非小細(xì)胞肺癌病人源性NOD/SCID 小鼠和BALB/c裸鼠移植瘤模型的建立及比較

吳健彬 江 　妹 王 　玥許 　晶岳文濤3* 王子彤*

（1．首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院/北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所胸外科，北京 　101149；2．首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院/北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所細(xì)胞生物學(xué)研究室，北京 　101149；3．首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，北京 　100026）

世界腫瘤流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)資料[1]和中國癌癥中心公布的數(shù)據(jù)[2]顯示，肺癌高居世界和中國惡性腫瘤發(fā)病率與死亡率首位。針對肺癌發(fā)病與轉(zhuǎn)移機(jī)制，目前雖已研究設(shè)計(jì)出大量診斷和治療的相關(guān)策略，且在新藥開發(fā)中取得了顯著的進(jìn)展，但為避免大多數(shù)新藥由于缺乏臨床療效而遭受巨大經(jīng)濟(jì)損失以及影響癌癥患者的生活質(zhì)量[3]，以及在精準(zhǔn)醫(yī)療個(gè)體化用藥的背景下，建立優(yōu)良的動(dòng)物模型是研究的關(guān)鍵。目前研究者發(fā)現(xiàn)病人源性移植瘤(patient-derived tumor xenograft，PDTX)模型是唯一擁有直接來自患者的真正腫瘤靶標(biāo)的模型[3]，該模型能穩(wěn)定地保持原代腫瘤中的病理特征、腫瘤微環(huán)境和異質(zhì)性，準(zhǔn)確反映腫瘤的特點(diǎn)和干預(yù)措施的影響[4-5]，因此是一種合理、真實(shí)有效和可行的模型，能為臨床個(gè)體化治療等提供研究基礎(chǔ)。目前研究顯示，PDTX移植瘤皮下模型的F1代成瘤率在20%～60%[6-9]， F2～F5代的成瘤率在75%[4]以上，由此可見，決定皮下移植瘤模型能否成功的關(guān)鍵在于F1代。NOD/SCID小鼠和BALB/c裸鼠均有報(bào)道用于PDTX移植瘤模型中，本研究旨在使用NOD/SCID小鼠和BALB/c裸鼠分別建立肺癌的PDTX模型，比較NOD/SCID小鼠和BALB/c裸鼠肺癌PDTX模型的成瘤率、成瘤潛伏時(shí)間和生長曲線以及病理特征的一致性，探討兩種不同小鼠移植瘤模型的特點(diǎn)，為后續(xù)建立更優(yōu)良的動(dòng)物模型奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1　實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

NOD/SCID小鼠(36只)和BALB/c裸鼠(10只)購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[動(dòng)物許可證號SCXK(京)2016-0011]，均為6～8周齡的雌鼠。NOD/SCID小鼠體質(zhì)量20～23 g，BALB/c裸鼠體質(zhì)量15～18 g，所有NOD/SCID小鼠和BALB/c裸鼠均飼養(yǎng)于屏障環(huán)境下，級別為無特定病原體(specific pathogen free，SPF)級，首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院/北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所屏障環(huán)境實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房[許可證號SYXK(京)2015-0007]。小鼠飼料為清潔級維持鼠料[北京科澳協(xié)力飼料有限公司，許可證號SCXK(京)2014-0010]，小鼠飲水由實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飲水機(jī)提供(北京木牛流馬凈化工程技術(shù)有限公司，MN-LM50J)，小鼠所用墊料及其他與動(dòng)物接觸的物品均經(jīng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物專用型滅菌器(Siemens smart line)在121 ℃、30 min條件下高壓滅菌處理。

1.2　非小細(xì)胞肺癌組織標(biāo)本

非小細(xì)胞肺癌組織標(biāo)本來源于首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院胸外科2016年7月—2016年12月經(jīng)肺癌手術(shù)切除的23例患者，納入標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)前未經(jīng)過化療或放療等相關(guān)非小細(xì)胞肺癌治療；②術(shù)中冰凍病理結(jié)果提示為非小細(xì)胞肺癌且最終病理結(jié)果為非小細(xì)胞肺癌；③能提供足夠大小且質(zhì)地較好的新鮮組織標(biāo)本。排除標(biāo)準(zhǔn)：①5年內(nèi)有其他腫瘤病史；②合并活動(dòng)性肺結(jié)核等傳染性疾病；③術(shù)前已進(jìn)行肺癌相關(guān)治療。

1.3　肺癌病人源性皮下移植瘤小鼠模型的建立

選取首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院外科手術(shù)切除的非小細(xì)胞肺癌新鮮無菌組織標(biāo)本，離體時(shí)間≤30 min。組織標(biāo)本保存在含有100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素及20%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)的RPMI-1640無菌培養(yǎng)基中，泡沫盒中冰浴，于1 h內(nèi)接種于NOD/SCID小鼠或BALB/c裸鼠皮下。腫瘤組織在動(dòng)物房屏障區(qū)內(nèi)進(jìn)行移植，將腫瘤組織轉(zhuǎn)移到無菌培養(yǎng)皿上，剔除瘤塊上的非腫瘤組織和壞死部分，用含20% FBS的RPMI-1640無菌培養(yǎng)基清洗3次，把腫瘤組織剪切成2 mm×2 mm×2 mm的小塊，通過套管針經(jīng)皮接種至小鼠雙側(cè)腋下，每例標(biāo)本接種2只小鼠，共4個(gè)部位，接種完成后消毒傷口。將完成接種的小鼠放回小鼠籠具中，在籠外標(biāo)注小鼠編號、日期等信息。最后將小鼠籠具放回籠架內(nèi)。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程均在無菌條件下進(jìn)行。

1.4　觀察和測算

定時(shí)觀察荷瘤小鼠活動(dòng)情況、精神狀態(tài)、皮毛光澤度和移植瘤組織接種部位皮膚改變等情況。捫查移植瘤生長情況，移植瘤移植后雙側(cè)皮下包塊會(huì)先縮小，以包塊消失或縮小至小點(diǎn)后，再次以肉眼可見腫瘤或捫及腫瘤，且當(dāng)移植瘤體的長短徑＞3 mm時(shí)，記錄為腫瘤出現(xiàn)時(shí)間。從接種移植瘤組織塊開始到腫瘤出現(xiàn)時(shí)間，記為成瘤潛伏時(shí)間。每例標(biāo)本移植于至少2只NOD/SCID小鼠或至少2只BALB/c裸鼠皮下，雙側(cè)腋下均接種移植瘤，移植瘤出現(xiàn)后開始用游標(biāo)卡尺測量移植瘤體的長徑(rL) 、短徑(rw) ，每周2次，腫瘤體積使用如下公式計(jì)算：腫瘤體積V=(×r)/2。移植瘤塊L在4個(gè)月內(nèi)形成瘤塊體積＞1 cm3，提示該移植瘤模型成功，根據(jù)測量所得數(shù)據(jù)，計(jì)算移植瘤體積并繪制生長曲線圖。若觀察4個(gè)月后，小鼠瘤塊仍未生長，或米粒狀消失，則提示該移植瘤建模失敗。分別計(jì)算NOD/SCID小鼠和BALB/c裸鼠的成瘤率，進(jìn)行比較分析。

1.5　病理學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)束，處死小鼠，分離移植瘤，肉眼觀察移植瘤形態(tài)、質(zhì)地、活動(dòng)度，觀察肺、肝、脾和腎臟以及淋巴結(jié)是否存在轉(zhuǎn)移情況，經(jīng)分離得到移植瘤后，將取出的移植瘤組織以10%中性福爾馬林固定液固定，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片后常規(guī)HE染色，進(jìn)行病理學(xué)檢查分析。

1.6　統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以中位數(shù)、均數(shù)或百分率表示，采用Fisher精確概率法比較NOD/SCID小鼠組和BALB/c裸鼠組成瘤率差異是否存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，采用t檢驗(yàn)比較NOD/SCID小鼠組和BALB/c裸鼠組成瘤潛伏時(shí)間和成瘤時(shí)間的差異是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2　結(jié)　果

2.1　NOD/SCID小鼠和BALB/c裸鼠移植瘤組織標(biāo)本相關(guān)臨床病理指標(biāo)

外科切除的非小細(xì)胞肺癌組織標(biāo)本共23例，且均符合實(shí)驗(yàn)納入標(biāo)準(zhǔn)。23例組織標(biāo)本中，18例組織標(biāo)本移植于NOD/SCID小鼠，其中男13例、女5例；鱗癌8例、腺癌9例、腺鱗癌1例；Ⅰ期9例、Ⅱ期1例、Ⅲ期8例，病例中位數(shù)年齡61歲。共5例組織標(biāo)本移植于BALB/c裸鼠，其中男4例、女1例；鱗癌4例、腺癌1例；Ⅰ期1例、Ⅱ期2例、Ⅲ期2例，病例中位數(shù)年齡55歲。對非小細(xì)胞肺癌患者臨床特征(年齡、性別、吸煙、病理類型、TNM分期及其T分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況)與NOD/SCID小鼠皮下移植模型是否成瘤進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，如表1，結(jié)果顯示：鱗癌、TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況這3個(gè)因素與移植瘤成瘤建模成功率無明顯相關(guān)。

表1　NSCLC患者臨床特征與NOD/SCID小鼠移植瘤模型成瘤率的關(guān)系

2.2　NOD/SCID小鼠和BALB/c裸鼠生長情況

23例外科切除的組織標(biāo)本共移植46只小鼠，其中18例移植于36只NOD/SCID小鼠中；5例移植于10只BALB/c裸鼠中。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中36只NOD/SCID小鼠和10只BALB/c裸鼠進(jìn)食、飲水正常，無腹瀉、活動(dòng)遲緩等不良反應(yīng)。無一荷瘤NOD/SCID小鼠和BALB/c裸鼠自然死亡。

2.3　NOD/SCID小鼠模型成瘤情況

18例36只NOD/SCID小鼠共計(jì)接種72個(gè)部位，其中有10例移植瘤塊在4個(gè)月內(nèi)體積達(dá)1～1.5 cm3，提示移植瘤成功，NOD/SCID小鼠移植瘤成瘤率為55.6%(10/18)。NOD/SCID小鼠在接種平均37 d后可再次捫及長短徑3～5 mm大小移植瘤，成瘤潛伏時(shí)間平均為37 d；在接種后平均79 d移植瘤瘤塊體積可達(dá)1～1.5 cm3，提示移植瘤建模成功，成瘤時(shí)間平均為79 d。生長曲線見圖1。

2.4　NOD/SCID小鼠模型移植瘤大體和形態(tài)學(xué)觀察

圖1　NOD/SCID小鼠移植瘤生長曲線

成瘤NOD/SCID小鼠解剖后可見實(shí)性結(jié)節(jié)，呈不規(guī)則球體狀或蠶豆?fàn)睿砻姹桓踩庋劭梢婖r紅色小血管紋理，切開后可見魚肉樣瘤體，質(zhì)地較硬，個(gè)別瘤體切開內(nèi)部為乳白色，質(zhì)地脆。所有NOD/SCID小鼠均未發(fā)現(xiàn)肺、脾和腎等主要臟器有轉(zhuǎn)移情況。成功成瘤的10例NOD/SCID小鼠移植瘤中，有6例為鱗癌，3例為腺癌，1例為腺鱗癌，NOD/SCID小鼠移植瘤病理學(xué)診斷與臨床手術(shù)組織標(biāo)本的病理診斷結(jié)果一致，見圖2。其中，S004(腺癌)模型(圖2)組織學(xué)HE染色后，在光鏡下可清晰觀察到支氣管結(jié)構(gòu)，這表明NOD/SCID小鼠皮下移植瘤模型能高度保持病人肺癌腫瘤組織的形態(tài)特征。

圖2　NOD/SCID小鼠模型移植瘤大體和形態(tài)學(xué)觀察

2.5　BALB/c裸鼠模型成瘤情況

5例10只BALB/c裸鼠共計(jì)接種20個(gè)部位，其中有1例移植瘤塊在4個(gè)月內(nèi)體積達(dá)1～1.5 cm3，提示移植瘤成功，BALB/c裸鼠移植瘤成瘤率為20%(1/5)。BALB/c裸鼠在接種平均60 d后可肉眼觀察到長短徑3～5 mm大小移植瘤，接種后平均110 d移植瘤瘤塊體積可達(dá)1～1.5 cm3，提示移植瘤建模成功。生長曲線見圖3。

2.6　BALB/c裸鼠模型移植瘤大體和形態(tài)學(xué)觀察

成瘤BALB/c裸鼠解剖后可見實(shí)性結(jié)節(jié)，呈橢球體狀，表面被覆肉眼可見鮮紅色小血管紋理，切開后可見魚肉樣瘤體，質(zhì)地較硬。未發(fā)現(xiàn)肺、脾和腎等主要臟器有轉(zhuǎn)移情況。成瘤的BALB/c裸鼠模型病理學(xué)診斷為鱗癌，與臨床手術(shù)組織標(biāo)本的病理診斷結(jié)果一致，表明BALB/c裸鼠皮下移植瘤模型能保持病人肺癌腫瘤組織的形態(tài)特征。

圖3　BALB/c裸鼠移植瘤生長曲線

圖4　BALB/c裸鼠模型移植瘤大體和形態(tài)學(xué)觀察

2.7　NOD/SCID小鼠和BALB/c裸鼠模型成瘤情況的比較分析

從NOD/SCID小鼠和BALB/c裸鼠模型的成瘤率、成瘤潛伏時(shí)間和成瘤時(shí)間3個(gè)因素進(jìn)行比較分析，如表2所示，NOD/SCID小鼠皮下移植瘤模型成瘤率(55.6%)，BALB/c裸鼠皮下移植瘤模型成瘤率為(20%)(P=0.185)；在成瘤潛伏時(shí)間上，NOD/SCID小鼠平均為37 d，低于BALB/c裸鼠的平均60 d，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.002)，可得出BALB/c裸鼠的成瘤潛伏時(shí)間較長；在成瘤時(shí)間上，NOD/SCID小鼠接種后平均79 d成瘤，低于BALB/c裸鼠在接種后平均110 d的成瘤時(shí)間，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.004)，可得出BALB/c裸鼠的成瘤時(shí)間較長。

表2　NOD/SCID小鼠和BALB/c裸鼠移植瘤模型成瘤因素分析

3　討論

2008—2017年10年間NCCN非小細(xì)胞肺癌指南[10]更新中可以看出，非小細(xì)胞肺癌靶向藥物治療在非小細(xì)胞肺癌推薦一線治療中地位日趨穩(wěn)固。PDTX模型是唯一擁有直接來自患者的真正腫瘤靶標(biāo)的模型[3]，能穩(wěn)定地保留原代腫瘤中的生物學(xué)特性[4-5]，2008年Fichtner等[6]將102例肺癌標(biāo)本移植入NOD/SCID小鼠皮下，并傳代移植至裸鼠，成瘤率為25%(25/102)，早期代數(shù)移植瘤裸鼠與原臨床腫瘤樣本組織學(xué)、免疫組化和基因突變狀態(tài)具有高度相似性。2014年Ilie等[11]將100例非小細(xì)胞肺癌新鮮組織標(biāo)本移植入CD1裸鼠或SCID小鼠皮下，成瘤率為35%(35/100)，在組織學(xué)和免疫組織化學(xué)水平和基因水平均保持了高度一致性，基因水平比較包含高通量測序(next-generation sequencing，NGS)和比較基因組雜交分析(comparative genomic hybridization，CGH)。2017年Wang等[12]將441例肺癌組織標(biāo)本移植入NOD/SCID小鼠皮下，成瘤率為29% (127/441)，在全基因組測序、單核苷酸多態(tài)性、甲基化陣列和磷酸酪氨酸-質(zhì)譜蛋白質(zhì)組學(xué)分析中具有高度一致性。以上研究均明確指出成瘤小鼠組織能穩(wěn)定保留相應(yīng)患者的突變靶點(diǎn)，這為新藥的研發(fā)和試驗(yàn)提供了可能。

本實(shí)驗(yàn)NOD/SCID小鼠皮下移植瘤模型成瘤率為55.6%，BALB/c裸鼠皮下移植瘤模型成瘤率為20%，與文獻(xiàn)報(bào)道成瘤率在20%～60%之間[6-9]基本一致，John等[7]將157例肺癌組織標(biāo)本移植入NOD/SCID小鼠皮下，成瘤率為40%(63/157)。羅朋[8]用21例肺鱗癌組織行裸鼠皮下移植，成瘤率為57%(12/21)。本研究從NOD/SCID小鼠和BALB/c裸鼠模型的成瘤率、成瘤潛伏時(shí)間和成瘤時(shí)間3個(gè)因素進(jìn)行比較分析，如表2所示，可得出NOD/SCID小鼠皮下移植瘤模型成瘤率55.6%，BALB/c裸鼠皮下移植瘤模型成瘤率為20%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.185)，這可能與納入的樣本量較小有關(guān)。但在成瘤潛伏時(shí)間上，NOD/SCID小鼠平均短于BALB/c裸鼠。另外，在成瘤時(shí)間上，NOD/SCID小鼠亦短于BALB/c裸鼠。這說明NOD/SCID小鼠比BALB/c裸鼠更適用于非小細(xì)胞肺癌皮下移植瘤模型的建立。

成功建模的NOD/SCID小鼠和BALB/c裸鼠移植瘤大體形狀和形態(tài)學(xué)觀察如圖2和圖4所示，NOD/SCID小鼠和BALB/c裸鼠移植瘤組織標(biāo)本與臨床手術(shù)組織標(biāo)本的病理診斷結(jié)果一致，表明NOD/SCID小鼠和BALB/c裸鼠皮下移植瘤模型均能保持病人肺癌腫瘤組織的形態(tài)特征，特別是圖2中的S004(腺癌)模型組織學(xué)HE染色后，在光鏡下可清晰觀察到支氣管結(jié)構(gòu)，在皮下模型中見到支氣管結(jié)構(gòu)，這更加充分說明了NOD/SCID小鼠皮下移植瘤模型能高度保真病人肺癌腫瘤組織的特性。

在成瘤率、成瘤潛伏時(shí)間和成瘤時(shí)間3個(gè)方面存在較為明顯的差異可能是因?yàn)镹OD/SCID小鼠屬于T、B、NK細(xì)胞聯(lián)合免疫缺陷動(dòng)物，同時(shí)還具有循環(huán)補(bǔ)體缺乏、巨噬細(xì)胞和抗原提呈細(xì)胞分化及功能不良的特性，而且滲漏現(xiàn)象少，更容易接受異體移植；而BALB/c裸鼠僅為單一T淋巴細(xì)胞功能缺陷，B淋巴細(xì)胞功能大致正常，NK細(xì)胞活性與鼠齡有關(guān)，3～4周齡比同齡普通小鼠活性低，而6～8周齡則比同齡普通小鼠活性高[13]，BALB/c裸鼠體內(nèi)存在的B細(xì)胞和NK細(xì)胞發(fā)揮了一定的篩選作用，會(huì)導(dǎo)致BALB/c裸鼠對腫瘤的非特異性免疫力增強(qiáng)，使得成瘤率較低，成瘤潛伏時(shí)間和成瘤時(shí)間較長，進(jìn)而影響非小細(xì)胞肺癌腫瘤皮下移植瘤模型的建立。

NOD/SCID小鼠和BALB/c裸鼠用于非小細(xì)胞肺癌腫瘤皮下移植瘤模型的建立，NOD/SCID小鼠移植瘤模型具有較高的F1代成瘤率(55.6%)，較短的成瘤潛伏時(shí)間(37 d)和成瘤時(shí)間(79 d)，病理特征均呈基本一致，提示本研究建立的NOD/SCID小鼠皮下移植瘤模型更適合用于病人源性皮下移植瘤模型的建立，這為后續(xù)建立更優(yōu)良的動(dòng)物模型和采用非小細(xì)胞肺癌移植瘤模型進(jìn)行體外抗腫瘤藥物實(shí)驗(yàn)的篩選等研究奠定了基礎(chǔ)。

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