文冠果種子發(fā)育過程中神經(jīng)酸合成積累相關(guān)基因的表達分析

王莉 劉曉輝 馬靜怡 羅媛 李志民

摘要：利用半定量RT-PCR技術(shù)分析比較文冠果（Xanthoceras sorbifolium Bunge）種子發(fā)育過程中神經(jīng)酸合成相關(guān)基因（KCS、KCR、HCD和ECR基因）在文冠果高神經(jīng)酸（HNA）、低神經(jīng)酸（LNA）品系的表達模式，旨在為解析文冠果神經(jīng)酸合成與積累的分子機制提供重要參考。結(jié)果表明，4個基因在兩個品系花后40 d的種胚中表達量最高，在隨后的種胚發(fā)育過程中表達量呈下降趨勢或表達量極低。在花后40 d時KCS基因在HNA品系中的表達量高于LNA，但花后54、68和81 d時在HNA品系中的表達量低于LNA。與KCS基因不同的是，HCD基因在HNA品系花后40 d種胚中的表達量低于LNA，而在花后54、68和81 d時HNA品系中的表達量高于LNA。KCR基因在HNA品系種胚中的表達量均低于LNA。ECR基因在HNA品系花后40和82 d種胚中的表達量高于LNA，表明花后40 d是種胚發(fā)育過程中神經(jīng)酸積累的關(guān)鍵時期。KCS和ECR基因主要在種胚發(fā)育的早期（花后40 d）調(diào)控神經(jīng)酸的合成，HCD基因在種胚發(fā)育的中期和后期調(diào)節(jié)神經(jīng)酸的合成過程。

關(guān)鍵詞：文冠果（Xanthoceras sorbifolium Bunge）；種胚；神經(jīng)酸；KCS基因；半定量RT-PCR；表達分析

中圖分類號：S794.9；Q786 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2018）04-0117-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.04.030

Expression of Genes Involved in Biosynthesis and Accumulation of Nervonic Acid during Seed Development in Xanthoceras Sorbifolium Bunge

WANG Li，LIU Xiao-hui，MA Jing-yi，LUO Yuan，LI Zhi-min

（College of Environment and Resources，Dalian Minzu University，Dalian 116600，Liaoning，China）

Abstract： Expression patterns of the genes（KCS，KCR，HCD and ECR gene） involved in biosynthesis and accumulation of nervonic acid were studied and compared in high and low nervonic acid-yielding Xanthoceras sorbifolium Bunge during embryonic development using semi-quantitative RT-PCR technology. This will play an important role for understanding molecular mechaisms of biosynthesis and accumulation of nervonic acid in X. sorbifolium. The results showed that the expression levels of four genes were highest in embryos of two lines at the 40 days after anthesis compared to that of other developmental stages，and then the expression levels decreased or was very low during the subsequent embryo development. The expression level of KCS gene was higher in HNA line than LNA line at 40 d，but its expression level was lower in HNA line compared to LNA line at 54，68 and 81 d. In contrast to the KCS gene，the expression level of HCD gene was lower in HNA line than LNA line at 40 daa，whereas its expression level was higher in HNA line compared to LNA line at 54，68 and 81 d. The expression level of KCR gene was relatively low in HNA compared with LNA. The expression level of ECR gene in HNA was higher compared with LNA at 40 and 81 d. These results indicated that the 40 d was a critical stage for the accumulation of nervonic acid in embryonic development. KCS and ECR genes mainly regulate the biosynthesis of nervonic acid in the early stage of embryonic development （at 40 d）. The HCD gene regulates the biosynthesis of nervonic acid in the medium and late stages of embryonic development.

Key words： Xanthoceras sorbifolium Bunge；embryo；nervonic acid；KCS gene；semi-quantitative RT-PCR；expression analysis

文冠果（Xanthoceras sorbifolium Bunge）是中國北方特有的木本油料能源樹種，具有較強的抗逆特性，能夠適應(yīng)低溫、干旱和貧瘠的土地生境。文冠果種胚（種仁）的含油量高達60%，富含油酸、亞油酸、神經(jīng)酸等優(yōu)質(zhì)不飽和脂肪酸[1]，因而成為惟一適宜在中國北方荒漠和干旱半干旱地區(qū)種植的木本油料樹種。其種子油中神經(jīng)酸含量約占1.5%～3.0%[2]，也是重要的神經(jīng)酸資源植物，但仍有待提高。

神經(jīng)酸化學名為順-15-二十四碳烯酸（C24∶1），是一種超長鏈單不飽和脂肪酸（VLCMFA），神經(jīng)酸是大腦神經(jīng)細胞和神經(jīng)纖維的核心天然成分，也是惟一能促進受損神經(jīng)組織修復和再生的雙效物質(zhì)[3]。因此，近年來神經(jīng)酸受到制藥、營養(yǎng)等行業(yè)的廣泛關(guān)注。在植物體中，神經(jīng)酸是在脂肪酸延長酶復合體（FAE）的催化下經(jīng)過縮合、還原、脫水和再還原四個反應(yīng)合成的。脂肪酸碳鏈延長酶是一個跨膜多酶復合體，由4個功能不同的酶組成，包括β-酮脂酰-CoA合酶（KCS）、β-酮脂酰-CoA還原酶（KCR）、β-羥脂酰-CoA脫氫酶（HCD）和反式烯脂酰-CoA還原酶（ECR）[4]。其中KCS是催化脂肪酸碳鏈延長的第一步縮合反應(yīng)的酶，是神經(jīng)酸合成反應(yīng)的限速酶[5]。目前，許多研究表明KCS酶能夠顯著促進植物中神經(jīng)酸的積累，例如Taylor等[6]從神經(jīng)酸植物Cardamine graeca中克隆了KCS基因，在轉(zhuǎn)基因酵母中獲得神經(jīng)酸（在野生酵母中不產(chǎn)生），該基因在“種子特異啟動子”的調(diào)控下，在產(chǎn)油植物埃塞俄比亞芥中異源表達，最終神經(jīng)酸產(chǎn)量達44%。此外，Huai等[7]將銀扇草（Lunaria annua）的KCS基因（LaKCS）導入亞麻薺（Camelina sativa）中，經(jīng)過異源表達，亞麻薺種子中神經(jīng)酸含量提高到6%～12%，然而LaKCS、AtKCR和AtHCD基因共表達的轉(zhuǎn)基因亞麻薺株系中神經(jīng)酸含量沒有顯著改變。烏蘭巴特爾[8]克隆獲得了文冠果KCS基因全長cDNA序列，并發(fā)現(xiàn)KCS基因在花后40 d的種子中表達量最高。但文冠果種子發(fā)育過程中神經(jīng)酸合成相關(guān)基因?qū)ι窠?jīng)酸累積的協(xié)同調(diào)控作用仍然十分有限。

因此，本研究以文冠果de novo轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，設(shè)計引物，利用半定量PCR技術(shù)深入探討神經(jīng)酸合成相關(guān)基因在文冠果高、低神經(jīng)酸品系種子發(fā)育過程中的表達模式，為解析文冠果種子發(fā)育過程中神經(jīng)酸合成與積累的分子機制提供重要參考，將有助于文冠果油的品質(zhì)改良和文冠果分子育種工作。

1 材料與方法

1.1 材料

文冠果高神經(jīng)酸品系（HNA）和低神經(jīng)酸品系（LNA）種植于內(nèi)蒙古自治區(qū)通遼市奈曼旗八仙筒林場，其神經(jīng)酸相對含量分別為4.66%和2.48%。2016年6～8月于文冠果果實發(fā)育期采集花后40、54、68、82 d的蒴果，去除種皮，取出種胚在液氮中速凍后放入-80 ℃冰箱保存，用于總RNA提取。

1.2 主要試劑、儀器

柱式植物總RNA抽提純化試劑盒購自生工生物工程上海（股份）有限公司；PrimeScriptTM RT-PCR試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司；RNase-Free DNase I購自天根生化科技（北京）有限公司。

NanoDrop 2000型超微量分光光度計（美國THERMO）；C1000 Touch型梯度PCR（美國BIO-RAD）；DYY-7C型電泳儀（北京六一生物科技有限公司）；GelDoc-It 310型凝膠成像系統(tǒng)（美國UVP）；Mettler Toledo AB135-S型電子分析天平（瑞士Mettler Toledo）；XW-80A型微型旋渦混合儀（上海滬西分析儀器廠）；Avanti J-E型低溫高速離心機（美國BECKMAN）。

1.3 方法

1.3.1 總RNA的提取、定量及完整性檢測 采用柱式植物總RNA抽提純化試劑盒提取兩個品系各發(fā)育時期種胚的總RNA，并利用RNase-Free DNase I進行基因組DNA的消化。取4 μL RNA樣品進行瓊脂糖凝膠電泳，通過紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察提取的總RNA的完整性。利用超微量分光光度計檢測總RNA的純度（A260 nm/A280 nm、A260 nm/A230 nm）并進行定量。

1.3.2 cDNA第一鏈合成 根據(jù)上述檢測取調(diào)整后達到等量的不同時期種胚總RNA，利用cDNA合成試劑盒（PrimeScriptTM RT-PCR Kit）進行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA第一鏈，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 神經(jīng)酸合成相關(guān)基因（KCS、KCR、HCD和 ECR）及植物常用內(nèi)參基因β-actin、18s rRNA和GAPDH的半定量PCR擴增 依據(jù)文冠果de novo轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，篩查KCS、KCR、HCD、ECR、β-actin、18S rRNA和GAPDH基因的序列。根據(jù)各基因序列和半定量PCR引物的設(shè)計原則，利用Primer Quest Tool在線軟件分別設(shè)計上述基因的半定量PCR引物（表1），引物由生工生物工程上海（股份）有限公司合成。利用PrimeScriptTM RT-PCR試劑盒對反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA進行PCR擴增，采用20 μL反應(yīng)體系，分別加入1 μL兩個文冠果品系不同發(fā)育時期種胚的cDNA，2 μL 10×PCR Buffer，0.8 μL 10 mmol/L dNTPs，0.2 μL 5 U/μL Taq DNA聚合酶，0.5 μL正、反向引物（10 μmol/L），補ddH2O至20 μL。各引物的PCR反應(yīng)程序見表2。取5 μL半定量PCR擴增產(chǎn)物并加上樣緩沖液，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，紫外線觀察拍照。所有材料均取樣3次，進行3次半定量RT-PCR分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 文冠果種胚總RNA的提取與cDNA第一鏈合成

對提取的文冠果種胚的總RNA進行瓊脂糖凝膠電泳檢測（圖1），可觀察到各樣品總RNA的28S和18S條帶整齊、無拖尾，28S RNA條帶基本為18S RNA條帶亮度的2倍，說明提取的RNA完整性好，未降解，可以用于后續(xù)研究。用超微量分光光度計測量提取的RNA樣品的A230 nm、A260 nm、A280 nm值，所有樣品A260 nm/A230 nm均在1.8～2.0，A260 nm/A280 nm均在1.9～2.2，表明提取的總RNA質(zhì)量符合要求，可以滿足后續(xù)試驗要求。

反轉(zhuǎn)錄體系中RNA總量均為1 μg，通過調(diào)整初始RNA的量，以等量的總RNA反轉(zhuǎn)錄合成不同的cDNA樣品之間可以達到良好的平行性，以此保證半定量RT-PCR試驗的一致性，提高半定量結(jié)果的可比性。

2.2 兩個品系不同發(fā)育時期種胚半定量內(nèi)參基因的篩選

根據(jù)文冠果β-actin（ACT）、18S rRNA（18S）和GAPDH各自特異引物的設(shè)計參數(shù)，確定其最適退火溫度，采用半定量RT-PCR技術(shù)對這些基因在文冠果種胚發(fā)育不同時期的表達進行檢測。由瓊脂糖凝膠電泳和Quantity One分析結(jié)果可知，18S rRNA基因的表達水平波動較小，β-actin和GAPDH基因在種胚發(fā)育過程中表達水平都有明顯的波動（圖2A、圖2B）。因此，選取18S rRNA基因為半定量RT-PCR分析的內(nèi)參基因。

2.3 KCS、KCR、ECR和HCD基因在文冠果不同發(fā)育時期種胚的表達

KCS、KCR、ECR和HCD基因在文冠果高、低神經(jīng)酸品系的4個發(fā)育時期種胚分別進行半定量PCR擴增（圖3）。由圖3可知，KCS、KCR、ECR和HCD基因在兩個品系花后40 d的種胚中表達量均高，在隨后的種胚發(fā)育過程中表達量呈下降趨勢或表達量極低。在花后40 d時KCS基因在HNA品系中的表達量高于LNA，然而在花后54、68和81 d時KCS基因在HNA品系中的表達量低于LNA，表明KCS基因主要在花后40 d的種胚中調(diào)節(jié)神經(jīng)酸的合成與積累。KCR基因在HNA品系不同發(fā)育時期種胚中的表達量均低于LNA，表明KCR對種胚中神經(jīng)酸合成的貢獻較小。與KCS基因不同的是，HCD基因在HNA品系花后40 d種胚中的表達量低于LNA，在花后54、68和81 d時HNA品系中的表達量高于LNA。ECR基因在HNA品系花后40和82 d種胚中的表達量高于LNA，表明ECR基因可能在早期和晚期種胚發(fā)育過程中對神經(jīng)酸累積發(fā)揮重要作用。以上結(jié)果揭示KCS和ECR基因共同在種胚發(fā)育的早期（花后40 d）調(diào)控神經(jīng)酸的合成與積累的關(guān)鍵時期，決定了文冠果種胚中神經(jīng)酸含量。

3 討論

管家基因一般是編碼細胞基本生命活動所需的蛋白，因此在植物的半定量RT-PCR試驗中通常會選用管家基因作為內(nèi)參基因。管家基因最初被認為在不同組織和器官中它們的表達水平恒定不變[9]，但大量的研究表明，管家基因并不是在任何情況下表達水平都能保持穩(wěn)定不變，即可能在不同發(fā)育時期或不同處理條件下發(fā)生表達變化，而且某個物種中穩(wěn)定表達的管家基因也許在另一物種在其他試驗條件下表達會發(fā)生顯著變化[10]，所以需要通過具體的試驗才能篩選出合適的內(nèi)參基因。

本研究選擇了3個常見的持家基因β-actin、18s rRNA和GAPDH作為候選的內(nèi)參基因進行試驗，在保證反應(yīng)背景相同的條件下對這3個基因在文冠果種胚發(fā)育不同時期的表達情況進行分析。由電泳結(jié)果和Quantity One數(shù)據(jù)分析可知，18s rRNA基因的表達變化相對較小，其余兩個基因的表達水平在不同發(fā)育時期和不同品系之間均存在明顯變化，最終確定了18s rRNA基因為KCS、KCR、ECR和HCD基因在文冠果種胚不同發(fā)育時期RT-PCR半定量檢測的內(nèi)參基因。

對文冠果果實生長發(fā)育規(guī)律的研究表明，KCS和FAD2基因是控制油料作物脂肪酸組成的關(guān)鍵基因，且KCS基因在開花后40 d的種子中表達量最高[8]。根據(jù)本試驗結(jié)果可以得知，在文冠果發(fā)育早期的種胚中，KCS、KCR、ECR、HCD基因均有較高的表達水平，但是在種胚發(fā)育中期和后期，這些基因表達水平呈下降趨勢，表明了文冠果神經(jīng)酸合成的關(guān)鍵時期是花后40 d左右，這與烏蘭巴特爾[8]的報道基本一致。同時本研究中也發(fā)現(xiàn)KCR對文冠果種胚中神經(jīng)酸累積的貢獻較小，KCS和ECR基因共同在種胚發(fā)育的早期（花后40 d）調(diào)控神經(jīng)酸的合成，而HCD基因在種胚發(fā)育的中期和后期調(diào)節(jié)神經(jīng)酸的合成過程。本研究結(jié)果為解析文冠果種子神經(jīng)酸合成與積累的分子機制奠定了重要的依據(jù)，將有助于文冠果種子油品質(zhì)的改良和基因工程育種研究。

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