復(fù)合鎂基磷酸鹽骨水泥的研究

張芝祥，楊在君,b，顏紅海，丁 祥,c，黃雨裳，周萍萍，黎云祥,c

(西華師范大學(xué) a.組織修復(fù)材料工程技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心；b.生命科學(xué)學(xué)院；c.環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，四川 南充 637009)

不規(guī)則的骨缺損和骨損傷一直是當(dāng)今外科手術(shù)的一個(gè)難題[1-2]。當(dāng)前，臨床上主要借助骨移植以及骨修復(fù)材料填充等方法達(dá)到骨修復(fù)和重建的目的[3]。盡管骨移植具有良好的生物相容性以及誘導(dǎo)性，但由于來源有限等缺點(diǎn)難以用于大規(guī)模的骨損傷修復(fù)[4]，因此骨修復(fù)材料是解決這一難題的關(guān)鍵。目前，臨床上應(yīng)用較多的具有生物活性的骨修復(fù)材料主要是磷酸鈣類材料(calcium phosphate cement，CPC)。CPC具有良好的生物相容性和誘導(dǎo)性，并表現(xiàn)出較好的力學(xué)性能，然而CPC中的鈣磷比過高，導(dǎo)致其在體內(nèi)降解緩慢且無粘結(jié)性[5-6]。

近年來，鎂基磷酸鹽骨水泥(magnesium phosphate cement，MPC)獲得了人們廣泛關(guān)注。相比CPC，MPC除具有優(yōu)良的生物相容性和誘導(dǎo)性，還具有較高的起始強(qiáng)度、較快的硬化速度、以及適當(dāng)?shù)慕到馑俣龋襇PC降解過程中釋放的Mg2+能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞生長(zhǎng)[5,7-8]。傳統(tǒng)MPC主要是鎂基磷酸銨鹽骨水泥(magnesium ammonium phosphate cement，MAPC)，是通過添加高溫煅燒后的MgO和NH4H2PO4做為固相，進(jìn)一步水化反應(yīng)生成MgNH4PO4·6H2O[5,8]。這個(gè)過程中會(huì)釋放大量NH3，而體內(nèi)過量的NH3可能引起較強(qiáng)的細(xì)胞毒性，增加機(jī)體負(fù)擔(dān)[8-9]。同時(shí)，鎂基磷酸銨骨水泥凝固時(shí)間過快(約3min)[9]，從而限制了其在骨組織修復(fù)上的應(yīng)用。鑒于此，相關(guān)研究利用KH2PO4代替NH4H2PO4做為固相合成鎂基磷酸鉀骨水泥(magnesium potassium phosphate cement，MKPC)取得了較好效果。相比NH4H2PO4，KH2PO4具有較低的解離常數(shù)和溶解性，從而降低了反應(yīng)速率，使凝固時(shí)間得以延長(zhǎng)[8]。同時(shí)反應(yīng)過程中無可能對(duì)機(jī)體造成負(fù)擔(dān)的物質(zhì)產(chǎn)生[9]。然而，KH2PO4代替NH4H2PO4使得制備的水泥起始強(qiáng)度下降[10]，仍然不利于臨床上應(yīng)用。因此，作者嘗試通過同時(shí)使用NH4H2PO4和KH2PO4作為骨水泥主料合成一種新型生物相容的、可降解的復(fù)合鎂基磷酸鹽骨水泥(composite magnesium phosphate cement，CMPC)，并對(duì)合成的復(fù)合鎂基磷酸鹽骨水泥抗壓強(qiáng)度、表觀形貌、降解能力進(jìn)行表征，進(jìn)而探索該復(fù)合鎂基磷酸鹽骨水泥應(yīng)用于骨組織修復(fù)的可能性。

1　材料與方法

1.1　材　料

CMPC固相主要由MgO、NH4H2PO4、KH2PO4、羥基磷灰石等組成。液相為含有NaCl和磷酸鹽的磷酸溶液。其中磷酸鹽可以中和磷酸溶液，起到pH調(diào)節(jié)和緩沖作用。MgO購自河北邢臺(tái)冶金鎂業(yè)有限公司，NH4H2PO4、KH2PO4購自湖南九典制藥有限公司，羥基磷灰石由四川大學(xué)生物材料工程研究中心提供。其余試劑均購自成都科龍化工試劑廠。MgO使用前采用1 600 ℃高溫進(jìn)行煅燒從而降低反應(yīng)活性。煅燒后的氧化鎂、以及所使用磷酸鹽均采用尼龍篩(300目)進(jìn)行過篩處理。為探討復(fù)合鎂基磷酸鹽骨水泥應(yīng)用于骨組織修復(fù)的可能性，選擇已上市銷售MAPC和MKPC做為參照進(jìn)行相關(guān)性能測(cè)試。

1.2　骨水泥樣品制備

將制備骨水泥所用固相及液相以0.1～0.5 mL/g的比例進(jìn)行混合、攪拌成勻漿。待攪拌均勻后，用注射器將骨水泥勻漿注入底面直徑為5 mm，高為10 mm的圓柱形玻璃模具中成型，制備細(xì)胞毒性測(cè)試及生物降解性能測(cè)試樣品。隨后將模具置于37 ℃恒溫箱中固化24 h。抗壓強(qiáng)度測(cè)試樣品采用底面直徑為6 mm，高為10 mm的圓柱形玻璃模具中成型。為了降低環(huán)境溫度對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，實(shí)驗(yàn)室設(shè)置為恒溫(25 ℃)。

為了探尋最適CMPC合成配比，本研究采用正交試驗(yàn)，以固化液濃度、氨/鉀比例、磷/鎂比例作為三個(gè)因素，進(jìn)行三水平正交試驗(yàn)，選擇正交表L9(34)安排實(shí)驗(yàn)方案(表1)，對(duì)結(jié)果進(jìn)行極差分析，確定最適配比條件。

作為對(duì)比的市售MAPC和MKPC樣品制備參照其使用說明進(jìn)行配制，并注入底面直徑為5 mm，高為10 mm的圓柱形玻璃模具中成型，隨后在37 ℃恒溫箱中固化24 h備用。

表1　骨水泥正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

注：體外細(xì)胞毒性等級(jí)根據(jù)GB/T16886.5—2003進(jìn)行劃分。

1.3　體外細(xì)胞毒性測(cè)試

采用噻唑藍(lán)比色法(MTT)[11]評(píng)估CMPC體外細(xì)胞毒性。將制備的骨水泥樣品稱重后置于50 mL無菌離心管中，按0.2 g/mL比例添加RPMI 1 640細(xì)胞培養(yǎng)液，隨后將離心管置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置24 h進(jìn)行浸提。浸提完成后，取浸提液上清液，過濾備用。將1×104/mL L929細(xì)胞懸液(參照GB/T14233.2—2005)接種于96孔無菌細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入100 μLRPMI 1 640細(xì)胞培養(yǎng)液，置于CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的37 ℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后，棄去培養(yǎng)板內(nèi)RPMI 1 640細(xì)胞培養(yǎng)液，加入200 μL樣品浸提液?？瞻讓?duì)照則加入等體積的RPMI 1 640細(xì)胞培養(yǎng)液。隨后置于恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中(37 ℃，CO2體積分?jǐn)?shù)5%)培養(yǎng)24 h。每個(gè)樣品重復(fù)6次。細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，取出細(xì)胞培養(yǎng)板，棄去培養(yǎng)板內(nèi)樣品浸提液，于每孔中加入100 μL含血清10%的RPMI 1 640細(xì)胞培養(yǎng)液，同時(shí)加入1 mg/mL MTT染色劑50 μL，隨后再次置于上述細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3 h。培養(yǎng)結(jié)束后，棄去孔內(nèi)液體，加入150 μL 二甲基亞砜(DMSO)，震蕩10 min，檢測(cè)570 nm波長(zhǎng)下樣品吸光度。按以下公式計(jì)算相對(duì)細(xì)胞增殖率，相對(duì)細(xì)胞增殖率=(實(shí)驗(yàn)組吸光度值/空白組吸光度值)×100%。同時(shí)，觀察細(xì)胞在各組中生長(zhǎng)情況及形態(tài)變化。

1.4　骨水泥性能測(cè)試

細(xì)胞毒性測(cè)試完成后，根據(jù)GB/T16886.5—2003對(duì)細(xì)胞毒性的等級(jí)劃分，對(duì)無毒樣品(毒性等級(jí)為1或0級(jí))的抗壓強(qiáng)度、表觀形貌、降解能力進(jìn)行表征，并選擇市售MAPC和MKPC做為參照進(jìn)行對(duì)比。

1.4.1骨水泥組成及形貌特征分析

骨水泥組成采用X衍射(X-ray diffraction，XRD)分析。將骨水泥樣品碾碎，采用“壓片法”制成試片上機(jī)分析。X射線衍射分析在Dmax/UItima IV型X射線衍射儀(日本理學(xué)公司)上完成。通過對(duì)樣品衍射圖與PDF卡片對(duì)比得到樣品組成。骨水泥樣品形貌特征通過掃描電鏡(scanning electron microscope，SEM)進(jìn)行分析。分析前，將骨水泥樣品制備成薄壁方塊狀試樣，在橫截面鍍金，隨后利用JSM-6530LV型掃描電鏡(日本理學(xué)公司)進(jìn)行分析。加速電壓和加速電流分別設(shè)定為5 kV 和10 μA。

1.4.2抗壓強(qiáng)度測(cè)試

將制備的骨水泥樣品置于水溫37 ℃、100%濕度的恒溫水浴鍋中水化24 h。取水化后的試樣，將其兩段磨平，平衡度誤差0.01 mm。隨后利用MTS E44.104型微機(jī)控制電子萬能實(shí)驗(yàn)機(jī)進(jìn)行抗壓強(qiáng)度測(cè)試，加載速度設(shè)置為1 mm/min。每個(gè)樣品重復(fù)3次。

1.4.3生物降解性能測(cè)試

將骨水泥樣品稱重后置于塑料瓶中，并按200 mL/g比例添加Tris-HCl溶液(pH 7.4)。隨后將塑料瓶放置在37 ℃恒溫水浴搖床上(100 r/min)連續(xù)培養(yǎng)。每隔7d將骨水泥樣品取出，用去離子水清洗骨水泥樣品，置于120 ℃烘箱中烘干至恒重稱量并記錄，隨后置換新的Tris-HCl進(jìn)行培養(yǎng)。骨水泥樣品降解率按如下公式進(jìn)行計(jì)算：降解率(%)=(初始重量-剩余重量)/初始重量×100%。為了比較不同骨水泥不同時(shí)間段的降解速率，以7 d作為一個(gè)周期，計(jì)算周降解率。周降解率計(jì)算公式為：周降解率=每周降解骨水泥重量/骨水泥樣品初始重量×100%。

2　結(jié)果分析

2.1　影響鎂基磷酸鹽骨水泥細(xì)胞毒性的因素

觀察各組細(xì)胞生長(zhǎng)狀況(圖1 A-J)發(fā)現(xiàn)，加入編號(hào)為1、4、5、9骨水泥樣品浸提液的細(xì)胞大量圓縮(圖1A、D、E、I)，加入編號(hào)為2、3、6、8骨水泥樣品浸提液的細(xì)胞大量破裂死亡(圖1B、C、F、H)。加入編號(hào)為7骨水泥樣品浸提液的細(xì)胞生長(zhǎng)良好(圖1G)，細(xì)胞呈梭形且飽滿，與空白對(duì)照(圖1J)組細(xì)胞生長(zhǎng)情況相似。利用MTT法對(duì)不同用料配比骨水泥的細(xì)胞毒性進(jìn)行評(píng)估，并依據(jù)GB/T16886.5—2003分類標(biāo)準(zhǔn)對(duì)骨水泥樣品細(xì)胞毒性進(jìn)行等級(jí)劃分(表1)，結(jié)果表明，除7號(hào)骨水泥樣品為無毒級(jí)外(相對(duì)細(xì)胞增殖率為97.55±4.06%)，其余樣品均表現(xiàn)為一定的細(xì)胞毒性。進(jìn)一步對(duì)相對(duì)細(xì)胞增殖率結(jié)果進(jìn)行極差分析(表2)，結(jié)果表明骨水泥中磷/鎂比例對(duì)骨水泥細(xì)胞毒性影響最大，固化液濃度次之，氨/鉀比例對(duì)骨水泥細(xì)胞毒性影響最小。具有最好生物相容性的骨水泥制備條件為固化液濃度為15%、氨/鉀比1.5、磷/鎂比為1.0。

2.2　XRD及SEM分析

進(jìn)一步對(duì)CMPC樣品以及市售MPC的組成和形貌特征進(jìn)行表征。XRD結(jié)果表明(圖2)，MKPC主要生成MgKPO4·6H2O，MAPC主要產(chǎn)物為MgNH4PO4·6H2O，而CMPC中包含上述兩種產(chǎn)物。同時(shí)，可以看出，MgKPO4·6H2O和MgNH4PO4·6H2O具有重疊的衍射峰。此外，三種骨水泥中均檢測(cè)到MgO的衍射峰，表明有大量未完全反應(yīng)MgO存在。SEM掃描分析(圖3)展示了三種不同骨水泥截面形貌。MKPC表面呈塊狀且有大量圓形微孔和裂隙，放大掃描倍數(shù)發(fā)現(xiàn)，骨水泥呈表面覆蓋小顆粒的球形(圖3A)；MAPC表面光滑，存在大量微小裂縫，擴(kuò)大掃描倍數(shù)發(fā)現(xiàn)，這些微小裂縫中存有大量微小球形顆粒(圖3B)；CMPC表面光滑有圓形微孔，進(jìn)一步擴(kuò)大掃描倍數(shù)發(fā)現(xiàn)，微孔中有著大量微小球形顆粒(圖3C)。

表2　CMPC體外細(xì)胞毒性極差分析

項(xiàng)目液相濃度/%鎂/磷氨/鉀K1-3131.57170.51166.11K4-6157.6186.140145.18K7-9183.75216.29162.19R17.39043.2906.9800

注：Ki為表1對(duì)應(yīng)的各因素同一水平下每三組

試驗(yàn)細(xì)胞相對(duì)增值率之和。

2.3　抗壓強(qiáng)度

對(duì)三種骨水泥的抗壓強(qiáng)度進(jìn)行測(cè)試。結(jié)果表明(表3)，MKCP的抗壓強(qiáng)度最高，達(dá)到19.0±5.0 Mpa，CMPC的抗壓強(qiáng)度次之，為9.3±1.7 Mpa，MAPC的抗壓強(qiáng)度最低，僅為4.6±0.5 Mpa。

表3　三種鎂基磷酸鹽骨水泥抗壓強(qiáng)度

2.4　生物降解性能測(cè)試

對(duì)三種不同骨水泥生物降解性能進(jìn)行測(cè)試。連續(xù)培養(yǎng)三周后，三種骨水泥的降解率均超過90%(表4)，培養(yǎng)至第四周時(shí)，已經(jīng)完全降解。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過一周培養(yǎng)后，MKPC降解速率最快，為43.89%，CMPC次之，為36.66%，MAPC降解速率最慢，為25.67%；二周后，CMPC和MAPC降解速率仍然較快，分別為32.23%和32.42%，而MKPC降解速率有所下降，為22.01%；三周后，CMPC降解速率最快，達(dá)到45.26%，而MAPC和MKPC降解速率與上周基本持平，達(dá)到平衡，分別為32.72%和24.20%。

表4　三種鎂基磷酸鹽骨水泥生物降解性能

3　討　論

良好的生物相容性是骨水泥應(yīng)用于臨床的首要條件。作者采用不同的骨水泥用料配比和極差分析，結(jié)合細(xì)胞形態(tài)觀察分析了影響復(fù)合鎂基磷酸骨水泥生物相容性的因素。結(jié)果表明(圖1，表2)，磷/鎂比是影響骨水泥生物相容性的首要因素。研究表明，鎂基磷酸骨水泥中的主要化學(xué)反應(yīng)為：MgO+ KH2PO4(NH4H2PO4)+5H2O→MgKPO4·6H2O(MgNH4PO4·6H2O)[8]，反應(yīng)過程中過多的磷酸鹽或氧化鎂會(huì)導(dǎo)致機(jī)體局部磷或鎂離子濃度過高，從而對(duì)機(jī)體產(chǎn)生毒害，使細(xì)胞不能正常生長(zhǎng)[12]。研究結(jié)果也表明磷/鎂比為1.0時(shí)細(xì)胞具有最好的相對(duì)增殖率，這也證實(shí)了過多的磷或鎂離子可能不利于細(xì)胞生長(zhǎng)，從而影響組織愈合。

為了進(jìn)一步探討制備的骨水泥在組織修復(fù)上應(yīng)用的可行性，作者根據(jù)細(xì)胞毒性結(jié)果對(duì)無毒的骨水泥樣品的抗壓強(qiáng)度、表觀形貌、降解能力進(jìn)行了表征，并選擇市售鎂基磷酸鹽骨水泥進(jìn)行對(duì)比。XRD結(jié)果表明，MKPC的主要產(chǎn)物為MgKPO4·6H2O，而MAPC的主要化學(xué)產(chǎn)物為MgNH4PO4·6H2O，這與前人的研究結(jié)果一致[8]。本研究合成的CMPC則檢測(cè)到上述兩種產(chǎn)物的衍射峰，說明CMPC中同時(shí)發(fā)生了這兩種主反應(yīng)。研究表明，MgKPO4·6H2O與MgNH4PO4·6H2O具有相似的晶體結(jié)構(gòu)[13]。本研究中，XRD結(jié)果顯示MgKPO4·6H2O與MgNH4PO4·6H2O衍射峰發(fā)生重疊，這再次證實(shí)了二者在晶體結(jié)構(gòu)上的相似性。從抗壓強(qiáng)度來看，MAPC的抗壓能力最差，MKPC的強(qiáng)度最高，而本研究制備的CMPC抗壓強(qiáng)度居中。從SEM掃描結(jié)果(圖4)可以看出MAPC表面存在許多微孔，這些微孔可能是在化合反應(yīng)中生成的氨氣逸出產(chǎn)生，致使骨水泥致密度變低，從而影響抗壓強(qiáng)度。值得注意的是，三種骨水泥中抗壓強(qiáng)度均低于30 MPa，僅能用于非承重骨修復(fù)[14]。有研究表明，MPC的抗壓強(qiáng)度主要由水化物和水泥石生產(chǎn)量決定，隨著MgO含量的增加，骨水泥的強(qiáng)度隨之增強(qiáng)[6]，鎂/磷摩爾比為4～5時(shí)，骨水泥強(qiáng)度最高[15]。然而，過量的Mg2+會(huì)增加骨水泥的細(xì)胞毒性，因此如何增加骨水泥強(qiáng)度而保持良好的生物相容性是骨水泥進(jìn)一步應(yīng)用于承重骨修復(fù)的關(guān)鍵。進(jìn)一步對(duì)三種骨水泥的生物降解性能進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果顯示三周后三種骨水泥的生物降解率均超過90%，這表明這三種骨水泥均具有良好的生物降解能力。MAPC前期生物降解速度較慢，MKPC前期降解速度則較快，而CMPC的前期降解速率居中，這可能與骨水泥的組成相關(guān)。三種骨水泥在后期的降解速率則變化不大，表明達(dá)到某種平衡。這些結(jié)果說明可以通過選擇不同磷酸鹽及磷酸鹽組合作為骨水泥的磷酸鹽組分，從而合成具有不同初始降解速率的骨水泥材料，進(jìn)而滿足不同的臨床要求。

綜上所述，通過同時(shí)添加NH4H2PO4和KH2PO4作為骨水泥磷酸成分，成功合成一種新型的骨水泥材料。通過正交設(shè)計(jì)研究了不同骨水泥組分對(duì)骨水泥生物相容性的影響，結(jié)果表明，磷/鎂比對(duì)骨水泥的體外細(xì)胞毒性具有重要影響，因此，在進(jìn)行骨水泥制備時(shí)，要重點(diǎn)考慮磷/鎂比例。通過與市售MPC比較，本研究合成的新型骨水泥具有良好的生物相容性、優(yōu)良的生物降解性能、以及較好的抗壓強(qiáng)度，有望應(yīng)成為一種新型的骨組織修復(fù)材料。

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