米象的脈沖微波致死機制研究

豁銀強　車　麗　湯尚文 　于　博　賈才華　趙思明

(湖北文理學(xué)院1，襄陽　441053) (華中農(nóng)業(yè)大學(xué)2，武漢　430070)

微波具有選擇性和穿透性，對害蟲有較好的殺滅效果。普通微波已成功應(yīng)用于大米的工業(yè)化殺蟲防霉，并取得了良好的效果[1-2]。相對于普通微波，脈沖微波是一種間歇發(fā)射的微波方式，微波發(fā)射的能量短時間內(nèi)突變后迅速回到初始狀態(tài)。脈沖微波較之普通微波具有殺蟲時間短，能耗低，效率高及運行穩(wěn)定等優(yōu)勢，是一種有廣闊應(yīng)用前景的殺蟲技術(shù)[3-4]。近年來，人們將脈沖微波用于液體食品及中藥滅菌保鮮，并取得良好的效果[5-6]。我們前期研究表明脈沖微波對大米具有良好的殺滅米象等害蟲的效果[7]。相對于普通微波主要利用熱效應(yīng)引起生物體溫度升高導(dǎo)致機體死亡，脈沖微波能在不引起明顯升溫的情況下實現(xiàn)對害蟲的殺滅作用，因此，通常認為脈沖微波主要通過引起生物體的非熱效應(yīng)實現(xiàn)殺蟲的效果[8]。而有關(guān)脈沖微波對米象等糧食儲藏害蟲致死機理的研究還鮮見報道。

本研究選取脈沖微波劑量、脈沖寬度、脈沖間歇時間、總時間4個因素，研究脈沖微波對米象致死行為、體內(nèi)堿性磷酸酶活性、乙酰膽堿酯酶活性及表觀特征的影響，以期揭示脈沖微波對米象的致死機制，為脈沖微波在大米儲藏防蟲中的應(yīng)用提供理論和實踐依據(jù)。

1.1　材料與試劑

米象，產(chǎn)之湖北十堰，由國家糧食局科學(xué)研究院提供，本研究室培養(yǎng)數(shù)代。

大米，新優(yōu)188，湖北黃岡東坡糧油集團提供。生物試劑堿性磷酸酶測定試劑盒和乙酰膽堿酯酶測定試劑盒購于南京建成生物有限公司。其他試劑均為分析純，購于國藥集團。

1.2　儀器與設(shè)備

QW-1HO型微波爐：廣州科威微波能有限公司；JA12002電子精密天平：梅特勒公司；722S分光光度計：上海精密科學(xué)儀器有限公司；JSM-6390 PLV 型掃描電鏡：日本JEOL公司。

1.3　實驗方法

1.3.1米象的培養(yǎng)

取無霉變、無蟲害小麥，用自來水淘洗5次，去除石子等雜質(zhì)。將洗凈的小麥于70 ℃烘箱中干燥含水量至14%左右，-18 ℃冰箱中冷凍5 d以殺死可能存在的蟲卵，做米象飼料。

取洗凈烘干的培養(yǎng)瓶，瓶口處均勻涂抹固形物含量為20%的聚四氟乙烯。稱取80～100 g恢復(fù)至室溫的米象飼料，加入約300頭米象，于培養(yǎng)瓶中封口，30 ℃恒溫培養(yǎng)，每天用濕抹布擦拭培養(yǎng)箱內(nèi)壁，控制培養(yǎng)箱內(nèi)濕度在60%以上。

1.3.2脈沖微波處理米象

基于前期脈沖微波殺蟲防霉工藝的研究結(jié)果[7]，本實驗以微波總時間為40 s、間歇時間為100 ms、劑量為10 w/g、脈沖寬度為300 ms作為基本條件，分別調(diào)整各因素進行單因素實驗，考察脈沖寬度(100、200、300、400、500 ms)、間歇時間(50、100、150、200、250 ms)、總時間(10、20、30、40、50 s)和劑量(2.5、5、7.5、10、12.5、15 w/g)對米象致死行為的影響，每個處理3個重復(fù)。

1.3.3米象致死率測定

取羽化1～2 d的米象成蟲30頭，裝入自封袋中，轉(zhuǎn)入一定量的大米，保鮮膜封口，自然狀態(tài)下培養(yǎng)5 min，將混有米象的大米放入微波爐中進行脈沖微波處理。將處理后的米象倒入白色搪瓷盤中，用軟毛筆輕觸其腹部，無反應(yīng)者視為死亡，并記錄存活米象的反應(yīng)狀態(tài)及爬行情況。米象致死率按下式計算：

米象致死率=死亡米象頭數(shù)/米象總頭數(shù)×100%

1.3.4米象體內(nèi)堿性磷酸酶活性測定

取脈沖微波處理后米象成蟲20頭，雙蒸水清洗兩次，去除表面雜質(zhì)，加入Tris-HCl(pH=7.5)緩沖液1 mL，冰浴下充分研磨成勻漿，加入20%正丁醇0.1 mL，4 ℃下6 000 r/min 離心15 min，取上清液備用。

堿性磷酸酶活性測定按照堿性磷酸酶活測定試劑盒說明書進行。酶活定義為每克組織蛋白在37 ℃與基質(zhì)作用15 min產(chǎn)生1 mg酚為一個酶活單位。

采用Lowry法測定蛋白質(zhì)含量。

1.3.5米象體內(nèi)乙酰膽堿酯酶活性測定

取20頭米象，稱重后用雙蒸水清洗兩次，洗凈米象表面雜質(zhì)，按質(zhì)量/體積1∶27加入85%生理鹽水冰浴下充分研磨成勻漿，加入20%正丁醇0.1 mL，4 ℃下6 000 r/min離心15 min，取上清液備用。

按照乙酰膽堿酯酶活力測定試劑盒說明書測定乙酰膽堿酯酶活力。酶活力定義為每毫克組織蛋白在37 ℃保溫6 min，水解反應(yīng)體系中1 μmol基質(zhì)為1個活力單位。

采用Lowry法測定蛋白質(zhì)的含量。

1.3.6米象表面形態(tài)

微波處理前后米象整體形態(tài)用SAMSUNG ST95(1 610萬像素)數(shù)碼相機進行拍照。

米象口部和尾部形態(tài)利用掃描電鏡進行觀察并成像。取脈沖微波處理米象，用生理鹽水洗凈表面雜質(zhì)，分別于濃度為50%、60%、70%、80%、90%、100%乙醇溶液中脫水處理5 min。經(jīng)處理后的米象貼于樣品臺上噴金固定，進行電鏡掃描成像。

1.3.7數(shù)據(jù)分析

實驗中各指標均測定3次重復(fù)，3個平行，結(jié)果用平均數(shù)加標準誤表示。用SAS對數(shù)據(jù)進行方差分析以比較處理間的差異性(P<0.05)；用SAS 8.0中的非線性回歸分析程序獲得米象致死率的曲線。利用origin 8.0進行圖形的繪制。

2　結(jié)果與分析

2.1　脈沖微波對米象的致死效應(yīng)

研究了脈沖微波寬度、間歇時間、總時間及劑量對米象的致死效應(yīng)。米象致死率隨脈沖寬度的延長而增加。當(dāng)脈沖寬度低于100 ms時，沒有米象死亡，僅個別米象爬行速度緩慢，2 h后恢復(fù)正常；當(dāng)脈沖寬度為200 ms時，有少量的米象死亡，盡管未死亡米象出現(xiàn)爬行紊亂等異常情況，但2 h內(nèi)能恢復(fù)正常；脈寬為300 ms以上時，米象致死率大幅度增加，部分存活米象喪失運動能力，并在2 h內(nèi)自然死亡；當(dāng)脈寬為500 ms時，米象被全部殺死，米象頭部及腹部出現(xiàn)焦黑。米象致死率隨脈沖間歇時間延長而降低，當(dāng)脈沖微波的間歇時間低于50 ms時，米象致死率達100%；當(dāng)間歇時間為100 ms時，個別米象無爬行能力，2 h后恢復(fù)正常；間歇時間200 ms 以上時，米象行為未處理米象相似。延長脈沖微波總時間顯著增加米象致死率，微波作用總時間在20 s以內(nèi)，米象無死亡現(xiàn)象，但脈沖微波作用導(dǎo)致米象行動遲緩、爬行過程中容易出現(xiàn)摔倒等現(xiàn)象；脈沖微波總時間為50 s時，米象致死率為100%，且米象口器及尾部呈黑色，這可能是由于微波的尖角效應(yīng)使米象的口器及尾部因溫度較高而發(fā)生焦化。米象的致死率隨微波劑量的增大而增加，當(dāng)微波劑量在5 w/g以內(nèi)時，米象的致死率較低，米象表現(xiàn)活躍，僅少量米象爬行能力喪失，但隨后又恢復(fù)；劑量為7.5 w/g的脈沖微波處理米象無爬行能力，并存活米象均在2 h內(nèi)死亡；當(dāng)劑量達到10 w/g時，米象致死率達到100%。

圖1　脈沖微波前后米象外貌形態(tài)

脈沖微波處理前后米象的整體形態(tài)如圖1。未處理米象表面紅褐色，少數(shù)米象頭部黑色，背部褐色斑不明顯，足部張開，觸角向前伸展，爬行速度較快。一定條件脈沖微波處理后米象死亡，身體卷曲、僵硬，背部褐色圓斑突出，口器顏色加重且下垂，足部彎曲蜷縮，觸角合攏下垂，可能是由于脈沖微波的尖角效應(yīng)導(dǎo)致米象體內(nèi)蛋白質(zhì)等生物大分子發(fā)生變性。

2.2　脈沖微波對米象酶活性的影響

2.2.1脈沖微波對米象乙酰膽堿酯酶活性的影響

中樞神經(jīng)系統(tǒng)是微波輻射最敏感的靶部位，微波輻照能夠?qū)е履憠A類神經(jīng)遞質(zhì)代謝紊亂[9]。不同脈沖微波處理條件下米象體內(nèi)乙酰膽堿酯酶(AChE)活力如圖2所示。脈沖微波處理后米象體內(nèi)的AChE活性較未處理樣品低，米象體內(nèi)的AChE活性隨脈沖寬度的增加而降低。脈寬為100 ms時，AChE活性與未處理樣品無明顯差異，500 ms脈寬處理米象的酶活性最低。AChE活性隨脈沖微波間歇時間的延長而逐漸升高，但均低于未處理樣品，脈沖微波間歇時間低于150 ms時酶活力均較低。隨脈沖微波處理總時間延長，酶活力呈現(xiàn)出逐步降低的趨勢，處理總時間大于30 s時，酶活力降低至較低水平。AChE活性隨脈沖微波劑量增加而顯著降低，在微波劑量低于7.5 w/g條件下， AChE活性隨微波劑量增加而降低，在微波劑量高于7.5 w/g后趨于平穩(wěn)。

a 固定微波總時間為40 s、間歇時間為100 ms、劑量為10 w/g

b 固定微波總時間為40 s、劑量為10 w/g、脈沖寬度為300 ms

c 固定間歇時間為100 ms、劑量為10 w/g、脈沖寬度為300 ms

d 固定微波總時間為40 s、間歇時間為100 ms、脈沖寬度為300 ms圖2　脈沖微波對米象乙酰膽堿酯酶活力的影響

微波場的量子能作用于生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子，一方面導(dǎo)致這些物質(zhì)內(nèi)部的次級鍵發(fā)生斷裂或重組，另一方面導(dǎo)致大分子體系中分子基團發(fā)生構(gòu)象異常，最終導(dǎo)致喪失生物活性[10]。脈沖微波能在非升溫情況下引起蛋白質(zhì)構(gòu)象改變喪失活性[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，即使在脈沖微波處理沒有引起溫度顯著升高的情況下，AChE活性也出現(xiàn)不同程度的降低。因此，推測其可能是微波的非熱效應(yīng)引起AChE分子構(gòu)象改變導(dǎo)致活性降低。當(dāng)AChE活性降低時，乙酰膽堿在突觸部位大量積累，不斷激活突觸后膜上的乙酰膽堿受體，突觸后神經(jīng)長時間處于興奮狀態(tài)，突觸部位的正常神經(jīng)傳導(dǎo)受阻，最終導(dǎo)致生物體死亡。

2.2.2脈沖微波對米象堿性磷酸酶活的影響

不同脈沖微波處理米象體內(nèi)堿性磷酸酶(ALP)活性變化如圖3所示，脈沖寬度100 ms時酶活性較未處理樣品略有升高，表現(xiàn)出低脈寬微波對ALP酶有一定的激活效應(yīng)，隨著脈寬進一步增大，ALP活性出現(xiàn)降低趨勢。ALP活性隨間歇時間延長先略有升高，隨后逐漸下降，脈沖間歇時間大于200 ms以后其活性接近未處理樣品。ALP活性隨微波總時間延長及微波劑量增加均呈現(xiàn)出下降的趨勢。早期研究報道，微波輻照會降低溶液中的ALP活性[12]。ALP參與生物體內(nèi)的磷代謝和鈣代謝等過程，在昆蟲的發(fā)育、神經(jīng)傳導(dǎo)、激素合成、物質(zhì)代謝等過程中起著重要作用[13]，同時也會影響到細胞內(nèi)鈣離子的跨膜運輸以及神經(jīng)組織中細胞的分化和增殖[14]。

a 固定微波總時間為40 s、間歇時間為100 ms、劑量為10 w/g

b 固定微波總時間為40 s、劑量為10 w/g、脈沖寬度為300 ms

c 固定微波總時間為40 s、間歇時間為100 ms、脈沖寬度為300 ms

d 固定間歇時間為100 ms、劑量為10 w/g、脈沖寬度為300 ms圖3　脈沖微波對米象ALP酶活力的影響

2.3　米象致死率、米溫及酶滅活率之間的相關(guān)性分析

為了揭示脈沖微波殺死米象的作用機制，分析了米象致死率、米樣溫度、堿性磷酸酶活力及乙酰膽堿酯酶活力之間的相關(guān)性。

表1　米象致死率與溫度及酶活間相關(guān)性分析

注：*，**分別表示P<0.05和P<0.01顯著水平。

米象致死率與米溫、堿性磷酸酶活性及乙酰膽堿酶活性之間的相關(guān)性如表1。由表1可知，米象致死率與米樣溫度間存在極顯著正相關(guān)性(P<0.01)，相關(guān)系數(shù)達到0.95，說明米溫升高是引起米象死亡的主要因素；米象致死率與乙酰膽堿酶之間存在極顯著的負相關(guān)，說明乙酰膽堿酶滅活可能一定程度上導(dǎo)致米象死亡。米象致死率與堿性磷酸酶之間不存在顯著的相關(guān)性，推測堿性磷酸酶部分失活可能并不能直接導(dǎo)致米象死亡。

圖4a為米樣溫度與米象致死率之間的關(guān)系圖。由圖4a可以看出，米象致死率隨著米樣溫度的升高而呈現(xiàn)增加的趨勢，但米樣溫度接近55 ℃時，脈沖微波就幾乎殺滅了所有的米象。但在脈沖總時間40 s，間歇時間100 ms，微波劑量10 w/g，脈沖寬度為200 ms條件下，米樣溫度僅從20.3 ℃升高到26.6 ℃，而有11.7%的米象發(fā)生死亡，推測其可能主要是由脈沖微波的非熱效應(yīng)引起的，米象在脈沖微波的熱效應(yīng)和非熱效應(yīng)聯(lián)合作用下死亡。相對于水浴加熱，微波能在較低的溫度下殺死大腸桿菌等生物體[15]。脈沖微波處理引起部分存活米象容易摔倒，可能是由于脈沖微波干擾了米象的神經(jīng)系統(tǒng)。微波對生物神經(jīng)系統(tǒng)的影響受到越來越多的關(guān)注。微波輻射可引起小鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降和神經(jīng)行為改變[16]。一定劑量微波輻射，可影響大鼠學(xué)習(xí)記憶功能并引起大鼠海馬組織中氨基酸類、膽堿類神經(jīng)遞質(zhì)代謝紊亂[17]。

圖4b為乙酰膽堿酶活性與米象致死率之間的關(guān)系圖。由圖4b可以看出，米象致死率隨乙酰膽堿酶活性降低而升高，當(dāng)乙酰膽堿酶活性低于0.3U/gpro時，米象的致死率達80%以上；乙酰膽堿酶活性高于0.75 U/gpro時，并沒有米象發(fā)生死亡。而當(dāng)乙酰膽堿酶活性為0.35～0.57 U/gpro之間時，米象的致死率出現(xiàn)較大的波動，這可能是由于不同處理條件下的非熱效應(yīng)對乙酰膽堿酶活性的殺滅作用和對米象的致死效應(yīng)不一致引起的。

圖4　米溫(a)和乙酰膽堿酶活性(b)與米象致死率的關(guān)系

參考文獻[1]，構(gòu)建了不同米樣溫度下米象的熱致死動力學(xué)模型：

式中：T0(℃)表示米象開始致死時的米溫，T1(℃)是米象100%死亡時的米溫。常數(shù)A是反映米象致死難易程度的敏感因子，常數(shù)m是擬合模型的系數(shù)。

溫度對米象致死的實驗值和擬合值曲線如圖5，從圖5可以看出擬合值與實驗值比較接近。該擬合模型的m值為2.9，表明模型比較適合用來表征米象的溫度致死特性。擬合模型的T0為25 ℃，表明脈沖微波條件下，米樣溫度在接近室溫時就開始有米象死亡，說明脈沖微波的非熱效應(yīng)比較明顯，T1為65 ℃，該值與實驗結(jié)果比較一致。溫度在T0～T1范圍內(nèi)，A值為68，表明米象在所研究條件下對微波引起的溫度非常敏感。工業(yè)化連續(xù)微波爐處理條件下，米象的A值僅為0.042[1]，該值與本實驗的值相差較大，表明米象對脈沖微波的熱效應(yīng)更加敏感，也可能是由于脈沖微波對米象的非熱效應(yīng)比普通微波的非熱效應(yīng)更顯著，非熱效應(yīng)可能對熱效應(yīng)有協(xié)同作用，而導(dǎo)致米樣溫度小幅度變化就引起米象致死率顯著增加。

圖5　溫度對米象致死率影響的實驗值與擬合值曲線

2.4　脈沖微波對米象表觀形態(tài)的影響

圖6為不同脈沖寬度條件下脈沖微波處理對米象口器的影響。由圖6可以看出，不同脈寬微波處理米象口器表現(xiàn)出一定的差異，脈沖微波處理引起米象口器部位蠟質(zhì)發(fā)生融化現(xiàn)象，融化程度隨微波脈寬的增加而加劇。改變脈沖微波總時間、脈沖劑量及脈沖間歇時間，米象口器也隨之發(fā)生類似的變化。隨著微波間歇時間縮短及總時間延長，米象口器變得較模糊。脈沖微波劑量與米象口器模糊程度間無明顯的正相關(guān)，其可能是由于脈沖微波對米象口器的影響是熱效應(yīng)和非熱效應(yīng)綜合作用的結(jié)果。脈沖微波輻照引起米象口器發(fā)生異常，進而影響米象的呼吸及攝食導(dǎo)致米象死亡。

圖6　脈沖微波對米象口器形態(tài)的影響

圖7為不同脈沖寬度下脈沖微波處理對米象尾部的影響。從圖7可以看出，脈沖微波引起米象尾部發(fā)生較大的變化。增加脈沖寬度，米象尾部張開、生殖器外露。延長脈沖微波總時間、增加微波劑量及縮短脈沖間隔時間均引起米象尾部出現(xiàn)類似的情況。其中脈沖微波總時間對米象尾部形態(tài)的影響較大，當(dāng)脈沖微波總時間為50 s時，米象尾部向外突出，并出現(xiàn)小裂紋。脈沖微波處理引起米象尾部出現(xiàn)異常，可能會對米象的排泄功能產(chǎn)生影響，從而導(dǎo)致米象死亡。

圖7　脈沖微波對米象尾部形態(tài)的影響

3　結(jié)論

脈沖微波寬度、間歇時間、總時間及微波強度均對米象有顯著的影響。脈沖微波不僅會引起米象死亡，也會引起未死亡米象行為發(fā)生異常。脈沖微波處理后米象致死率與米樣溫度呈顯著的正相關(guān)，當(dāng)米樣溫度高于56 ℃時米象致死率接近100%。米象致死率與乙酰膽堿酯酶活性呈現(xiàn)顯著的負相關(guān)，乙酰膽堿酯酶活性低于0.3 U/gpro時，米象的致死率達到80%以上，因此推測乙酰膽堿酶失活可能是引起米象死亡的因素之一。堿性磷酸酶活性與米象致死率間不存在顯著的相關(guān)性。脈沖微波處理引起米象出現(xiàn)身體僵硬、身體發(fā)黑等癥狀。脈沖微波處理也會引起米象口器和尾部出現(xiàn)異常，進而影響米象的呼吸、攝食和排泄而導(dǎo)致米象死亡。因而說，脈沖微波輻照對米象致死既有熱效應(yīng)，也存在非熱效應(yīng)，是熱效應(yīng)和非熱相應(yīng)聯(lián)合作用的效果。

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