菌酶協(xié)同發(fā)酵改善玉米-豆粕型飼料營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的研究

張　煜　石常友　王　成　王鳳芹　路則慶　汪以真

(浙江大學(xué)飼料科學(xué)研究所；浙江省動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室； 農(nóng)業(yè)部(華東)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州　310000)

近年來(lái)，隨著飼用抗生素使用的逐步受限，如何保障畜禽健康成為我國(guó)畜牧業(yè)的一大挑戰(zhàn)。玉米和豆粕是目前仔豬生產(chǎn)上主要的飼料原料[1]，而豆粕中的抗原蛋白、胰蛋白酶抑制劑及植酸等抗?fàn)I養(yǎng)因子會(huì)阻礙消化道吸收利用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，不利于動(dòng)物生長(zhǎng)和健康[2]。研究表明，生物發(fā)酵能有效降解飼料中的抗?fàn)I養(yǎng)因子，促進(jìn)養(yǎng)分的消化吸收，改善動(dòng)物健康，減少飼用抗生素(促生長(zhǎng))的使用。選取合適的微生物進(jìn)行飼料的發(fā)酵能有效降解飼料中的抗?fàn)I養(yǎng)因子，促進(jìn)養(yǎng)分的消化吸收，分泌的代謝產(chǎn)物如小肽，有機(jī)酸等利于改善動(dòng)物健康[3-5]。

目前乳酸菌、酵母菌、枯草芽孢桿菌被廣泛引用于飼料發(fā)酵。其中，乳酸菌產(chǎn)生的有機(jī)酸、細(xì)菌素等代謝產(chǎn)物有利于改善飼料的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)[6]，酵母菌能降解豆粕中的水蘇糖、棉子糖[7]，而枯草芽孢桿菌對(duì)豆粕中抗原蛋白具有較強(qiáng)的降解效果[8]。多菌株混合發(fā)酵理論上可以發(fā)揮不同菌株的發(fā)酵特性，但是不同菌株間存在可能存在拮抗作用[8]，比如，當(dāng)米曲霉和干酪乳桿菌直接混合發(fā)酵豆粕，干會(huì)降低米曲霉對(duì)豆粕中抗原蛋白的降解效果[9]。而采用菌酶協(xié)同發(fā)酵，可以提高發(fā)酵過(guò)程中微生物對(duì)飼料中大分子物質(zhì)利用效率，如纖維素酶水解秸桿生成的單糖能為酵母菌合成菌體蛋白提供能量[10]，進(jìn)而提高飼料品質(zhì)。

本研究以玉米、豆粕作為主要的發(fā)酵原料，通過(guò)單菌固態(tài)發(fā)酵比較不同菌株對(duì)飼料成分及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的影響。進(jìn)一步采用混菌發(fā)酵和菌酶協(xié)同的方式優(yōu)化飼料的發(fā)酵工藝，制備抗?fàn)I養(yǎng)因子含量低同時(shí)乳酸含量高的生物發(fā)酵飼料。隨后通過(guò)仔豬飼喂實(shí)驗(yàn)對(duì)比生物發(fā)酵復(fù)合飼料與并將發(fā)酵飼料飼喂仔豬，檢驗(yàn)飼料對(duì)于仔豬生長(zhǎng)性能的影響，為實(shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)用提供參考。

1　材料與方法

1.1　實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)菌株：枯草芽孢桿菌BS12為本研究室自行分離的菌株，枯草芽孢桿菌CICC20076和枯草芽孢桿菌CICC20070：中國(guó)工業(yè)微生物菌株保藏管理中心(CICC)；糞腸球菌EF(原始編號(hào)NCIMB10415)：山東寶利來(lái)生物有限公司；干酪乳桿菌LC和植物乳桿菌LP為本實(shí)驗(yàn)室自行分離的菌株；釀酒酵母：中國(guó)工業(yè)微生物菌株保藏管理中心(CICC)；

豆粕：浙江某生物發(fā)酵公司。復(fù)合酶制劑：廣東某酶制劑公司。

主要儀器：Kjeltec 8400全自動(dòng)凱氏定氮儀：德國(guó)FOSS公司；L-8900全自動(dòng)氨基酸分析儀：日本 Hitachi公司；SpectraMax M5酶標(biāo)儀：美國(guó)Molecular Devices公司等。

1.2　實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1發(fā)酵菌株的篩選

取9 g豆粕、9 g 玉米粉、2 g麩皮于100 mL三角瓶中攪拌均勻后配成復(fù)合飼料，于105 ℃滅菌15 min，按接種量5%別加入枯草芽孢桿菌CICC20076、枯草芽孢桿菌CICC21076、枯草芽孢桿菌BS12、釀酒酵母CICC1520、糞腸球菌EF、干酪乳酸菌LC和植物乳桿菌LP的種子液，同時(shí)加入滅菌水至飼料總含水量為45%，發(fā)酵體系內(nèi)菌濃度達(dá)到1.0×107CFU/g，攪拌均勻后于37 ℃恒溫培養(yǎng)，進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵。實(shí)驗(yàn)根據(jù)菌的種類不同共設(shè)7個(gè)組，每組3個(gè)重復(fù)，其中枯草芽孢桿菌CICC20076組、枯草芽孢桿菌CICC21076組和枯草芽孢桿菌BS12組發(fā)酵24 h，釀酒酵母CICC1520組發(fā)酵48 h，糞腸球菌EF組、干酪乳酸菌LC組和植物乳桿菌LP組發(fā)酵48 h。發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵飼料于60 ℃烘干，粉碎過(guò)60目篩后，測(cè)定發(fā)酵飼料中粗蛋白、豆粕抗原蛋白、中性洗滌纖維、酸溶蛋白以及乳酸含量。

1.2.2混菌發(fā)酵菌株配比優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

將篩選出了芽孢桿菌BS12與糞腸球菌EF以不同比例添加入復(fù)合飼料，添加比如表1所示，按1.2.1方法先進(jìn)行24 h好氧發(fā)酵，再進(jìn)行48 h厭氧發(fā)酵，選取最優(yōu)的發(fā)酵比例。

1.2.3復(fù)合酶制劑對(duì)纖維降解效果

為彌補(bǔ)細(xì)菌對(duì)纖維降解的不足。本研究中采用復(fù)合酶(主成分為：纖維素酶、甘露糖酶、果膠酶)強(qiáng)化飼料纖維的降解。分別以質(zhì)量比0.3%、0.5%、0.7%和1.0% 加入復(fù)合飼料中，隨后經(jīng)過(guò)枯草芽孢桿菌BS12和糞腸球菌EF分步發(fā)酵后，測(cè)定發(fā)酵飼料中中性洗滌纖維含量。

1.2.4菌酶協(xié)同發(fā)酵對(duì)飼料氨基酸體外消化率的影響

兩步酶法測(cè)定發(fā)酵復(fù)合飼料的體外消化率參考 Sakamoto等的方法進(jìn)行[11]。分別取3 g發(fā)酵復(fù)合飼料和未發(fā)酵復(fù)合飼料，裝入150 mL三角瓶中。加入30 mL 10 000 U/mL的胃蛋白酶溶液(3 000 U/mg, Sigma)，用0.05 mol/L KCl-HCl緩沖液調(diào)整至pH為 2.0，隨后在39 ℃，150 r/min條件下 振蕩消化4 h。隨后用1 mol/L NaOH調(diào)整溶液pH為7.0，加入150 mg胰蛋白酶(250 U/mg, Sigma)于39 ℃，150 r/min繼續(xù)消化4 h。最后加入5 mL 20%的磺基水楊酸溶液終止反應(yīng)，沉淀30 min。消化后的溶液在3 000 r/min條件下離心15 min，棄上清。剩余的殘?jiān)?05 ℃條件下烘干處理4 h，獲得殘?jiān)鼧颖?。參照?guó)標(biāo)《GB/T 6432—1994》檢測(cè)發(fā)酵前后飼料中的粗蛋白含量[12]，參照國(guó)標(biāo)《GB/T 18246—2000》檢測(cè)殘?jiān)写值鞍缀桶被岬暮縖13]。體外消化率按照如下的公式計(jì)算：

體外養(yǎng)分消化率=

1.3　仔豬飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)

1.3.1發(fā)酵飼料的制備

玉米、豆粕和麩皮按45%、45%和10%的比例混合均勻，取200 kg的玉米豆粕復(fù)合飼料，按5%比例分別接種芽孢桿菌BS12、糞腸球菌EF和5%的復(fù)合酶制劑，初始濕度控制在40%左右，室溫條件下(30 ℃)好氧發(fā)酵24 h后；隨后裝入?yún)捬醢l(fā)酵袋，室溫條件下厭氧發(fā)酵48 h后烘干粉碎待用。

1.3.2動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

選取192頭體重在(9.35±0.65) kg的49日齡健康仔豬(Duroc×Large white×Yorkshire)，隨機(jī)分配至兩個(gè)處理組，每個(gè)處理6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)16頭。處理組1飼喂玉米豆粕基礎(chǔ)日糧(對(duì)照組)，日糧中添加100 mg/kg喹乙醇和50 mg/kg吉他霉素；處理組2以10%發(fā)酵飼料替代基礎(chǔ)日糧中的玉米和豆粕(發(fā)酵飼料組)，且日糧中不添加抗生素，實(shí)驗(yàn)期為24 d。于實(shí)驗(yàn)期1 d及24 d稱取仔豬初始體重及末重，每日記錄采食量、計(jì)算平均日增重。實(shí)驗(yàn)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表2。

表2　日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平

注：預(yù)混料向每千克飼糧提供：VA 10,000 IU，VD3 1500 IU，VE 50 IU，VK3, 4.4 mg， VB1 3.0 mg，VB2 6.0 mg，VB6 3.0 mg，VB12 0.04 mg，D-泛酸23 mg，煙酸36 mg， 葉酸0.8 mg，生物素0.15 mg，氯化膽堿186 mg；硫酸銅50 mg，硫酸亞鐵80 mg，碘化鉀0.30 mg， 硫酸錳20 mg，亞硒酸鈉0.2 mg，硫酸鋅95 mg。

1.4　指標(biāo)測(cè)定及方法

飼料中抗原蛋白含量的測(cè)定采用龍科方舟試劑盒根據(jù)酶聯(lián)免疫(ELISA)法進(jìn)行測(cè)定；粗蛋白的測(cè)定參照《GB/T 6432—1994》；粗脂肪的測(cè)定參照《GB/T 6433—1994》[14]；；中性洗滌纖維的測(cè)定參照《GB/T 20806—2006》[15]；飼料中鈣的測(cè)定參照《GB/T 6436—2002》[16]；總磷的測(cè)定參照《GB/T 6437—2002》[17]；酸溶蛋白的測(cè)定參照Mahmoudreza等[18]的研究；飼料中乳酸采用羥基聯(lián)苯比色法[19]測(cè)定；飼料pH采用pH計(jì)直接測(cè)定。

1.5　數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用SPSS19.0對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析處理，采用ANOVA進(jìn)行差異顯著性分析，P<0.05表示差異顯著，所有結(jié)果均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2　結(jié)果

2.1　單菌發(fā)酵對(duì)飼料營(yíng)養(yǎng)成分的影響

由表3可知，本實(shí)驗(yàn)中枯草芽孢桿菌對(duì)復(fù)合飼料中的大豆球蛋白和β-伴球蛋白降解程度較強(qiáng)，其中枯草芽孢桿菌BS12的降解能力最高，對(duì)大豆球蛋白降解率為87.40%，β-伴球蛋白為76.60%。除此以外，枯草芽孢桿菌發(fā)酵后，飼料中酸溶蛋白含量高于其他類型的實(shí)驗(yàn)菌株，其中BS12發(fā)酵飼料中酸溶蛋白含量最高，提高了4.8倍。而枯草芽孢桿菌對(duì)飼料中纖維的降解程度也高于其他菌株。其中枯草芽孢桿菌BS12對(duì)中性洗滌纖維的降解率達(dá)到30.20%。相較于枯草芽孢桿菌和酵母菌，三株乳酸菌(糞腸球菌EF、干酪乳桿菌LC和植物乳桿菌LP)的產(chǎn)乳酸能力較強(qiáng)，其中，糞腸球菌EF最強(qiáng)，發(fā)酵48 h后飼料中乳酸含量達(dá)到110.53 mmol/kg。

為了實(shí)現(xiàn)降低飼料抗?fàn)I養(yǎng)因子，提高飼料乳酸含量的效果，本研究采用枯草芽孢桿菌BS12與糞腸球菌EF進(jìn)行混菌發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。

2.2　混菌發(fā)酵

如表4所示，枯草芽孢桿菌BS12的比例提高有利于提高飼料中抗原蛋白的降解率和酸溶蛋白的含量。盡管糞腸球菌EF的含量減小，飼料中乳酸含量差異并不顯著。采用當(dāng)飼料中總菌量達(dá)到1.0×107CFU/g，芽孢桿菌BS12和糞腸球菌比例8∶1時(shí)，進(jìn)行先好氧發(fā)酵24 h，再厭氧發(fā)酵48 h，飼料中大豆球蛋白含量減少至8.31 mg/g，β-伴球蛋白含量降低至6.44 mg/g，酸溶蛋白相較發(fā)酵前提高6.16倍，乳酸含量達(dá)到116.57 mg/g。

表3　不同菌株對(duì)飼料成分的影響

注：同一列不同上標(biāo)字母表示差異顯著(P<0.05)。

表4　混菌發(fā)酵對(duì)飼料成分的影響

注：同一列不同上標(biāo)字母表示差異顯著(P<0.05)。

表5　菌酶協(xié)同發(fā)酵對(duì)飼料成分的影響

注：同一列不同上標(biāo)字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.3　菌酶協(xié)同發(fā)酵對(duì)飼料營(yíng)養(yǎng)成分的影響

由表5可知，添加纖維素酶、甘露糖酶及果膠酶制備的后，發(fā)酵飼料中性洗滌纖維降解程度提高。添加量為0.30%、0.50%、0.70%和1.00%時(shí)，相較于未發(fā)酵飼料，中性洗滌纖維降解率分別為35.41%、39.36%、40.32%和40.61%。但是抗原蛋白降解程度及乳酸含量變化并不顯著。

2.4　菌酶協(xié)同發(fā)酵對(duì)飼料氨基酸消化率的影響

由圖1可見(jiàn)，經(jīng)過(guò)發(fā)酵后，飼料中粗蛋白消化率也得到提高，6種必需氨基酸和5種非必須氨基酸體外消化率得到顯著提高。其中，蛋氨酸、苯丙氨酸分別提高15.15% 和17.60%，丙氨酸，半胱氨酸，色氨酸分別提高了10.11%、10.05%和9.89%，粗蛋白消化率整體提高6.94%。

注：黑色，未發(fā)酵飼料；灰色，發(fā)酵飼料。圖1　菌酶協(xié)同發(fā)酵對(duì)飼料氨基酸體外消化率的影響

2.5　仔豬飼喂效果

由表6可知，相較于添加抗生素的對(duì)照組，飼料中添加10%的發(fā)酵飼料有利于提高采食量和日增重。較于對(duì)照組，發(fā)酵飼料組仔豬料肉比和腹瀉率相差異并不顯著。

表6　菌酶協(xié)同發(fā)酵飼料對(duì)仔豬生產(chǎn)性能影響

注：同一列不同上標(biāo)字母表示差異顯著(P<0.05)。

3　討論

通過(guò)生物發(fā)酵降低飼料中抗?fàn)I養(yǎng)因子的含量，從而提高動(dòng)物對(duì)飼料養(yǎng)分的消化利用率，已成為飼料工業(yè)發(fā)展的重要方向[20-23]。目前研究多為發(fā)酵單一原料，如發(fā)酵豆粕[3]、發(fā)酵菜粕[24]和發(fā)酵DDGS[25]。但是對(duì)于混合原料發(fā)酵的研究并不充分。本研究以玉米、豆粕和麩皮配制成混合原料，采用枯草芽孢桿菌、釀酒酵母、糞腸球菌、干酪乳桿菌、植物乳桿菌進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，通過(guò)比較不同菌株對(duì)飼料中抗原蛋白降解程度、纖維降解程度及發(fā)酵后飼料中乳酸含量的影響，發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌對(duì)飼料原料中蛋白和纖維的降解程度更高，乳酸菌產(chǎn)乳酸能力更強(qiáng)。Chi等[7]也發(fā)現(xiàn)相較于酵母菌和乳酸菌，解淀粉芽孢桿菌對(duì)豆粕蛋白的降解程度更高。這可能是由于芽孢桿菌能分泌大量蛋白酶和纖維素酶，對(duì)大分子蛋白和纖維降解能力較強(qiáng)[26]。乳酸菌雖然可以發(fā)酵產(chǎn)生乳酸，但是在固態(tài)發(fā)酵中對(duì)飼料中抗原蛋白的降解能力不強(qiáng)[27]。

為綜合芽孢桿菌對(duì)豆粕抗原蛋白的降解特性與乳酸菌的產(chǎn)乳酸特性，本研究選取了枯草芽孢桿菌中對(duì)蛋白和纖維降解性較能強(qiáng)的BS12和乳酸菌中產(chǎn)酸能力較強(qiáng)的糞腸球菌EF進(jìn)行混菌發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。但是，枯草芽孢桿菌為好氧細(xì)菌，而糞腸球菌為兼性厭氧細(xì)菌[28]，完全進(jìn)行好氧發(fā)酵或厭氧發(fā)酵會(huì)抑制其中一種菌的生長(zhǎng)。Chen等[9]采用分步發(fā)酵的方法用米曲霉先降低豆粕中的抗原蛋白，再用干酪乳桿菌發(fā)酵提高乳酸含量，降低豆粕pH。曲露等采用先好氧再厭氧的分步發(fā)酵方式，先降低菜籽粕中的硫甙和植酸，并提高粗蛋白及小肽含量，再通過(guò)厭氧發(fā)酵增加有機(jī)酸提高風(fēng)味[29]。本研究采用同步加菌，先好氧發(fā)酵24 h，再厭氧發(fā)酵48 h的工藝。分步發(fā)酵降低了飼料中的抗原蛋白，且抗原蛋白降解程度和BS12單菌發(fā)酵相似，而乳酸含量也與EF單菌發(fā)酵結(jié)果相當(dāng)。這說(shuō)明，分步發(fā)酵工藝同樣適用于玉米-豆粕型復(fù)合飼料的發(fā)酵。

飼料原料中含有大量的植物纖維[30]。其中中性洗滌纖維過(guò)高會(huì)增加食糜黏度，阻礙其在仔豬腸道內(nèi)的正常推進(jìn)，增強(qiáng)飽腹感，降低采食量[31-32]。非淀粉多糖酶有助于分解細(xì)胞壁，釋放營(yíng)養(yǎng)成分，提高干物質(zhì)、有機(jī)物及粗蛋白的消化利用率[33]。本研究采用通過(guò)添加復(fù)合酶對(duì)發(fā)酵飼料進(jìn)一步優(yōu)化[34]。結(jié)果顯示，發(fā)酵過(guò)程添加非淀粉多糖復(fù)合酶(纖維素酶、甘露糖酶和果膠酶)，進(jìn)一步降低了飼料中的中性洗滌纖維含量[35]。發(fā)酵后，粗蛋白、蛋氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸，半胱氨酸和色氨酸的體外消化率提高明顯。其中，蛋氨酸、丙苯氨酸和色氨酸是豬日糧中的必需氨基酸，而半胱氨酸是半必需氨基酸[36]。倪良振等研究發(fā)現(xiàn)，在含5.8%酸性洗滌纖維的日糧中添加纖維素酶極顯著提高煙臺(tái)黑豬對(duì)蛋氨酸、纈氨酸、異亮氨酸和苯丙氨酸的回腸表觀消化率[37]。因此，采用非淀粉多糖酶和枯草芽孢桿菌、糞腸球菌協(xié)同發(fā)酵降解飼料中的大分子蛋白和纖維，產(chǎn)生小分子肽和游離氨基酸，更有利于仔豬對(duì)氨基酸的消化利用[38]。

仔豬飼喂實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明，相較于添加了抗生素的對(duì)照組，采用10%的菌酶協(xié)同發(fā)酵復(fù)合飼料有利于提高仔豬生長(zhǎng)性能，且料肉比和腹瀉率并未發(fā)生顯著變化。

4　結(jié)論

本研究通過(guò)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)篩選了1株高效降解豆粕抗原蛋白的枯草芽孢桿菌BS12和1株產(chǎn)乳酸能力較強(qiáng)的糞腸球菌EF，用于玉米豆粕型復(fù)合飼料的發(fā)酵。結(jié)果顯示，將BS12與EF按總菌量1.0×107CFU/g， 菌量比8∶1接種于復(fù)合飼料，同時(shí)接入5% 的復(fù)合酶，發(fā)酵72 h，可降解飼料中80%的大豆抗原蛋白，且乳酸含量達(dá)到122.18 mmol/kg。所得發(fā)酵復(fù)合飼料提高了仔豬采食量和日增重，有利于提高仔豬生長(zhǎng)性能，減少飼用抗生素使用。

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