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    DNA糖基化酶1對幽門螺桿菌致胃上皮細(xì)胞DNA損傷的保護(hù)作用

    2018-04-09 07:21:10鄧小飛
    癌變·畸變·突變 2018年2期
    關(guān)鍵詞:堿基活力試劑盒

    王  媛,鄧小飛*

    (1. 安順市人民醫(yī)院消化內(nèi)科,貴州 安順 561000;2. 第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院急診科,重慶  400037)

    幽門螺桿菌(Helicobacter pylori,HP)感染是慢性胃炎、胃潰瘍、甚至胃癌的關(guān)鍵危險(xiǎn)因素[1]。炎癥、活性氧(reactive oxygen species,ROS)及DNA損傷在HP感染后胃組織從胃炎向胃癌演變過程中發(fā)揮了重要的作用[2]。HP感染產(chǎn)生的低水平ROS,在感染初期,并不會(huì)直接導(dǎo)致DNA鏈斷裂,而是導(dǎo)致DNA堿基氧化性損傷,其中,8羥基脫氧鳥嘌呤(8 h ydroxy d eoxyguanine,8-OHdG)是主要損傷形式[3]。堿基切除修復(fù)是DNA堿基損傷的主要修復(fù)方式,8-OHdG DNA糖基化酶1(8-oxoguanine DNA glycosylase 1,OGG1)是堿基切除修復(fù)過程的限速酶,識(shí)別并修復(fù)損傷的堿基,防止基因組不穩(wěn)定和基因突變[4]。研究表明,胃腫瘤組織的OGG1表達(dá)顯著低于正常胃組織[5],并且,OGG1基因多態(tài)性與人群胃癌易感性呈顯著正相關(guān)[6],提示OGG1可能在胃癌發(fā)生發(fā)展過程中扮演了重要的角色。因此,本研究通過RNA干擾技術(shù)沉默OGG1表達(dá),通過檢測細(xì)胞活力和細(xì)胞凋亡及PARP表達(dá)等,探討OGG1在HP感染致胃上皮細(xì)胞(GES-1) DNA損傷中的作用。

    1 材料與方法

    1.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組處理

    人胃黏膜上皮細(xì)胞株GES-1和H.pylori ACTC43504(CagA+,VacA+)標(biāo)準(zhǔn)菌株由貴州省安順市人民醫(yī)院提供。細(xì)胞培養(yǎng)采用DMEM培養(yǎng)基(Invitrogen公司)添加10%胎牛血清(Hyclone公司)和100 U/mL的青霉素-鏈霉素雙抗(Sigma公司),于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的恒溫培養(yǎng)箱中,傳代接種于6孔板或96孔板經(jīng)培養(yǎng)達(dá)對數(shù)生長期,在HP感染前,細(xì)胞更換不含抗生素的培養(yǎng)基。感染時(shí),將HP接種于含有10%無菌脫脂羊血的空腸彎曲桿菌培養(yǎng)基(西寶生物)中,于37 ℃、N2體積分?jǐn)?shù)為85%、CO2體積分?jǐn)?shù)為10%、O2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d,刮取HP至含有1.5 mL DMEM培養(yǎng)基的EP管中,4 ℃、12 000 g離心10 min,去上清,經(jīng)分光光度計(jì)檢測波長為660 nm時(shí)的細(xì)菌吸光度D(660)值。實(shí)驗(yàn)分組為4組:對照組、干擾組(OGG1 siRNA)、HP感染組、OGG1干擾+HP感染組。在HP(病毒滴度10∶1)感染GES-1細(xì)胞24或48 h后檢測。

    1.2 OGG1 siRNA轉(zhuǎn)染

    轉(zhuǎn)染試劑采用脂質(zhì)體2000(Invitrogen公司),采用OptiMEM(Invitrogen公司)配制脂質(zhì)體和siRNA(100 nmol/L)的工作液。于HP感染前12 h,將干擾組細(xì)胞轉(zhuǎn)染OGG1特異的siRNA(Invitrogen公司),正義鏈為5′-GC UUGAUGAUGUCACUUAUTT-3′,反義鏈為5′-AUAAG UGACAUCAUCAAGCTG-3′;對照組細(xì)胞轉(zhuǎn)染對照序列正義鏈為5′-GUACUUCCA GCUAGAUGUUUU -3′,反義鏈為5′-AACAUCUAGCUGGAAGUACUU-3′,OGG1干擾效率采用Western blot檢測干擾24 h后OGG1蛋白表達(dá)。

    1.3 細(xì)胞活力檢測

    采用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(Cell Counting Kit 8,CCK-8)(Dojindo公司)檢測細(xì)胞增殖活力。根據(jù)試劑盒說明書,將GES-1細(xì)胞接種于96孔板,接種密度為5×105/mL,培養(yǎng)至對數(shù)生長期,經(jīng)siRNA轉(zhuǎn)染和HP感染處理完畢,每孔加入含10% CCK-8原液的DMEM 100 μL繼續(xù)培養(yǎng)2 h,分別于HP感染后24和48 h后檢測細(xì)胞活力。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

    1.4 細(xì)胞毒性檢測

    采用細(xì)胞毒性檢測試劑盒(Roche公司)檢測細(xì)胞乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)釋放。各組細(xì)胞同1.3處理完畢后,根據(jù)試劑盒說明書,分別收集HP感染24和48 h后的細(xì)胞上清并加入LDH溶液在25 ℃反應(yīng)30 min。采用Infinite M200(TECAN公司)讀取各孔的D(450)值,每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,測量值采用對照組標(biāo)準(zhǔn)化百分率表示。

    1.5 彗星試驗(yàn)檢測DNA損傷

    采用彗星試驗(yàn)試劑盒(Trevigen公司)檢測經(jīng)HP感染48 h后的細(xì)胞DNA損傷情況。用胰酶消化、重懸各組GES-1細(xì)胞,調(diào)整密度至(3~5)×105/mL,與0.65%的低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠按1∶10(V/V)混勻并平鋪于Trevigen彗星試驗(yàn)專用載玻片上,4 ℃預(yù)冷30 min后,將載玻片置于裂解液(2.5 mmol/L NaCl,10 mmol/L Tris HCl,100 mmol/L EDTA,10%二甲亞砜和1%聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100,pH 10.0),4 ℃裂解2 h,后置于堿性解旋液(200 mmol/L NaOH,1 mmol/L Na2EDTA,pH>13),室溫解旋30 min。隨后將載玻片置于水平電泳槽,以1 V/cm電泳40 min。電泳完畢后,用去離子水清洗載玻片2次,75%乙醇脫水5 min,4 ℃干燥后,SYBR Green I(Invitrogen)染色液,避光染色25 min,熒光顯微鏡(Leica公司)觀察并照相。所獲圖片采用CASP軟件分析,每組至少分析100個(gè)細(xì)胞,采用尾長(tail length,TL)、尾部DNA含量、Olive尾矩(Olive tail moment,OTM) 和 尾矩(tail moment,TM)評價(jià)DNA損傷程度。

    1.6 免疫熒光檢測γH2AX焦點(diǎn)形成

    采用免疫熒光法檢測經(jīng)HP感染48 h后的γH2AX焦點(diǎn)形成。用多聚賴氨酸包被蓋玻片并放置于24孔板,GES-1細(xì)胞按5×105/mL接種,培養(yǎng)至對數(shù)生長期時(shí)轉(zhuǎn)染OGG1 siRNA,24 h后實(shí)施HP感染,于感染后48 h將貼有細(xì)胞的蓋玻片用4%甲醛室溫固定15 min,采用0.1% Triton X-100 在4 ℃透膜15 min,熒光封閉液(碧云天公司)封閉30 min后,加入γH2AX(Abcam,1∶200),4 ℃過夜,次日,加入相應(yīng)的Alexa Fluor?647熒光二抗(Invitrogen,1∶100),37 ℃反應(yīng)1 h,洗片后,采用DAPI(碧云天公司)反染細(xì)胞核,共聚焦顯微鏡(Leica公司)觀察并照相。

    1.7 細(xì)胞凋亡檢測

    采用脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法(terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling,TUNEL)檢測各組細(xì)胞經(jīng)HP感染48 h后的凋亡情況。細(xì)胞處理同1.5。根據(jù)TUNEL試劑盒(Roche公司)說明書,細(xì)胞接種貼片后,將貼有細(xì)胞的蓋玻片用4%甲醛室溫固定15 min,0.3%的H2O2室溫處理10 min以抑制內(nèi)源性的過氧化物酶,采用0.1% Triton X-100在4 ℃條件下透膜15 min,隨后,每個(gè)樣本滴加50 μL TUNEL反應(yīng)液37 ℃避光反應(yīng)1 h,熒光顯微鏡(Leica公司)觀察并照相。每組至少記錄500個(gè)細(xì)胞,凋亡指數(shù)為總細(xì)胞中TUNEL陽性細(xì)胞的比例。

    1.8 Western blot檢測

    采用Western blot檢測經(jīng)HP感染24 h后OGG1蛋白表達(dá)及感染48 h后的γH2AX和PARP蛋白表達(dá)。GES-1細(xì)胞按5×105/mL接種于6孔板,培養(yǎng)至對數(shù)生長期時(shí)轉(zhuǎn)染OGG1 siRNA,24 h后實(shí)施HP感染,于感染后48 h刮取細(xì)胞并加入含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑(Roche公司)的RIPA裂解液(碧云天公司)冰上裂解30 min,15 000 g離心20 min,取上清,采用BCA試劑盒(碧云天公司)測定蛋白濃度,60 μg蛋白上樣10% SDS-PAGE電泳,蛋白分離后,經(jīng)過轉(zhuǎn)膜,封閉,而后加入兔抗人OGG1單克隆抗體(Abcam,1∶1 000)、羊抗人γH2AX單克隆抗體(Abcam,1∶1 000)、羊抗人PARP 多克隆抗 體 (Abcam, 1∶ 1 000)及 鼠 抗 人 β-actin (Sigma-Aldrich,1∶1 000)4 ℃孵育過夜,次日洗膜,37 ℃辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育2 h,采用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)(Amersham公司)檢測蛋白表達(dá)。

    1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    應(yīng)用SPSS 13.0軟件錄入各組數(shù)據(jù),采用單因素方差分析統(tǒng)計(jì)各組數(shù)-據(jù),用Student’s t檢驗(yàn)分析兩組間的差異,數(shù)據(jù)采用x±s表示,每組實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次,以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

    2 結(jié) 果

    2.1 OGG1干擾對HP感染引起的胃上皮細(xì)胞活力變化和LDH釋放的影響

    圖1 OGG1干擾對HP感染引起的胃上皮細(xì)胞活力變化和LDH釋放的影響

    GES-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染OGG1 siRNA或者對照siRNA序列后,再感染HP,分別于感染后24 h和48 h檢測細(xì)胞活力和LDH釋放。如圖1所示。Western blot檢測顯示干擾組OGG1蛋白表達(dá)較對照組顯著降低(p<0.01)(圖1A和B)。與對照組相比,單純HP感染和單純OGG1干擾細(xì)胞活力及LDH釋放均無明顯影響。而在OGG1干擾+HP感染24和48 h后,與對照組和單純HP感染組相比,OGG1干擾+HP感染組細(xì)胞活力顯著下降,LDH釋放顯著增多(p<0.05或p<0.01)。

    2.2 OGG1干擾對HP感染引起的胃上皮細(xì)胞DNA 損傷的影響

    彗星實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,OGG1干擾后,細(xì)胞DNA在HP感染后24 h和48 h發(fā)生拖尾現(xiàn)象(圖2A~D和I~L)。經(jīng)CASP軟件分析后,與對照組及HP感染組比較,OGG1干擾+HP感染24 h后尾長、尾部DNA含量和Olive尾矩顯著增加(p<0.05或p<0.01)(圖2F和G),而尾矩差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖2H);而在OGG1干擾+HP感染48 h后,與對照組及HP感染組比較,尾長、尾部DNA含量、Olive尾矩均顯著增加(p<0.01),尾矩也顯著增加(p<0.05)(圖2F和G)。與對照組比較,單純HP感染組和單純OGG1感染組細(xì)胞的尾長、尾部DNA含量、Olive尾矩及尾矩在感染后的24 h和48 h均無顯著變化(P>0.05)。

    2.3 OGG1沉默聯(lián)合HP感染引起胃上皮細(xì)胞DNA雙鏈斷裂

    圖2 OGG1干擾對HP感染引起的胃上皮細(xì)胞DNA損傷的影響

    γH2AX是DNA雙鏈斷裂的分子標(biāo)志物,與對照組比較,單純HP感染組和單純OGG1感染組細(xì)胞核內(nèi)γH2AX焦點(diǎn)無明顯變化,而HP感染+OGG1干擾組細(xì)胞核γH2AX焦點(diǎn)明顯增多(圖3A),而采用Western blot檢測發(fā)現(xiàn),與對照組比較,HP感染+OGG1干擾組γH2AX蛋白表達(dá)顯著升高(p<0.01)(圖3B和C)。

    圖3 OGG1干擾對HP感染引起的胃上皮細(xì)胞γH2AX焦點(diǎn)形成及蛋白表達(dá)的影響

    2.4 OGG1干擾對HP感染引起細(xì)胞凋亡的影響

    HP感染48 h后,與對照組比較,單純HP感染組和單純OGG1感染組TUNEL陽性細(xì)胞及活化的PARP無明顯變化,HP感染+OGG1干擾組細(xì)胞核TUNEL陽性細(xì)胞明顯增多(圖4A)。而采用Western blot檢測發(fā)現(xiàn),與對照組比較,HP感染+OGG1干擾組活化的PARP蛋白表達(dá)水平顯著升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01)(圖4B和C)。

    3 討論

    本研究通過RNA干擾技術(shù)沉默OGG1表達(dá),評估了細(xì)胞活力、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞死亡;并采用彗星實(shí)驗(yàn)和γH2AX焦點(diǎn)形成檢測細(xì)胞DNA損傷,我們發(fā)現(xiàn)HP感染在胃上皮細(xì)胞OGG1表達(dá)下調(diào)的情況下,導(dǎo)致顯著的細(xì)胞DNA損傷和細(xì)胞凋亡,在細(xì)胞水平解釋了人群OGG1多態(tài)性和表達(dá)下調(diào)與胃癌發(fā)生相關(guān)關(guān)系的分子機(jī)制。

    研究表明,HP感染引起細(xì)胞氧化應(yīng)激,主要通過兩條經(jīng)典途徑:一是通過PI3K/Rac1信號通路激活NADPH氧化酶1(NOX1)產(chǎn)生ROS[7],二是通過精胺氧化酶在多胺精胺向精胺轉(zhuǎn)化的過程中產(chǎn)生過氧化氫,細(xì)胞氧化應(yīng)激進(jìn)而引起氧化性DNA損傷[3]。由于OGG1是氧化性DNA堿基損傷修復(fù)途徑的關(guān)鍵酶,因此本研究發(fā)現(xiàn)的HP感染引起OGG1下調(diào)的胃上皮細(xì)胞DNA損傷和細(xì)胞凋亡主要是氧化應(yīng)激介導(dǎo)的。既往研究表明,HP感染(病毒滴度為50∶1)引起胃上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激水平增高和ATM/ATR依賴的DNA損傷[8],而本研究采用更低劑量的HP感染(病毒滴度為10∶1)未引起DNA損傷,而在OGG1沉默的情況下出現(xiàn)DNA損傷效應(yīng),表明OGG1在HP感染致胃上皮細(xì)胞DNA損傷過程中發(fā)揮了保護(hù)作用。

    HP感染產(chǎn)生的氧自由基攻擊細(xì)胞DNA,首先引起具有潛在致癌特性的8-OHdG形成,此種DNA損傷類型主要由OGG1介導(dǎo)的堿基切除修復(fù)途徑完成,從而防止基因突變,維持基因組DNA完整性[9]。OGG1介導(dǎo)的氧化性DNA損傷修復(fù)不完全或失敗將導(dǎo)致DNA鏈斷裂、細(xì)胞周期阻滯、細(xì)胞凋亡以及線粒體功能障礙,進(jìn)而加劇ROS產(chǎn)生[10]。研究表明,OGG1沉默引起氧化性DNA損傷加重、DNA鏈斷裂和細(xì)胞凋亡,提示OGG1對細(xì)胞DNA具有保護(hù)作用[11]。這與本研究的結(jié)論是一致的。

    DNA損傷在各類癌癥發(fā)生發(fā)展過程中關(guān)鍵作用已經(jīng)得到廣泛的認(rèn)同。而OGG1因?yàn)閰⑴c氧化性DNA損傷修復(fù),與癌癥發(fā)生發(fā)展有著密切的聯(lián)系。人群研究提示,OGG1基因多態(tài)性與胃癌、結(jié)腸癌、膀胱癌、胰腺癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤發(fā)生密切相關(guān)[12-15],OGG1在多種腫瘤組織中OGG1表達(dá)下降[4],OGG1敲除小鼠致癌模型中發(fā)生肺癌的數(shù)量和大小較對照組顯著增多,發(fā)生時(shí)間明顯提前[16]。新近研究發(fā)現(xiàn),OGG1過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠在誘導(dǎo)乳腺癌模型中,腫瘤的體積較對照明顯減小,轉(zhuǎn)移率顯著減低,同時(shí)伴隨著氧化應(yīng)激水平降低,DNA損傷減輕和線粒體功能改善,表明OGG1介導(dǎo)的氧化性DNA損傷修復(fù)限制了腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移[17]。我們發(fā)現(xiàn)較低劑量的HP感染未引起胃上皮細(xì)胞DNA損傷和凋亡,然而OGG1沉默后,HP感染導(dǎo)致了細(xì)胞DNA損傷,同時(shí)伴隨著細(xì)胞凋亡增加,細(xì)胞活力下降,表明OGG1保護(hù)了HP感染致胃上皮細(xì)胞DNA損傷。綜合前面的分析,OGG1可能是HP感染致胃癌發(fā)生的早期關(guān)鍵分子,這為防護(hù)HP感染導(dǎo)致的胃癌發(fā)生提供了新的理論依據(jù)和干預(yù)靶點(diǎn)。

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