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    丁達爾效應(yīng)定位偽狂犬病病毒密度梯度離心區(qū)帶

    2018-04-09 02:06:22齊安生宮楓舉凌紅麗張興進邵衛(wèi)星孫學(xué)強
    中國動物檢疫 2018年4期
    關(guān)鍵詞:丁達爾區(qū)帶密度梯度

    齊安生,宮楓舉,劉 爽,凌紅麗,張興進,邵衛(wèi)星,,孫學(xué)強,

    (1. 黑龍江省動物衛(wèi)生監(jiān)督所,黑龍江哈爾濱 150069;2. 青島立見診斷技術(shù)發(fā)展中心,山東青島 266114;3. 中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心,山東青島 266032;4. 青島蔚藍(lán)生物制品有限公司,山東青島 266114)

    英國物理學(xué)家John Tyndall在1869年發(fā)現(xiàn)當(dāng)一束光線透過膠體時,從入射光的垂直方向可以觀察到膠體里出現(xiàn)一條光亮“通路”。這條光亮“通路”是由于介質(zhì)中粒子對光線散射形成的。這種現(xiàn)象被稱為丁達爾現(xiàn)象,也稱為丁達爾效應(yīng)(Tyndall effect)[1]。

    偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)學(xué)名豬皰疹病毒1型(Suid herpesvirus 1),屬皰疹病毒甲亞科。豬為PRV的原始宿主,并作為貯主,可感染其它動物,如馬、牛、綿羊、山羊、犬、貓,以及多種野生動物。人類對其有抗性。PRV顆粒直徑約150 nm,內(nèi)含直徑為100 nm的20面體核衣殼,由162個中空的殼粒組成,包括150個六鄰體及12個五鄰體。核衣殼之內(nèi)為線狀卷軸樣基因組,核外殼之外則是脂蛋白囊膜及許多糖蛋白的小纖突。因囊膜的差異,病毒顆粒直徑范圍為120~200 nm,其基因組為雙鏈DNA,G+C含量高達73%。PRV在CsCl中的浮密度為1.731,在蔗糖中的浮密度為1.27~1.29,沉降系數(shù)為1 000~1 100 s[2]。

    本實驗用蔗糖密度梯度離心方法,離心PRV細(xì)胞培養(yǎng)上清;在離心結(jié)束后通過光束對離心區(qū)帶產(chǎn)生的丁達爾效應(yīng)進行精確分層取樣,得到高純度的病毒,以滿足下游病毒學(xué)和免疫學(xué)研究需要。

    1 材料和方法

    1.1 病毒樣品、試劑和儀器

    偽狂犬病病毒Barth-K61細(xì)胞培養(yǎng)上清:青島蔚藍(lán)生物制品有限公司提供;蔗糖、PEG20000:國藥產(chǎn)品;截留量為100 KD的透析袋:購自北京索萊寶科技有限公司;超速離心機:日本日立公司CP100WX;超速離心管:規(guī)格為15 mm×96 mm,容積為13 mL;水平轉(zhuǎn)子:型號為P40ST;透射電鏡:JEM-1200EX。

    1.2 病毒液的濃縮和透析

    取60 mL病毒細(xì)胞培養(yǎng)上清,經(jīng)0.22 μm濾膜過濾;將濾液置透析袋中,用100 mmol/L pH7.2的PBS 4 ℃透析過夜,然后用PEG20000固體包埋透析袋后進行濃縮。濃縮后體積約為1 mL。

    1.3 不連續(xù)蔗糖密度梯度的配制

    以PBS配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%、30%、35%、40%、50%、60%的蔗糖密度梯度溶液;將其經(jīng)0.22 μm濾器過濾后,按濃度由高到低依次加入超速離心管中。加入梯度蔗糖溶液時,可將離心管適度傾斜,沿著管壁緩慢加入,務(wù)求界面分明??傮w積約為12 mL。

    1.4 離心和區(qū)帶取樣

    在密度梯度蔗糖界面上鋪入1 mL病毒濃縮液,約為離心管體積的5%,確保離心管上部有較少空隙;距管口約2~3 mm時將鋪入樣品的離心管放入管套中,于精密天平稱量并配平,然后將管套的螺紋蓋擰緊后懸掛于水平轉(zhuǎn)子P40ST上;在20 ℃條件下30 000 r/min離心4 h;離心結(jié)束后取出離心管,平穩(wěn)置于試管架,用光束從管口垂直照射,標(biāo)記光路上呈現(xiàn)丁達爾效應(yīng)的離心區(qū)帶,逐層吸取出現(xiàn)通路的離心區(qū)帶至不同離心管,即區(qū)帶樣品。

    1.5 區(qū)帶樣品的透析、濃縮和電鏡觀察

    將約3 mL每個區(qū)帶樣品分別裝入透析袋,于PBS中4 ℃透析過夜,用PEG20000固體包埋濃縮至1 mL。取適量濃縮液,滴至銅網(wǎng),室溫靜置10 min,用濾紙吸干多余樣品,滴加20 g/L磷鎢酸負(fù)染5 min,晾干后透射電鏡觀察。

    2 結(jié)果

    2.1 離心區(qū)帶觀察

    蔗糖密度梯度離心完成后,在自然光下直接觀察,未見離心區(qū)帶。用光束垂直照射離心管內(nèi)液體,在與光路垂直的角度上觀察,發(fā)現(xiàn)離心管內(nèi)出現(xiàn)4個散射光斑,可觀察到PRV細(xì)胞培養(yǎng)上清樣品在不連續(xù)蔗糖密度梯度溶液中共出現(xiàn)4條離心區(qū)帶,自上而下依次編號為區(qū)帶1、2、3和4(圖1)。經(jīng)比對分析,區(qū)帶1位于樣品層和20%蔗糖之間,區(qū)帶2位于30%~35%蔗糖濃度之間,區(qū)帶3位于35%~40%之間,區(qū)帶4位于40%~50%之間。

    圖1 密度梯度離心區(qū)帶的丁達爾效應(yīng)

    2.2 區(qū)帶樣品電鏡觀察

    區(qū)帶樣品經(jīng)過處理后,透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn),區(qū)帶1和2中未見病毒粒子形態(tài)的顆粒,僅存在小分子量雜蛋白、細(xì)胞膜碎片和結(jié)晶物(圖2-A、圖2-B);區(qū)帶4中存在大量顆粒,直徑約150~180 nm,但無明顯的PRV病毒粒子形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)(圖2-D);區(qū)帶3中病毒顆粒呈球形,直徑為120~150 nm,其中心是電子密度較高的核衣殼,外圍是電子密度較低的囊膜,囊膜表面有呈放射狀排列的纖突(圖2-C),符合典型的PRV病毒粒子形態(tài)學(xué)特征。

    圖2 密度梯度離心區(qū)帶樣品透射電鏡圖片

    3 討論

    病毒提純是應(yīng)用各種物理和化學(xué)方法,以不使病毒受損和失活為前提,去除宿主細(xì)胞組分等非病毒物質(zhì),提取出高純度濃縮的病毒樣品。病毒提純是病毒學(xué)研究的重要前提,病毒微細(xì)形態(tài)結(jié)構(gòu)的研究、病毒抗原蛋白的分離提純、病毒化學(xué)組分及其遺傳物質(zhì)—DNA或RNA的詳細(xì)研究都需要高純度的病毒樣品[3]。病毒提純方法包括沉淀法、層析法、紅細(xì)胞吸附法、電泳法、超速離心法和超濾法等。每種方法因原理不同,從而對病毒的天然形態(tài)、活性和提取純度都有不同影響。病毒提純方法的選擇,應(yīng)根據(jù)病毒樣品的來源特點、病毒粒子特性(如是否有血凝活性和囊膜、浮密度大小等)、純度要求和下游實驗要求,選擇一種或幾種方法結(jié)合進行。

    超速離心法是病毒提純常用方法之一。其主要原理是在強大的離心力作用下,不同大小的病毒粒子在介質(zhì)中的沉降速度不同,從而達到提純的目的。主要包括3種方法:差速離心法、速度區(qū)帶離心法、等密度梯度離心法。速度區(qū)帶離心法又可根據(jù)所使用的蔗糖、甘油和CsCl等介質(zhì)密度的差異,分為連續(xù)密度梯度和不連續(xù)密度梯度[3]。超離心技術(shù)也是分離純化生物大分子及亞細(xì)胞成份的最有用技術(shù)之一,而密度梯度離心法則是其中較為復(fù)雜的一種方法。它可以同時使樣品中幾個或全部組份分離,具有很好的分辨力[4]。密度梯度離心技術(shù)的發(fā)展,為進一步分離純化亞細(xì)胞組分、染色體、病毒、RNA、DNA及其它生物大分子提供了有效方法,已成為細(xì)胞生物學(xué)、超微結(jié)構(gòu)、分子生物學(xué)、免疫學(xué)、生物工程學(xué)等實驗研究的得力手段[5]。

    在密度梯度離心過程中,不同大小顆粒的病毒和蛋白在強大離心力作用下,沉降到與介質(zhì)密度相等的區(qū)域后就不再沉降,不同分子形成不同區(qū)帶,稱為速度區(qū)帶。在理論上,密度較小的粒子或成分停留在上面幾層,密度較大的停留在下面幾層,因而利用該法可以獲得相當(dāng)純凈的病毒樣品。離心操作結(jié)束后,在普通自然光下,依據(jù)樣品中蛋白濃度不同,通過肉眼直接觀察的主觀性較強,蛋白濃度高時可見速度區(qū)帶,較低時不可見;部分型號離心機標(biāo)配的離心管,為了滿足強大離心力的要求,管壁較厚,透光性差,在自然光下通過肉眼觀察蛋白區(qū)帶難度更大。因此,在離心結(jié)束后,分層取樣操作難度較大,常因操作的主觀差異使本來已經(jīng)離心分層的離心區(qū)帶,在收集時又被混合,使病毒純度不夠,甚至導(dǎo)致試驗失敗,造成珍貴生物材料、實驗儀器設(shè)備的巨大浪費。

    丁達爾效應(yīng)是一種光學(xué)物理現(xiàn)象。英國物理學(xué)家約翰·丁達爾(John Tyndall)在1869年首先研究發(fā)現(xiàn)光在粒子大小不同的介質(zhì)中傳播,當(dāng)介質(zhì)中的粒子小于入射光波長(400~700 nm),則發(fā)生光散射,可觀察到光波環(huán)繞粒子而向其四周放射。這種散射現(xiàn)象稱為丁達爾效應(yīng)。當(dāng)介質(zhì)中粒子大于入射光波長很多倍,則發(fā)生光的反射;當(dāng)粒子比入射光波長越小,則光的散射效果越弱。由于溶液粒子直徑一般不超過1 nm,膠體中的粒子大小介于溶液中溶質(zhì)粒子和濁液粒子之間,小于可見光波長(400~700 nm)。鑒于膠體能有丁達爾現(xiàn)象,而溶液幾乎沒有,所以可以采用丁達爾現(xiàn)象來區(qū)分膠體和溶液[1]。

    密度梯度離心法一般用不同濃度的蔗糖、甘油或者CsCl,制備連續(xù)密度梯度或不連續(xù)密度梯度介質(zhì),用于分離大小不同的病毒和蛋白等。光束在粒子大小均一的溶液介質(zhì)中直線傳播。由于溶液粒子直徑遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于入射光波長,散射光強度因粒子體積相對較小而較弱,幾乎不出現(xiàn)丁達爾效應(yīng)。當(dāng)病毒樣品在離心力作用下,在密度梯度的蔗糖中形成不同的離心區(qū)帶,不同區(qū)帶之間以蔗糖等介質(zhì)相隔,形成了“溶液1”-“區(qū)帶1”-“溶液2”-“區(qū)帶2”的多層結(jié)構(gòu)。雖然每個溶液層濃度不同,但均不產(chǎn)生丁達爾效應(yīng);每個區(qū)帶層中分別是浮密度相同、粒子大小相近的病毒或者蛋白等,而且一般情況下其粒子均小于入射光波長,能夠產(chǎn)生丁達爾效應(yīng)。因此,當(dāng)以光束垂直照射離心管內(nèi)容物表面時,在光路的垂直方向上用肉眼可以觀察到明顯的“斷路-通路-斷路-通路”現(xiàn)象。每1個“通路”代表1個離心區(qū)帶。

    病毒及亞單位的培養(yǎng)和提純對疫苗、診斷試劑研究開發(fā)具有重要意義,但大多數(shù)研究都屬于工藝性研究,具有一定的商業(yè)價值,所以相關(guān)研究報道較少[6-7]。在使用密度梯度離心法的研究報告中,尚未發(fā)現(xiàn)關(guān)于密度梯度離心區(qū)帶定位的詳細(xì)報道[8]。在本試驗中離心用病毒樣品濃度也較低,而且離心機配套使用的超速離心管管壁較厚,普通自然光下難以形成肉眼可見區(qū)帶;利用垂直光束在離心管內(nèi)容物的多層介質(zhì)中形成的丁達爾效應(yīng),精確對各離心區(qū)帶進行取樣,對各層樣品進行電鏡觀察發(fā)現(xiàn),區(qū)帶3為病毒層,病毒主要集中在35%~40%界面處,符合PRV的形態(tài)學(xué)特征,經(jīng)分子生物學(xué)和免疫學(xué)鑒定為PRV,提取的病毒純度達到了下游免疫學(xué)試驗研究的需要(相關(guān)試驗數(shù)據(jù)另文發(fā)表)。

    密度梯度離心技術(shù)是經(jīng)典的病毒純化方法。殷震等[3]主編的經(jīng)典著作《動物病毒學(xué)》(第2版)中關(guān)于超速離心提純病毒的目的意義、方法、原理、步驟和注意事項進行了詳細(xì)闡述,尤其是“密度梯度操作法的操作程序——梯度的分段收集(取樣)”中列舉了4種方法進行離心后取樣,對試驗操作人員的經(jīng)驗和技術(shù)要求較高。本研究將光學(xué)物理現(xiàn)象應(yīng)用于病毒的經(jīng)典病毒純化方法,對完善提高密度梯度離心法進行了有益探索,大大提高了經(jīng)典病毒純化技術(shù)手段的成功率,對試驗操作具有重要指導(dǎo)意義。

    參考文獻:

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    [2] 陸承平. 獸醫(yī)微生物學(xué)[M]. 5版. 北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2013:555.

    [3] 殷震,劉景華. 動物病毒學(xué)[M]. 2版. 北京:科學(xué)出版社,1997:1226.

    [4] 楊蘇. 密度梯度離心技術(shù)的探討[J]. 寧德師專學(xué)報(自然科學(xué)版),1998(4):59-61.

    [5] 趙鳳章. 密度梯度離心技術(shù)[J]. 白求恩醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,1987(3):264-267.

    [6] 李少麗,田朋飛,彭大新,等. 豬瘟病毒E2蛋白的高效表達及純化[J]. 黑龍江畜牧獸醫(yī),2017(14):133-135.

    [7] 田書苗,郅玉寶,王林建,等. 豬繁殖與呼吸綜合征病毒純化方法的建立[J]. 中國獸醫(yī)科學(xué),2016(5):568-572.

    [8] 王大偉,李學(xué)伍,王麗,等. 豬偽狂犬病毒的增殖、純化和鑒定[J]. 河南農(nóng)業(yè)科學(xué),2010(11):125-127.

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