穆 茜,張丹丹,楊祎凡,張 晶,胡曉璇,張往祥,2
(1.南京林業(yè)大學a.林學院;b.南方協(xié)同中心,江蘇 南京 210037; 2.揚州小蘋果園藝有限公司,江蘇 揚州 225200)
海棠MalusSpp.屬薔薇科Rosaceae 蘋果屬MalusMill.中果實直徑≤5 cm 的落葉灌木或小喬木,其抗逆性及適應性強,同時與主栽品種有很強的親和性[1]。目前,有關海棠的研究主要集中在觀花、觀葉等方面,而對其果實內在性狀品質方面的研究報道卻較少。糖酸組分是果實生長發(fā)育、產量和品質形成的物質基礎,對產量的形成和品質的改良均有重大意義[2]。各種糖酸組分的絕對含量及它們之間的相互作用,決定著果實可溶性固形物、維生素C 含量及果實大小、著色程度、果實貨架期等品質特性[3-5]。有關海棠果實內糖酸組分品質特性的研究對于海棠果實的食用、生產、消費和海棠品種的選育與質量評定均有一定的理論意義和實用價值。于淼等[6]采用HPLC 法測定了藍莓品種果實的糖酸組分及含量。劉麗等[7]和胡瓊等[8]分別對果桑和棗吊的果實品質進行了分析評價。何應會等[9]對江南油杉球果種子的品質差異進行了分析評價。杜改改等[10]對6 個杏李品種果實甜酸風味品質進行了分析,結果發(fā)現(xiàn),杏李成熟果實中的糖分積累類型均屬己糖積累型,以積累果糖和葡萄糖為主;有機酸的積累以蘋果酸為主。劉珩等[11]對13 個海棠品種果實的營養(yǎng)物質進行了測定,并進行了聚類分析,結果發(fā)現(xiàn),其中優(yōu)質海棠果的營養(yǎng)成分豐富,并具有高酸度的優(yōu)勢,最適合用作果汁生產的原料。這些研究報道初步明確了各品種海棠果的營養(yǎng)成分及其開發(fā)利用途徑,為進一步開發(fā)海棠果的應用價值提供了科學依據。但是,Ma 等[12]對野生型蘋果和栽培型蘋果的糖酸組分進行分析后發(fā)現(xiàn),有機酸是野生型蘋果和栽培型蘋果的重要區(qū)別物質。同時前人分別對藍果忍冬[13]、蘋果[14]、梨[15]、桃[16]、李[17]等果實的糖酸組分進行了研究,分析確定了不同種類果實的糖酸組分特征及含量。蓋瑞等[18]分別采用比色法和滴定法對海棠果實的糖酸含量進行了分析,結果發(fā)現(xiàn),海棠果實內各功能性成分含量均顯著高于蘋果內的含量,其中海棠果內可溶性總糖、可滴定酸含量最高分別達到蘋果的1.86、2.23 倍。
海棠種質基因庫中的品種繁多,本研究僅選擇其中品質性狀較好的16個主栽品種作為試驗對象,采用高效液相色譜法(HPLC)對其果實的糖酸組分進行了檢測,并采用聚類分析方法對海棠果實的糖酸組分及其含量間的關系進行了分析和分類,旨在揭示海棠果實中糖酸組分的品種特征,從而為海棠果實的開發(fā)利用和品種改良提供理論依據。
供試材料為2017年8月下旬到10月上旬采集于揚州市江都區(qū)海棠種質資源圃中的成熟果實。在此品種資源圃中選擇樹體、樹齡基本一致的果樹,根據成熟果實的取樣標準(為保證不同品種之間果實成熟度的一致,統(tǒng)一于果實充分著色5 d 后采樣)在每個品種樹冠中上部相同方位隨機采摘25 個果實,用密封袋保存帶回實驗室,放入-75 ℃的超低溫冰箱中保存,用于相關指標的測定。供試的海棠品種名稱及編號詳見表1。
表1 供試海棠的品種名稱及編號Table 1 Tested cultivar names and No.of crabapple (Malus spp.)
糖酸組分的提取方法,參照辛秀蘭等[19]和杜改改等[10]的方法并稍作改進。精密稱取海棠果肉2.0 g,放入研缽中,加入NaH2PO4(pH 值為2.4)溶液4 mL 并研磨,當研磨均勻后,轉移至10 mL 的容量瓶中定容,超聲波提取1 h,以10 000 r·min-1的轉速離心15 min,過0.22 μm微孔濾膜,制備出酸待測樣品。糖待測樣品的制備方法同此,但用于研磨與定容的NaH2PO4溶液應換為超純水。
糖組分測定的色譜條件為:液相色譜儀為Waters 1525 系統(tǒng),Waters Abridge C18 柱(250 mm× 4.6 mm,5 μm)色譜柱,柱溫25 ℃,流動相為超純水(0.2%三乙胺)-乙腈(0.2%三乙胺),流速為1 mL·min-1,檢測器為蒸發(fā)光檢測器(Waters 2424),增益值為20,氣體壓力為30 psi,噴霧器動力級別為20%,漂移管80 ℃,進樣量15 μL。根據樣品的峰面積和標準曲線計算蔗糖、果糖和葡萄糖的含量。
有機酸測定的色譜條件為:液相色譜儀為Waters2695 系統(tǒng),色譜柱為Select HSS T3 柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),流動相為20 mmol·L-1NaH2PO4(pH 值為2.4,用磷酸調配),以流速分別為0.4、1.0 mL·min-1的梯度洗脫測定,柱溫為30 ℃,檢測器類型為PDA 二極管檢測器,波長為210 nm,進樣量為8 μL。根據樣品的峰面積和標準曲線計算草酸、酒石酸、蘋果酸、和檸檬酸的含量。
用PR-101α 全糖儀測定[20]果實中可溶性固形物的含量,用二甲苯萃取比色法[21]測定維生C 的含量;每項指標的測定各重復3 次。
分別準確稱取0.2 mg 的蔗糖、葡萄糖和果糖,加入10 L 的超純水,配成質量濃度為0.02 mg·g-1的糖標準母液。然后將糖標準母液分別稀釋成0.12、0.10、0.09、0.06 mg·g-1系列的糖混合標準溶液。再準確稱取草酸、酒石酸、蘋果酸、檸檬酸、琥珀酸各20 mg,加入10 L 的超純水配成質量濃度為2 mg·g-1的酸標準母液。用超純水將酸標準母液分別稀釋成0.40、0.25、0.20、0.10 mg·g-1系列的酸混合標準溶液。用0.22 μm的微孔濾膜過濾后上機分析,以峰面積為縱坐標,濃度為橫坐標求回歸方程和相關系數。
將同一份待測的果肉提取液平行測定5 次后,計算標準偏差,以考察儀器的穩(wěn)定性。采用加標回收率法測定回收率,于樣品提取前分別加入0.2 mg·g-1的糖標準溶液和2.0 mg·g-1的酸標準溶液后再測定,對混合樣品的測定設5 次重復,根據標準品的加入量與檢出量計算回收率。
甜度值的計算方法:如果以100 來表示蔗糖的甜度,那么葡萄糖為75,果糖為175。
甜度值=蔗糖含量×100 +葡萄糖含量×75 +果糖含量×175。
總糖=蔗糖+葡萄糖+果糖;
總酸=蘋果酸+草酸+酒石酸+檸檬酸。
以HPLC 法測定的3 種可溶性糖混合標準品的出峰色譜圖如圖1所示。圖1說明,本試驗所采用的色譜條件對各糖組分的分離效果良好,各組分的出峰前后順序依次為果糖、葡萄糖和蔗糖,保留時間均在6 min 以內。果實樣品的出峰色譜圖如圖2所示。
圖1 可溶性糖混合標準品的HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of soluble sugar mixture standards
圖2 ‘約翰東’果實樣品可溶性糖的HPLC 色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of soluble sugar in M. ‘John Downier’ fruit
采用HPLC 法可以較好地分離出所檢樣品中的各種有機酸組分,混合標準品各組分的出峰順序依次為草酸、酒石酸、蘋果酸、檸檬酸、琥珀酸,保留時間均在16 min 以內(如圖3所示)。從供試的果實樣品中檢測出了4 種有機酸,卻未檢測出琥珀酸,果實樣品的出峰色譜圖如圖4所示。
糖酸組分的標準曲線、重復性及回收率的測定結果見表2。從表2中可以看出,每種成分的相關系數都在0.990 以上,對同一樣品平行測定5 次,各組分糖的平均回收率為 94.52%~99.35%,各組分酸的回收率為 98.66%~99.73%,均達到了分析方法的要求??梢?,采用上文1.2 段說明的樣品提取方法所得的回收率高且重復性好,說明1.2段所述樣品提取方法和1.3 段所述色譜條件適用于海棠果實糖酸組分的測定。
圖3 有機酸混合標準品的HPLC 色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of organic acid mixture standards
圖4 ‘萘微利’果實樣品有機酸的HPLC 色譜圖Fig.4 HPLC chromatogram of organic acid in M.‘Evil Coleman’ fruit
不同海棠品種果實中可溶性糖含量的測定結果見表3。由表3可知,不同海棠品種果實中的總糖含量從高到低依次為:‘麗格’>‘東哥’>‘萘微利’>‘紅哨兵’>‘黛玉’>‘艾琳’>‘珊瑚礁’>‘絢麗’>‘凱爾斯’>‘百夫長’>‘約翰東’>‘皇家寶石’>‘芭蕾紅’>‘白蘭地’>‘亞當’>‘賽爾科’。 16 個海棠品種果實中總糖含量的平均值為1.254~4.827 mg·g-1,其變異系數為7.41%。16 個海棠品種果實中均含有果糖、葡萄糖和蔗糖這3 種糖分,3 種糖分含量的平均值從高到低依次為:葡萄糖>果糖>蔗糖。其中,果糖的平均含量為0.435~1.934 mg·g-1,含量最高的品種為‘東哥’,含量最低的為‘白蘭地’;葡萄糖的平均含量為0.875~2.765 mg·g-1,含量最高的品種為‘麗格’,含量最低的為‘芭蕾紅’;蔗糖的平均含量為0.014~0.666 mg·g-1,含量最高的品種為‘萘微利’,含量最低的為‘皇家寶石’。3 種糖分中,果糖的變異系數最大,達9.73%;葡萄糖的變異系數最小,為4.15%。16 個海棠品種果實中,‘東哥’的果糖含量最高,‘麗格’的葡萄糖含量最高,‘萘微利’的蔗糖含量最高。
表2 糖酸組分的標準曲線、重復性及回收率的測定結果?Table 2 Determination results of standard curves,dependability and recovery rates of sugar and organic acid components
不同海棠品種果實中有機酸含量的測定結果見表4。由表4可知,不同海棠品種果實的總酸含量從大到小依序為:‘絢麗’>‘白蘭地’>‘黛玉’>‘珊瑚礁’>‘芭蕾紅’>‘亞當’>‘凱爾斯’>‘約翰東’>‘賽爾科’>‘百夫長’>‘紅哨兵’>‘艾琳’>‘東哥’>‘皇家寶石’>‘麗格’>‘萘微利’。不同海棠品種果實中總酸的平均含量為4.686~17.073 mg·g-1,其變異系數為9.08%。16 個海棠品種果實中均含有草酸、酒石酸、蘋果酸和檸檬酸這4種酸,而‘賽爾科’‘芭蕾紅’‘皇家寶石’和‘凱爾斯’果實中不含檸檬酸,‘百夫長’和‘亞當’中未發(fā)現(xiàn)酒石酸。海棠果實中有機酸含量的平均值由高到低依次為:蘋果酸>檸檬酸>酒石酸>草酸。蘋果酸的平均含量為3.475~14.266 mg·g-1,含量最高的品種為‘絢麗’,含量最低的為‘萘微利’;檸檬酸的平均含量為0.750~5.692 mg·g-1,含量最高的品種為‘亞當’,含量最低的為‘萘微利’;酒石酸的平均含量為0.069~3.282 mg·g-1,含量最高的品種為‘白蘭地’,含量最低的為‘絢麗’;草酸的平均含量為 0.120~0.385 mg·g-1,含量最高的品種為‘賽爾科’,含量最低的為‘白蘭地’。檸檬酸的變異系數最大,達19.18%;蘋果酸的變異系數最小,為9.76%。16 個海棠品種果實中,‘萘微利’的蘋果酸和檸檬酸含量均最低;‘白蘭地’的酒石酸含量最高,而其草酸含量最低;‘絢麗’的蘋果酸含量最高,而其酒石酸含量最低。
表3 不同海棠品種果實中可溶性糖含量的測定結果?Table 3 Determination results of soluble sugar contents in different cultivars of crabapple fruits
除了酸和糖組分的含量,總甜度、甜酸比、糖酸比也在很大程度上影響果實的甜酸風味和口感。不同海棠品種果實風味的測定結果見表5。由表5可知,不同海棠品種果實總甜度的大小順序為:‘東哥’>‘麗格’>‘萘微利’>‘艾琳’>‘紅哨兵’>‘黛玉’>‘珊瑚礁’>‘凱爾斯’>‘絢麗’>‘約翰東’>‘百夫長’>‘皇家寶石’>‘芭蕾紅’>‘賽爾科’>‘白蘭地’>‘亞當’。 不同海棠品種果實甜酸比的大小順序為:‘萘微利’>‘麗格’>‘黛玉’>‘東哥’>‘艾琳’>‘紅哨兵’> ‘皇家寶石’>‘芭蕾紅’>‘百夫長’>‘凱爾斯’>‘賽爾科’>‘珊瑚礁’>‘約翰東’>‘絢麗’>‘亞當’>‘白蘭地’。不同海棠品種果實糖酸比的大小順序為:‘麗格’>‘萘微利’>‘東哥’>‘紅哨兵’>‘艾琳’>‘皇家寶石’>‘百夫長’>‘黛玉’>‘珊瑚礁’>‘凱爾斯’>‘賽爾科’>‘約翰東’>‘絢麗’>‘芭蕾紅’>‘亞當’>‘白蘭地’。由此可以看出,‘萘微利’和‘麗格’果實的總甜度、甜酸比和糖酸比其它品種都好;就果實的總甜度而言,‘東哥’>‘麗格’>‘萘微利’,但受有機酸的影響,其甜酸比的大小順序為:‘萘微利’>‘麗格’>‘黛玉’。
16 個海棠品種果實中可溶性固形物和維生素C的含量如圖5所示。由圖5可知,16 個海棠品種果實中維生素C 的含量相差較大,而果實中可溶性固形物的含量相差較小。16 個海棠品種果實中維生素C 的平均含量為130.012~282.617 mg·g-1,16 個海棠品種果實中維生素C 含量的平均值由高到低依次為:‘麗格’>‘東哥’>‘萘薇利’>‘紅哨兵’>‘亞當’>‘白蘭地’>‘絢麗’>‘百夫長’>‘約翰東’>‘賽爾科’>‘芭蕾紅’>‘黛玉’>‘凱爾斯’>‘艾琳’>‘皇家寶石’>‘珊瑚礁’。其可溶性固形物的平均含量為12.73%~17.40%,其平均含量(百分比)由高到低依次為:‘萘微利’>‘東哥’>‘麗格’>‘約翰東’>‘絢麗’>‘賽爾科’>‘紅哨兵’>‘亞當’>‘珊瑚礁’>‘黛玉’>‘百夫長’>‘白蘭地’>‘皇家寶石’>‘芭蕾紅’>‘艾琳’>‘凱爾斯’。
表4 不同海棠品種果實中有機酸含量的測定結果?Table 4 Determination results of organic acid contents in different cultivars of crabapple fruits
表5 不同海棠品種果實風味的測定結果Table 5 Determination results of fruit flavor of different cultivars of crabapple
圖5 16 個海棠品種果實中可溶性固形物和維生素C 的含量Fig.5 Contents of soluble solids and vitamin C in sixteen cultivars of crabapple fruits
根據Harker 等[22]對果實風味、氣味、口感質地的定義來制定感官評分標準(見表6),再依據此標準對16 個海棠品種果實進行感官評價,結果見表7。由表7可知,16 個海棠品種果實的感官評價總分從高到低依次為:‘麗格’>‘東哥’>‘萘微利’>‘紅哨兵’>‘黛玉’>‘艾琳’>‘賽爾科’>‘約翰東’>‘百夫長’>‘珊瑚礁’>‘凱爾斯’>‘芭蕾紅’>‘皇家寶石’>‘絢麗’>‘白蘭地’>‘亞當’。16 個海棠品種果實感官評價總分在9.666~33.000 之間,其變異系數為6.18%;其果實風味的評分在1.666~8.833 之間,其中,‘麗格’的風味評分最高,‘白蘭地’和 ‘亞當’的風味評分均最低;其氣味評分在2.666~7.833 之間,其中,‘麗格’和‘萘微利’的氣味評分均最高,而‘亞當’的氣味評分最低;其外觀評分在3.500~7.571 之間,其中,‘東哥’的外觀評分最高,而‘白蘭地’的外觀評分最低;其口感評分在1.500~8.833 之間,其中,‘麗格’的口感評分最高,而‘白蘭地’和‘亞當’的口感評分均最低;供試海棠果的各項感官評價指標的平均標準偏差在0.408~1.751 之間,表明各項感官評價指標的分布較均勻。同時,各感官評價指標及感官評價總分的變異系數在6.18%~13.32%之間,說明16 個海棠品種果實感官品質間的差異不大。
綜合16 個海棠品種果實的果糖、葡萄糖、蔗糖、草酸、酒石酸、蘋果酸、檸檬酸和總甜度、糖酸比和甜酸比這10 項指標進行聚類分析,應用SPSS 13.0 與MEGA 5.0 軟件對海棠果實這10 項糖酸指標數據進行系統(tǒng)聚類分析,將距離相近的果實聚為一類,從而對其果實的綜合品質進行分類[2],結果如圖6所示。聚類分析結果表明,16 個海棠品種果實可分為如下4 類:第1 類主要包括種質編號分別為A7、A9、A10 的果實,此類果實的果糖、蔗糖含量均高,而其蘋果酸、檸檬酸含量均低,其總甜度、甜酸比和糖酸比均高,果實整體口感好,偏甜;第2 類主要包括種質編號分別為A4、A5、A16 的果實,此類果實中的葡萄糖含量較高,而蔗糖含量較低,其總甜度、甜酸比和糖酸比僅次于第1 類,果實整體口感較好,酸甜;第3 類主要包括種質編號分別為A1、A2、A3、A6、A8、A11、A12 和A14 的果實,此類果實中的蘋果酸含量高,而檸檬酸含量較高,其總甜度僅次于第2 類,果實整體口感不理想,偏酸;第4 類主要包括種質編號分別為A13 和A15 的果實,此類果實中的草酸和酒石酸含量均較高,而其總甜度、甜酸比和糖酸比均偏低,果實整體口感不好,果實酸。
表6 海棠果的感官評價標準Table 6 Sensory evaluation criteria for crabapple fruits
本研究采用高效液相色譜法(HPLC)分離并測定了16 個海棠品種果實中的可溶性糖和有機酸,對樣品的前處理和操作簡單便捷,而且具有良好的靈敏度和精密度,可以同時實現(xiàn)對不同糖酸組分類型果實樣品的分析與測定,這對于其它海棠品種果實及其它薔薇科果實的分析也具有一定的參考價值。
表7 16個海棠品種果實的感官評價結果Table 7 Sensory evaluation results of 16 cultivars of crabapple fruits
圖6 16 個海棠品種果實糖酸組分的聚類分析結果Fig.6 Cluster analysis result of sugar and acid components in 16 cultivars of crabapple fruits
果實的糖酸組分及其含量是構成果實品質的重要因素。不同的糖組分其甜度和口感不同,果糖最甜,蔗糖次之,葡萄糖更次之,但其風味是最好的[23]。趙尊行等[24]對13 個中熟和晚熟蘋果品種果實中糖組分的研究結果表明,中晚熟蘋果品種果實中的果糖含量最高;王海波等[25]對6 個早熟蘋果品種果實中糖分的研究結果表明,所有參試品種果實的糖分中均以果糖含量為最高。而本試驗研究結果表明,海棠果實糖組分中以葡萄糖為主,這一差異性可能與果實中各種糖代謝關鍵酶的活性有關[26-28],對此尚待進一步研究。王艷穎等[29]在對薔薇科5 種蘋果的研究中發(fā)現(xiàn),蘋果中可溶性糖的平均含量為38.018 mg·g-1;劉碩等[30]在對57 份薔薇科李果實的研究中發(fā)現(xiàn),李果實中可溶性糖的平均含量為74.06 mg·g-1。本研究結果表明,海棠果實的平均糖含量為1.828 mg·g-1,顯著低于蘋果、李的平均含量。水果中可溶性糖的積累類型包括蔗糖積累型和己糖積累型,研究中發(fā)現(xiàn),16 個海棠品種果實均為己糖積累型,其果糖和葡萄糖含量均顯著高于其蔗糖含量,其果糖甜度值顯著高于其他糖分,因此,可選擇高果糖品種作為親本雜交選育新品種,如‘東哥’(1.934 mg·g-1)、‘艾琳’(1.703 mg·g-1)、‘萘微利’(1.670 mg·g-1)和‘麗格’(1.540 mg·g-1)等品種。有機酸是存在于果蔬中的一類天然化合物,是影響果蔬風味的一種主要物質,有機酸種類及其含量決定了果蔬的口感與品質[31];同時,有機酸具有改善消化道活動并增強食欲的作用[32]。有機酸類型可以分為蘋果酸積累型、枸櫞酸積累型和酒石酸積累型。章秋平[33]和葉麗琴等人[34]分別對薔薇科杏和李的研究結果表明,杏果實中有機酸的積累類型分為枸櫞酸和蘋果酸這2 種,其總酸的平均含量為17.10 mg·g-1;李果實中有機酸的積累類型主要為蘋果酸積累型,其總酸的平均含量為13.5 mg·g-1。梁俊等[35]在對薔薇科蘋果果實的研究中發(fā)現(xiàn),蘋果果實中的酸屬于蘋果酸積累型,其總酸的平均含量為5.739 mg·g-1。本研究結果表明,16 個海棠品種果實中的酸均屬于蘋果酸積累型,其總酸的平均含量為10.213 mg·g-1,顯著低于杏和李,而高于蘋果的平均含量。本研究結果還表明,不同品種海棠果實的有機酸組分間存在差異,‘百夫長’和‘亞當’中未發(fā)現(xiàn)酒石酸,而‘賽爾科’‘芭蕾紅’‘皇家寶石’和‘凱爾斯’中均未發(fā)現(xiàn)檸檬酸,這可能因為受到品種遺傳因素的控制,對此有待于結合分子生物學技術進行深入的研究。
多元統(tǒng)計方法中的聚類分析可以從不同角度給予農藝產品全面客觀的分析[36],現(xiàn)已廣泛應用于李、桃、杏、柿、蘋果仁和枇杷等果實品質的分析之中[2]。劉珩等[11]通過聚類分析將其研究的13 個海棠品種果實劃分為3 類;白世踐等[37]對吐魯番地區(qū)新征集的葡萄資源果實主要品質性狀進行了聚類分析,結果將32 份葡萄資源劃分為4 大類。本研究采用聚類分析方法對各個海棠品種果實的食用和綜合利用價值進行了分類,這為進一步開發(fā)海棠食用價值與品種改良提供了科學依據。但由于條件的制約,本研究僅對海棠種質資源圃中的16 個海棠品種果實進行了分析評價,且僅從果實糖酸組分方面進行了研究,而對于后期果實內部代謝酶及基因差異表達等方面未作研究,今后還需對此開展進一步的探索。
綜合分析果實糖酸及甜酸各組分與可溶性固形物含量、維生素C 含量的測定結果和果實感官評價結果可知,‘東哥’‘麗格’和‘萘微利’果實的綜合品質及口感均好,果實均偏甜,均可適用于鮮食;‘艾琳’‘黛玉’‘紅哨兵’果實的綜合品質及口感均較好,果實酸甜,均可適用于加工為果脯等產品;‘珊瑚礁’‘絢麗’‘賽爾科’‘艾琳’‘芭蕾紅’‘皇家寶石’‘百夫長’‘約翰東’‘凱爾斯’這類果實的總糖含量均處于較低水平,符合加工型海棠制汁的要求,均可作為制作高檔海棠果汁的原料;其余品種海棠果實整體口感均差,不符合食用及加工型海棠的標準,故可用作景觀、生態(tài)等用途樹種。