小鼠骨髓源性樹突細(xì)胞和脾源性樹突細(xì)胞的形態(tài)及生物學(xué)性能對(duì)比

張?zhí)m蘭，閆軍堂，劉　敏，胡京紅，于　雪，范盎然，紀(jì)雯婷，任　虹，孫震宇

(北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，北京 100029)

樹突狀細(xì)胞(DCs)是機(jī)體最重要的抗原提呈細(xì)胞，也是唯一能激活初始T細(xì)胞的抗原提呈細(xì)胞，是機(jī)體免疫的始動(dòng)者，在免疫抑制和免疫耐受等方面發(fā)揮著重要作用。近年來人們已經(jīng)能在體外應(yīng)用MCM培養(yǎng)基誘導(dǎo)生成高純度的DCs并已應(yīng)用于腫瘤和過敏性疾病的治療[1]，目前基于DCs的免疫治療也被認(rèn)為是最具前景的治療方式[2]。一般來說DCs在體內(nèi)分布較廣，外周血、脾臟、臍帶血、骨髓、皮膚等均有分布[3]，但大都含量極少且獲得困難，如何獲取純度和性能較好的DCs用于更深入的DCs研究已經(jīng)成為當(dāng)前實(shí)驗(yàn)研究的重點(diǎn)[4]。近年來學(xué)者們對(duì)DCs體外培養(yǎng)進(jìn)行了大量積極的探索，小則從培養(yǎng)手法、因子濃度等入手，大則結(jié)合現(xiàn)代生物技術(shù)如磁珠分選、流式分選等對(duì)其進(jìn)行研究，DCs培養(yǎng)技術(shù)已日漸趨于成熟。相比于其他來源的DCs，骨髓來源的DCs因其培養(yǎng)方法簡(jiǎn)單、來源方便、含量較高等特點(diǎn)，成為應(yīng)用較多的DCs研究來源，但1只小鼠的骨髓前體細(xì)胞經(jīng)常規(guī)誘導(dǎo)后僅可生成(1～2)×107個(gè)DCs細(xì)胞，經(jīng)分選后僅可獲得前者數(shù)量的1/10[5]，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足當(dāng)前實(shí)驗(yàn)對(duì)DCs的大量需求，故有必要對(duì)DCs進(jìn)行更深入的探索。一直以來，脾源性DCs因其培養(yǎng)周期長(zhǎng)、產(chǎn)量低等特點(diǎn)而較少應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)研究[6]，其確切的純度、產(chǎn)量和性能目前尚不明確，基于目前DCs缺乏的現(xiàn)狀，本課題組對(duì)脾源性DCs展開了研究。本研究通過在體外獲得骨髓前體細(xì)胞和脾細(xì)胞，用GM-CSF和IL-4誘導(dǎo)生成DCs，結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)(FCM)和酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)技術(shù)從兩者的形態(tài)、細(xì)胞表面特異性分子表達(dá)、相關(guān)因子分泌等方面進(jìn)行對(duì)比，以期明確脾源性DCs的性狀和性能，為后期的實(shí)驗(yàn)研究篩選合適的細(xì)胞。

1　實(shí)驗(yàn)資料

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物C57BL/6雌性小鼠，SPF級(jí)5周齡，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，合格證號(hào)為SCXK(京)2012-0001。實(shí)驗(yàn)小鼠均飼養(yǎng)在清潔級(jí)環(huán)境中統(tǒng)一喂養(yǎng)，取材時(shí)遵守人道主義原則，確保小鼠安樂死。

1.1.2主要試劑重組GM-CSF購于R&D(批號(hào)：404-ML-010)，重組IL-4因子購于R&D(批號(hào)：404-ML-010)，RPMI-1640購自美國Hy-clone公司(批號(hào)：11330032)，紅細(xì)胞裂解液購于康為世紀(jì)，澳洲來源胎牛血清(FBS，批號(hào)：10099141)，雙抗(批號(hào)：15140122)，PE標(biāo)記的抗小鼠CD83單克隆抗體(貨號(hào)：558205)及其同型對(duì)照(貨號(hào)：554685)、APC標(biāo)記的抗小鼠CD11c單克隆抗體(貨號(hào)：554686)及其同型對(duì)照(貨號(hào)：557400)均購于BD公司，LPS購于Sigma公司，IL-12 ELISA試劑盒(批號(hào): LOT20170321002)購于武漢六合生物有限公司。

1.1.3主要儀器INCO2/108型CO2培養(yǎng)箱，Leica-DM2500 型顯微圖像系統(tǒng)，ePPendorf離心機(jī)(型號(hào)：5810)，Tecan酶標(biāo)儀(型號(hào)：Safire2)，BD流式細(xì)胞儀。

1.2方法

1.2.1小鼠骨髓源性DCs的分離與培養(yǎng)處理C57BL/6小鼠脫頸椎處死，無菌條件下分離股骨與脛骨，用無菌紗布將組織剔除干凈后用注射器將骨髓沖至培養(yǎng)皿中，收集到離心管中經(jīng)離心后加入預(yù)溫37 ℃的紅細(xì)胞裂解液5 mL，靜置5 min后加RPMI-1640 5 mL終止裂解，離心2次后計(jì)數(shù)，用完全培養(yǎng)基(含10 ng/mL 重組IL-4、20 ng/mL 重組GM-CSF、10%滅活的FBS及1%雙抗)調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106mL-1，將細(xì)胞種于6孔板，每孔2 mL于37 ℃、 5% CO2溫箱中培養(yǎng)，3 h后棄去上清，加入相同因子濃度的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，48 h和96 h分別進(jìn)行半換液處理，第8天部分細(xì)胞添加10 μg/mL LPS刺激DCs成熟。

1.2.2小鼠脾源性DCs的分離與培養(yǎng)處理C57BL/6小鼠脫頸椎處死，無菌條件下迅速取脾，研磨于1640培養(yǎng)基中，收集至離心管中經(jīng)離心后加入預(yù)溫37 ℃的紅細(xì)胞裂解液5 mL，靜置5 min后加RPMI-1640 5 mL終止裂解，離心2次后計(jì)數(shù)，用完全培養(yǎng)基(含10 ng/mL 重組IL-4、20 ng/mL 重組GM-CSF、10%滅活的FBS及1%雙抗)調(diào)整細(xì)胞濃度至1×108mL-1，將細(xì)胞種于6孔板，每孔2 mL于37 ℃、 5% CO2溫箱中培養(yǎng)，3 h后棄去上清，加入相同因子濃度的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，48 h和96 h分別進(jìn)行半換液處理，第8天部分細(xì)胞添加10 μg/mL LPS刺激DCs成熟。

1.2.3倒置顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)觀察取培養(yǎng)第5，7，8天骨髓源性DCs和脾源性DCs于倒置顯微鏡下觀察。

1.2.4掃面電鏡下細(xì)胞形態(tài)觀察收集培養(yǎng)第8天骨髓源性DCs和脾源性DCs，用3%戊二醛固定，用70%，90%，100%的乙醇進(jìn)行梯度洗脫，乙酸異戊脂置換后，CO2臨界點(diǎn)干燥，掃描電鏡觀察細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)。

1.2.5FCM檢測(cè)收集培養(yǎng)第9天細(xì)胞，離心后用PBS重懸計(jì)數(shù)，取100 μL細(xì)胞量約為106的細(xì)胞于流式管中，分別加入APC標(biāo)記的CD11c(小鼠DCs特異性表面標(biāo)記物)抗體及同型對(duì)照抗體，PE-CD83及同型對(duì)照，室溫避光孵育20 min，離心后流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD11c+及CD11c+CD83+的比例。

1.2.6ELISA檢測(cè)收集細(xì)胞上清，按照試劑盒說明書檢測(cè)IL-12含量。

2　結(jié)　　果

2.1倒置顯微鏡下DCs形態(tài)培養(yǎng)第5天時(shí)，骨髓源性DCs和脾源性DCs均有明顯的毛刺狀突起，懸浮于培養(yǎng)基中，不同的是脾源性DCs開始出現(xiàn)輕微聚集狀態(tài)，而骨髓源性DCs大多呈散在狀態(tài)，且底壁有明顯的枝狀巨噬細(xì)胞，見圖1和圖2。培養(yǎng)第7天時(shí)，骨髓源性DCs呈聚集狀態(tài)，散在細(xì)胞較少，毛刺較之前變大，DCs纏繞在一起，見圖3；脾源性DCs如葡萄狀懸浮于培養(yǎng)基中，其集落大于骨髓源性DCs的集落，見圖4。培養(yǎng)第8天時(shí)，骨髓源性DCs聚集狀態(tài)變大，呈葡萄狀懸浮于培養(yǎng)基中，細(xì)胞周邊可見明顯的毛刺狀突起，見圖5；脾源性DCs成簇狀懸浮于培養(yǎng)基中，其集落較之前明顯變大，而且明顯大于骨髓源性DCs的集落，見圖6。

圖1　培養(yǎng)第5天時(shí)骨髓源性DCs形態(tài)(×200)

圖2　培養(yǎng)第5天時(shí)脾源性DCs形態(tài)(×200)

圖3培養(yǎng)第7天時(shí)骨髓源性DCs形態(tài)(×200)

圖4　培養(yǎng)第7天時(shí)脾源性DCs形態(tài)(×200)

2.2掃描電鏡下DCs形態(tài)培養(yǎng)第8天，骨髓源性DCs表面呈云霧狀，周邊可見明顯的毛刺狀突起，兩個(gè)細(xì)胞緊緊聚集在一起，見圖7；脾源性DCs表面呈薄紗狀，周邊可見絲狀不定向突起或薄紗狀圓球形突起，5個(gè)細(xì)胞緊緊纏繞在一起，其集落明顯大于骨髓源性DCs集落，見圖8。

圖5　培養(yǎng)第8天時(shí)骨髓源性DCs形態(tài)(×200)

圖6　培養(yǎng)第8天時(shí)脾源性DCs形態(tài)(×200)

圖7　培養(yǎng)第8天時(shí)掃面電鏡下骨髓源性DCs形態(tài)(×10 000)

圖8　培養(yǎng)第8天時(shí)掃面電鏡下脾源性DCs形態(tài)(×10 000)

2.3DCs純度收集培養(yǎng)第8天的DCs流式鑒定其純度，先圈出目標(biāo)細(xì)胞，通過同型對(duì)照可得骨髓源性DCs純度為(81.567±2.902)%，脾源性DCs 純度為(87.227±4.463)%，脾源性DCs純度高于骨髓源性DCs(t=1.841,P<0.05)。

2.4LPS刺激前后骨髓源性DCs和脾源性DCs CD11c+CD83+表達(dá)情況LPS刺激前，骨髓源性DCs CD11c+CD83+表達(dá)比例明顯高于脾源性DCs CD11c+CD83+表達(dá)比例(P<0.05)；LPS刺激后，骨髓源性DCs和脾源性DCs CD11c+CD83+表達(dá)比例均明顯高于刺激前(P均<0.05)，脾源性DCs CD11c+CD83+表達(dá)比例與骨髓源性DCs比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1及圖9、圖10。

表1　LPS刺激前后骨髓源性和脾源性DCs CD11c+CD83+表達(dá)情況

圖9　骨髓源性DCs LPS刺激前后CD11c+CD83+表達(dá)情況

圖10　脾源性DCs LPS刺激前后CD11c+CD83+表達(dá)情況

2.5LPS刺激前后骨髓源性DCs和脾源性DCs分泌IL-12情況LPS刺激前，骨髓源性DCs和脾源性DCs分泌IL-12量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；LPS刺激后，骨髓源性DCs和脾源性DCs分泌IL-12量均明顯高于刺激前(P均<0.05)，脾源性DCs分泌IL-12量與骨髓源性DCs分泌量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

3　討　　論

DCs是Steinman和Cohn于1973年發(fā)現(xiàn)的一群外形奇特、具有強(qiáng)大的活化初始T細(xì)胞能力的細(xì)胞，它是免疫反應(yīng)的啟動(dòng)者，具有很強(qiáng)的遷移能力。它起源于機(jī)體內(nèi)的多功能造血干細(xì)胞，分為DCs前體細(xì)胞、未成熟DCs、成熟DCs 3個(gè)成長(zhǎng)階段，一般來說未成熟DCs可以通過其TLR直接感知病原體組分(如LPS)而誘導(dǎo)成熟，表現(xiàn)為膜表面共刺激分子上調(diào)[7]，分泌因子與趨化因子增加[8]，抗原提呈能力增強(qiáng)[9]，通過JAK/STAT通路使Th1、Th2細(xì)胞極化等[10]。研究發(fā)現(xiàn)LPS可通過提高iDC表面CD83、CD86的表達(dá)，分泌因子能力和刺激T細(xì)胞增殖能力的增強(qiáng)等來誘導(dǎo)iDCs的成熟[11]，成熟后的DCs可以更有效地發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[12]，但目前DCs尚無特定的表面分子標(biāo)志及明確的生物學(xué)性能，需要結(jié)合細(xì)胞形態(tài)、生物學(xué)性能和表面特異性分子3個(gè)方面對(duì)DCs進(jìn)行鑒別。

表2　LPS刺激前后骨髓源性和脾源性DCs分泌IL-12情況

人們已經(jīng)能在體外用多種因子如GM-CSF、IL-4、IFN-α、Flt3配體、IL-10、IL-6、TPO和IL-13等誘導(dǎo)出純度較高及性能較好的DCs[13],但DCs的產(chǎn)量仍不能滿足當(dāng)前DCs的實(shí)驗(yàn)需要。面對(duì)目前DCs短缺的問題，本課題組對(duì)脾源性DCs展開了探索。結(jié)果顯示，經(jīng)LPS誘導(dǎo)DCs成熟后，骨髓和脾臟均可獲得有明顯DCs生物學(xué)特性的細(xì)胞，純度均為80%以上，且脾源性DCs純度較高，形成的細(xì)胞集落也較大。FCM結(jié)果顯示LPS刺激前骨髓源性DCs的CD11c+CD83+表達(dá)比例明顯高于脾源性DCs 的CD11c+CD83+表達(dá)比例，CD83是DCs的表面特異性分子，一般來說低表達(dá)于未成熟DCs表面，高表達(dá)于成熟DCs表面，LPS是革蘭陰性菌的組成部分，它可以與DCs表面的TLR4結(jié)合并通過MyD88依賴性途徑或MyD88非依賴性途徑活化NF-κB分子，繼而介導(dǎo)誘導(dǎo)DCs的成熟[14]，結(jié)果說明骨髓源性DCs早于后者成熟，與文獻(xiàn)[15]結(jié)果一致；LPS刺激后，骨髓源性DCs和脾源性DCs CD11c+CD83+的表達(dá)均增加，且脾源性DCs 的CD11c+CD83+表達(dá)比例與骨髓源性DCs比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示兩者經(jīng)LPS刺激后CD11c+CD83+表達(dá)情況相似。ELISA結(jié)果顯示，骨髓源性DCs和脾源性DCs IL-12分泌量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示兩者分泌IL-12的性能相似；經(jīng)LPS刺激后，兩者分泌IL-12量均明顯升高，可能是經(jīng)LPS誘導(dǎo)后DCs的轉(zhuǎn)錄因子IRF-3和NF-κB被激活[16]，繼而分泌更多的IL-12來更好地發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，且脾源性DCs 分泌IL-12量與骨髓源性DCs比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，兩者DCs生物學(xué)特性相似。

實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)尚有很多問題有待解決：①在脾源性DCs培養(yǎng)3～5 d時(shí)鏡下可見大量的暗色溶出物，筆者推測(cè)這部分溶出物可能是在因子選擇下大量的非DCs前體細(xì)胞裂解死亡，但未進(jìn)行深入研究。②關(guān)于骨髓前體細(xì)胞和脾細(xì)胞的種板密度仍需要探討，筆者發(fā)現(xiàn)骨髓源性DCs生長(zhǎng)后期密度過大，脾源性DCs生長(zhǎng)后期密度過小。③由于時(shí)間原因,實(shí)驗(yàn)中筆者未對(duì)所培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行MLR(刺激T淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn))和抗原吞噬能力檢測(cè)，關(guān)于其特性尚需進(jìn)一步研究。④脾源性DCs產(chǎn)量?jī)H為骨髓源性DCs的1/7左右，但其純度稍大于骨髓源性DCs，應(yīng)當(dāng)在脾源性DCs產(chǎn)量問題上進(jìn)行深入研究，或許可以采取將脾源性DCs進(jìn)行體外擴(kuò)增再繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)的方法，但尚不能明確是否可行。

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