1離心3 min；棄上清，用1 mL WI溶液（成分為：73.000 g·L-1甘露醇、0.853 g·L-1MES、1.490 g·L-1KCL；pH 5.8）重懸原生質(zhì)體，室溫黑暗過夜孵育；800 rpm·min-1離心3 min，去除800 μL 上清，濃縮原生質(zhì)體溶液，取適量制片；以轉(zhuǎn)化pBI121-GFP空載的原生質(zhì)體做對照，于激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察GFP的表達情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 松葉豬毛菜組培苗真葉原生質(zhì)體的分離

收集移植在1/2 MS 固體培養(yǎng)瓶中的松葉豬毛菜幼苗，每組處理稱取100 mg 幼苗真葉，將葉片從中間縱向剖開，置于0.7 mo·L-1的甘露醇溶液中質(zhì)壁分離10 min（圖1a），將葉片轉(zhuǎn)移到1 mL酶解液中酶解（圖1b）。

圖1 松葉豬毛菜真葉原生質(zhì)體分離Fig.1 Protoplast isolation of Salsola laricifolia

2.2 酶解液組合、甘露醇濃度、酶解時間對原生質(zhì)體產(chǎn)量、活力的影響

按照正交實驗設(shè)計四因素三水平的9個實驗組合，進行松葉豬毛菜真葉原生質(zhì)體的分離，對產(chǎn)量及活力進行統(tǒng)計并對產(chǎn)量數(shù)據(jù)進行極差分析（表2）。對原生質(zhì)體產(chǎn)量影響的結(jié)果顯示，纖維素酶濃度的極差最高，表明實驗設(shè)計的4個因素中，纖維素酶濃度對松葉豬毛菜真葉原生質(zhì)體分離產(chǎn)量的影響最為顯著。此外，甘露醇濃度的極差僅次于纖維素酶濃度，表明甘露醇濃度是松葉豬毛菜真葉原生質(zhì)體分離產(chǎn)量的另一重要因素。酶解時間及離析酶濃度的極差較小，表明在該實驗設(shè)計的四個因素的三個水平下，二者對原生質(zhì)體分離產(chǎn)量的影響小于纖維素酶和甘露醇濃度造成的影響。對原生質(zhì)體活力影響的結(jié)果顯示酶解時間的極差最高，甘露醇濃度的極差僅次于酶解時間，說明酶解時間對于原生質(zhì)體活力的影響最大，維持溶液滲透壓的甘露醇濃度對于原生質(zhì)體制備活力也存在十分顯著的影響。

表2 不同條件下獲得松葉豬毛菜原生質(zhì)體的產(chǎn)量及活力的極差分析Tab.2 Protoplast yield and viability of Salsola laricifolia under different conditions

對各組正交實驗條件下原生質(zhì)體分離的產(chǎn)量以及活力數(shù)據(jù)進行分析，第5 組的原生質(zhì)體產(chǎn)量最高，達到每100 mg 真葉1.21×106個，第6 組和第9 組產(chǎn)量也較高，分別為每100 mg 真葉6.99×105個和6.97×105個，以上3組實驗條件制備的原生質(zhì)體形態(tài)呈飽滿的球狀，葉綠體清晰可見，且數(shù)量能滿足后續(xù)實驗要求。但第6組和第9組所得的原生質(zhì)體活力較第5 組低，可能由于酶解時間的延長或纖維素酶濃度過高對原生質(zhì)體細胞產(chǎn)生了損傷。第2組原生質(zhì)體活力略高于第5組，但其產(chǎn)量遠不及第5組，可能由于纖維素酶含量較低，未能使原生質(zhì)體充分得以釋放。結(jié)合酶的用量，酶解時間以及原生質(zhì)體活力因素，第5 組與第6 組相比，酶用量少，耗費時間短；第5 組與第9 組相比，酶用量少,細胞碎片少；第5組與第2組相比，耗費時間短且產(chǎn)量高。因此，纖維素酶濃度為2%、離析酶濃度為0.5%、甘露醇濃度為0.6 mol·L-1為松葉豬毛菜真葉制備原生質(zhì)體的最佳酶解液組合，2 h為最佳酶解時間。

松葉豬毛菜無菌組培苗真葉原生質(zhì)體在光學(xué)顯微鏡下呈大小不一的球體，光滑飽滿，葉綠體清晰可見的分布于細胞邊緣（圖2a、圖2b）。

圖2 光學(xué)顯微鏡下松葉豬毛菜無菌組培真葉原生質(zhì)體形態(tài)Fig.2 Protoplast morphology of euphylla in aseptic tissue culture of Salsola laricifolia microscope

2.3 原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化研究

以上述最佳條件制備得到的松葉豬毛菜無菌組培苗真葉原生質(zhì)體作為受體，以植物瞬時表達載體pBI121-SaNADP-ME4 質(zhì)粒及pBI121-GFP空載質(zhì)粒（對照）為目標DNA，利用PEG介導(dǎo)法導(dǎo)入原生質(zhì)體細胞中，室溫過夜孵育，在激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察GFP 蛋白的熒光信號。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)化2種質(zhì)粒的原生質(zhì)體細胞呈透明狀，形狀規(guī)則且沒有破損（圖3）。以藍光（460～480 nm）作為激發(fā)光時，轉(zhuǎn)化pBI121-SaNADP-ME4 質(zhì)粒載體的原生質(zhì)體可在葉綠體內(nèi)觀察到GFP蛋白綠色熒光（圖3a、圖3b、圖3c、圖3d），而空載質(zhì)粒導(dǎo)入的原生質(zhì)體只在細胞質(zhì)中發(fā)出綠色熒光，葉綠體內(nèi)無明顯熒光(圖3e、圖3f、圖3g、圖3h)。綜上所述，空載質(zhì)粒只在細胞質(zhì)中表達熒光，而pBI121-SaNADP-ME4質(zhì)粒載體在葉綠體上發(fā)出綠色熒光，說明SaNADP-ME4 定位于葉綠體。

圖3 pBI121-SaNADP-ME4轉(zhuǎn)化松葉豬毛菜原生質(zhì)體的顯微觀察Fig.3 Microscopic observation of Salsola laricifolia protoplasts transformed by pBI121-SaNADP-ME4

3 討論

原生質(zhì)體分離過程中有多種因素會影響原生質(zhì)體的產(chǎn)量和活力，例如植物材料的選擇、材料預(yù)處理、酶解液組合、滲透壓選擇、酶解時間、純化轉(zhuǎn)速及溫度等［6,30-31］。植物材料的選擇是成功分離原生質(zhì)體的基礎(chǔ)，通常選擇取材較簡單且富含組織細胞的葉片，且幼嫩的葉片分離效果較好，并且采用無菌組培苗可免去材料表面消毒的工作，還能減少后續(xù)實驗染菌的可能［32］，本研究采用25 d苗齡的組培苗葉片作為實驗材料。對材料進行預(yù)處理會大大提升分離效率，分離高粱（Sorghum bicolor）原生質(zhì)體時，將葉片置于甘露醇溶液中進行質(zhì)壁分離預(yù)處理，有利于維持離體葉片的滲透壓，提高分離效率［33］；對擬南芥、煙草進行葉片原生質(zhì)體分離時，利用膠帶去除植物葉下表皮組織，省去了純化過程，一定程度上提高分離效率［34］；分離沙冬青子葉原生質(zhì)體時，將葉片切成約1 mm寬的細條，增大了植物材料與酶解液的接觸面積，利于達到較高的分離效率［35］。由于松葉豬毛菜的葉片較細小，去除下表皮較為困難，所以采用縱向剖開細小葉片，并置于0.7 mol·L-1甘露醇溶液中進行質(zhì)壁分離預(yù)處理來提高分離產(chǎn)量。

原生質(zhì)體分離酶解液的組成是分離成功與否的關(guān)鍵因素［16］。纖維素酶可以去除細胞壁主要成分，離析酶是比果膠酶溫和的消化細胞骨架中骨膠質(zhì)成分的酶［36］，2 種酶結(jié)合使用最為廣泛［37］。由于制備原生質(zhì)體選擇的植物材料的細胞壁組成成分存在差異，2種酶濃度配比也不盡相同，如非洲菊葉片原生質(zhì)體采用2%纖維素酶和0.3%離析酶得到最佳制備產(chǎn)量［12］；多年生黑麥草葉片原生質(zhì)體采用2%纖維素酶和0.5%離析酶為最優(yōu)酶解液組合［13］。由于原生質(zhì)體不具備細胞壁，極易受滲透壓的影響而導(dǎo)致質(zhì)膜受損，酶解液中的滲透壓也需要嚴格控制。最常用的滲透壓穩(wěn)定劑為甘露醇，其特點是不易被細胞吸收利用［38］。酶解液的pH也需要維持于穩(wěn)定水平，常用MES 作為pH 穩(wěn)定劑［39］。制備草莓葉片原生質(zhì)體時，選擇0.9 mol·L-1的甘露醇［40］，分離葡萄原生質(zhì)體時，0.6 mol·L-1的甘露醇可以維持滲透壓［18］。本實驗使用纖維素酶和離析酶進行酶解，甘露醇維持滲透壓，MES作為pH穩(wěn)定劑，所制備的松葉豬毛菜原生質(zhì)體效果較好。

酶解時間是影響分離效率的又一重要因素，酶解時間過長會導(dǎo)致原生質(zhì)體質(zhì)膜受損，導(dǎo)致碎片增多；時間過短，分離的原生質(zhì)體量太少，無法進行后續(xù)實驗［13,33］。酶解時間在不同物種中差異很大，一般在3［14］～24 h［41］不等。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著酶解時間的延長，酶量也會隨之增加，但會導(dǎo)致細胞碎片增多，分離得到的原生質(zhì)體活力降低，可能是由于較長時間的酶解，會對原生質(zhì)體質(zhì)膜產(chǎn)生一定的損害作用［42］。酶解溫度也會影響原生質(zhì)體分離的產(chǎn)量及活力［40］，采用25 ℃的酶解溫度可以充分發(fā)揮酶的活性，且不會對原生質(zhì)體造成損傷作用。在純化過程中，將原生質(zhì)體沉降下來的離心步驟也至關(guān)重要，過高的離心力會導(dǎo)致原生質(zhì)體受到機械損傷，過低會導(dǎo)致沉降不徹底［37］，本實驗使用的800 rpm·min-1離心力可以得到良好的沉降分離效果。綜上所述，本研究采用25 d 苗齡的幼苗真葉，縱向剖開后預(yù)先質(zhì)壁分離10 min后，置于2%纖維素酶+0.5%離析酶+0.6 mol·L-1甘露醇的酶解液中25 ℃酶解2 h，得到了較高的原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力，可用于后續(xù)實驗。

為驗證制備的原生質(zhì)體可用于瞬時轉(zhuǎn)化，本研究以定位于葉綠體的SaNADP-ME4 作為目標DNA進行原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SaNADP-ME4-GFP融合蛋白定位于原生質(zhì)體的葉綠體中，與前人研究該基因定位于擬南芥原生質(zhì)體葉綠體結(jié)果一致［25］，表明本研究建立的原生質(zhì)體分離和轉(zhuǎn)化方法可以用于松葉豬毛菜的基礎(chǔ)研究，為松葉豬毛菜基因功能研究奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究以松葉豬毛菜無菌組培苗的真葉為材料，分析不同纖維素酶和離析酶的濃度配比、滲透壓及酶解時間對分離原生質(zhì)體的產(chǎn)量及活力的影響。結(jié)論如下：

（1）探究的4 個影響因素中：纖維素酶對原生質(zhì)體制備產(chǎn)量的影響較大，酶解時間對分離的原生質(zhì)體活力的影響最為顯著。

（2）采用25 d葉齡的無菌組培苗真葉，在2%纖維素酶+0.5%離析酶+0.6 mol·L-1甘露醇的酶解液中于25 ℃酶解2 h，使用W5溶液在800 rpm·min-1的轉(zhuǎn)速下純化，原生質(zhì)體產(chǎn)量可達1.21×106個，活力為85%。

（3）利用制備的松葉豬毛菜原生質(zhì)體作為受體，用PEG 轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化pBI121-SaNADP-ME4-GFP質(zhì)粒載體，檢測到SaNADP-ME4定位于葉綠體中。