南瓜未授粉子房培養(yǎng)形成再生植株的研究

鄧　英,唐　兵, 吳康云，盧　松，文林宏，張萬萍

(1 貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 園藝研究所，貴陽 550006；2 貴州省園藝工程技術(shù)研究中心，貴陽 550006; 3 貴州大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，貴陽 550025)

南瓜[Cucurbitamoschata(Duch. ex Lam.) Duch. ex Poiret]是葫蘆科南瓜屬一年生蔓性草本植物，因其營養(yǎng)豐富并具有保健功能[1]，深受人們的喜愛，故享有“世界性蔬菜”的美稱。然而中國南瓜優(yōu)良品種較少，產(chǎn)品更新速度不能滿足實際生產(chǎn)需求，故需要不斷培育南瓜新品種以滿足市場需求。單倍體育種是指通過植物組織培養(yǎng)(如未受精子房、胚珠離體培養(yǎng)或者花粉、花藥離體培養(yǎng)等)誘導(dǎo)產(chǎn)生單倍體的一項技術(shù)，再經(jīng)過加倍可獲得純系或自交系，加速育種進(jìn)程，是現(xiàn)代育種的重要方法之一。

在十字花科、禾本科和茄科等植物中利用花藥(粉)培養(yǎng)獲得單倍體或雙單倍體植株已有成功報道[2-3]，但在葫蘆科植物上少見報道。由于葫蘆科的花藥(粉)培養(yǎng)較難成功，所以離體雌核培養(yǎng)技術(shù)成為葫蘆科單倍體育種的重要手段[4-5]。國內(nèi)外對葫蘆科離體雌核培養(yǎng)的研究已有報道，在西葫蘆[6]、甜瓜[7]、黃瓜[8]等葫蘆科植物上已獲得成功，但是只有少數(shù)獲得了胚囊植株。在南瓜上，孫守如等[9]利用未受精胚珠離體培養(yǎng)獲得了單倍體植株，閔子揚等[10]利用未受精子房離體培養(yǎng)獲得了單倍體植株。然而都是通過胚狀體形成愈傷，再形成再生植株，培養(yǎng)時間較長。本研究通過添加不同濃度TDZ，篩選出南瓜直接形成再生植株條件，為進(jìn)一步完善南瓜未授粉子房離體培養(yǎng)再生體系提供技術(shù)支持，為加速南瓜育種進(jìn)程奠定基礎(chǔ)。

1　材料和方法

1.1　試驗材料

供試品種為‘貴陽小青瓜’(南瓜)，于2015年4月下旬穴盤育苗，5月中旬移栽于貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所蔬菜基地，普通肥水管理。

1.2　外植體的獲得

第二雌花出現(xiàn)以后，采取開花前1 d的雌花，在2～5 ℃下冷藏預(yù)處理24～48 h；將花冠去掉后流水沖洗1 h，在超凈臺上用75%酒精消毒1 min，再用3%次氯酸鈉(有效氯含量5.5%)消毒10 min，用無菌水清洗干凈后，切去外皮，再將南瓜子房切成2 mm厚的子房片接種于以下處理的培養(yǎng)基中。

1.3　熱激處理

暗培養(yǎng)條件下，熱激溫度35 ℃，處理時間分別為3、4、5、6和7 d，熱激完后轉(zhuǎn)入25 ℃的光照條件下培養(yǎng)，記錄愈傷轉(zhuǎn)綠和出胚數(shù)。

平均出胚數(shù)為平均每個子房塊出胚數(shù)；出胚率=形成胚的子房塊/接種子房總塊數(shù)×100%。

1.4　直接獲得再生植株TDZ濃度篩選

以MS為基本培養(yǎng)基，含3%蔗糖，7%瓊脂，添加濃度為0.00、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/L植物生長調(diào)節(jié)劑TDZ，pH為6.0，共6個處理，3次重復(fù)，每重復(fù)接種21個子房片(3瓶，每瓶7片)。

1.5　子房培養(yǎng)及植株再生

以MS+0.06 mg/L TDZ為實驗培養(yǎng)基，設(shè)2種培養(yǎng)模式。模式1：在35 ℃下暗培養(yǎng)5 d后，轉(zhuǎn)入25 ℃、光照16 h/d、光照強(qiáng)度為3 000 Lx的培養(yǎng)室培養(yǎng)直到形成植株；模試2：在相同培養(yǎng)條件下，子房片培養(yǎng)20 d后將膨大的胚珠剝離子房片，接種于含相同TDZ濃度的培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)直到形成植株。

植株再生率=再生植株數(shù)/接種片數(shù)×100%

1.6　再生植株擴(kuò)繁及生根移栽

切取再生植株莖尖接種于MS+ 0.2 mg/L 6-BA + 0.02 mg/L NAA +3%蔗糖+7%瓊脂培養(yǎng)基上。每2周轉(zhuǎn)接1次，獲得較多的植株。移栽前接種于MS+ 0.02 mg/L NAA +3%蔗糖+7%瓊脂培養(yǎng)基上生根，利用進(jìn)口草炭作為基質(zhì)，50孔穴盤移栽，于室內(nèi)煉苗，成活后移栽大田。

1.7　數(shù)據(jù)分析

利用DPS 6.5軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，Qrigin 8.0作圖，圖片用Photoshop處理。

2　結(jié)果與分析

2.1　熱激對南瓜子房胚誘導(dǎo)率的影響

在未受精子房離體培養(yǎng)時，需要啟動雌核發(fā)育才能形成胚，其中暗培養(yǎng)熱激預(yù)處理是啟動雌核發(fā)育的關(guān)鍵因素之一[9]。從圖1可知，不同預(yù)處理時間對南瓜出胚數(shù)和出胚率都有一定影響，其中均為處理5 d效果最好，分別為5.00個和22.57%，均與其他處理差異顯著。表明‘貴陽小青瓜’的大孢子培養(yǎng)的最佳熱激時間為5 d。

不同小寫字母表示在0.05水平上差異顯著，下同圖1　不同熱激時間對南瓜出胚率的影響The different normal letters indicate significant difference at 0.05 level, the same as belowFig.1　Effect of different heat shock time on the inducted embryo rate of pumpkin

2.2　TDZ濃度對南瓜子房培養(yǎng)植株再生的影響

子房片接種在6個不同處理的培養(yǎng)基上，33 ℃暗培養(yǎng)5 d后轉(zhuǎn)入25 ℃(光強(qiáng)3 000 L x，光照16 h/d)培養(yǎng)。從表1中可以看出，較對照組，N2、N3均能直接獲得植株，植株再生率分別為1.6%、14.3%，其中N3獲得的植株數(shù)與其他處理差異達(dá)顯著水平。N4在培養(yǎng)過程中先形成胚，胚愈傷化后再分化成植株，從培養(yǎng)到形成再生植株需要5～6月，植株再生率為4.8%。CK、N1培養(yǎng)3個月后褐化死亡，N5因為TDZ濃度過高，胚珠與胎座不膨大，不能形成植株。由此可見，TDZ濃度對南瓜子房培養(yǎng)形成再生成植株具有非常重要的作用。

2.3　子房培養(yǎng)獲得再生植株

南瓜子房片接種于含不同TDZ濃度的培養(yǎng)基中，形成再生植株的途徑不同，從圖2可知分兩種途徑。當(dāng)TDZ濃度為0.04～0.06 mg/L時，對胎座膨大有抑制作用，使胎座的膨大速度慢于胚珠，不會影響胚珠接觸到培養(yǎng)基，這樣胚珠膨大可直接形成再生植株(圖2，A、B)，只需要大約3個月時間；當(dāng)TDZ濃度為0.08 mg/L時，胎座膨大的速度快于胚珠，很快就將胚珠膨大形成的胚狀體包裹住，影響其與培養(yǎng)基的接觸，不利于營養(yǎng)吸收，故需要將胚狀體剝離轉(zhuǎn)入新的培養(yǎng)基(圖2，C)，胚狀體愈傷化后再形成植株(圖2，D)，需5～6月時間。表明一定濃度的TDZ有利于南瓜子房直接形成再生植株，并大大縮短了培養(yǎng)時間，有利于加快育種進(jìn)程。

2.4　再生植株擴(kuò)繁及生根移栽

將產(chǎn)生的再生植株接種到生根培養(yǎng)基進(jìn)行生根誘導(dǎo)(圖3，A)，1周誘導(dǎo)出根，2周產(chǎn)生較多根。根系潔白、粗壯，達(dá)到可移栽水平(圖3，B、C)。將可移栽植株根系表面培養(yǎng)基洗凈(圖3，D)，移栽至50孔穴盤中，室內(nèi)煉苗成活后移栽至大田，植株生長健康成活率高。苗期較母本植株生長矮小，葉片窄小(圖3，E)，前期雖然能成功結(jié)瓜(圖3，F(xiàn))，但較容易化瓜，只能維持在幼瓜期，初步判定可能獲得的是單倍體植株。

表1　培養(yǎng)基中添加不同濃度TDZ對植株再生的影響

注： N.無; Y.有

Note： N. None; Y. Yes

A.子房切片；B.直接獲得再生植株；C.剝離培養(yǎng)胚珠；D.胚珠培養(yǎng)獲得的植株圖2　南瓜子房培養(yǎng)形成再生植株過程A. Ovary slice; B. Plantlet regeneration directly; C. Ovule culture by dissection; D. A plant obtained from ovule culturesFig.2　The process of plantlet formation in pumpkin ovary culture

A. 再生植株；B. 生根植株；C. 健壯根系：D. 煉苗植株；E. 移栽植株；F. 結(jié)瓜植株圖3　再生植株生根及移栽A. Plantlet regeneration; B. Rooting plants; C. Robust root system; D. Refining the seeding plants; E. Transplanting plant; F. Plants with melonFig.3　Rooting and transplanting of regenerated plants

3　討　論

離體雌核培養(yǎng)受多種因素的影響，主要包括：供體植株的基因型、胚囊發(fā)育時期、熱激溫度和時間、培養(yǎng)基組成等。為了提高培養(yǎng)成功率，本實驗對‘貴陽小青瓜’未受精離體雌核培養(yǎng)的熱激溫度進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)在35 ℃條件下暗培養(yǎng)5 d為最佳熱激時間。翟慶慧等[11]對南瓜未受精離體雌核培養(yǎng)熱激預(yù)處理研究表明，暗培養(yǎng)35 ℃條件下6 d培養(yǎng)效果最好，本實驗結(jié)果與其較接近。

2,4-D、NAA和6-BA對誘導(dǎo)南瓜未受精雌核離體產(chǎn)生胚狀體具有重要作用[12]，但不是必須的。TDZ具有生長素和細(xì)胞分裂素雙重作用[13]，同時也能誘導(dǎo)產(chǎn)生單倍體胚[14]。閔子揚等[10]和刁衛(wèi)平等[15]研究發(fā)現(xiàn)，0.04 mg/L TDZ對黃瓜和南瓜未受精雌核胚狀體誘導(dǎo)效率均較高，并且胚珠愈傷化程度較低，有利于后期成苗。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，TDZ除了能誘導(dǎo)未受精雌核產(chǎn)生胚狀體外，一定濃度的TDZ還能改變南瓜離體雌核培養(yǎng)植株的再生途徑。在0.04～0.06 mg/L范圍內(nèi)能誘導(dǎo)直接產(chǎn)生再生植株，不需要經(jīng)過產(chǎn)生愈傷后形成再生植株。縮短了獲得再生植株的時間，有利于快速獲得南瓜單倍體植株，并且不需要對胚狀體進(jìn)行剝離，節(jié)省了試驗步驟，減少了污染的可能性，加快了育種進(jìn)程。

本實驗只是初步得到了‘貴陽小青瓜’離體雌核培養(yǎng)再生植株，還需要對獲得的再生植株進(jìn)行倍性鑒定，并對影響其培養(yǎng)的各因素進(jìn)行全面系統(tǒng)的優(yōu)化，以提高培養(yǎng)的效率。

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