3個玉米WRKY轉(zhuǎn)錄因子在非生物脅迫下的表達分析

決登偉，桑雪蓮，舒　波，劉麗琴，王一承，石勝友

(中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 南亞熱帶作物研究所，農(nóng)業(yè)部熱帶果樹生物學(xué)重點實驗室，廣東湛江　524091)

轉(zhuǎn)錄因子(transcription factor,TF)是一類能與真核基因啟動子區(qū)域中的順式作用元件特異性結(jié)合的蛋白分子。通過它們之間及與其他蛋白間的相互作用，實現(xiàn)對基因激活或者抑制轉(zhuǎn)錄，從而保證目的基因以特定的強度、在特定的時間與空間表達[1]。植物體內(nèi)含有大量的轉(zhuǎn)錄因子，根據(jù)序列特征及功能的差異，可以將它們分為很多不同的類型或家族。比如WRKY、AP2/ERF和MYB等。這其中，WRKY是植物體中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，它們在植物的生長發(fā)育及響應(yīng)脅迫過程中起到重要作用。第一個WRKY轉(zhuǎn)錄因子(SPF1)在1994年從甘薯中鑒定出來[2]。隨后，在眾多植物中都出現(xiàn)報道，且其數(shù)目從低等植物到高等植物呈現(xiàn)上升趨勢。比如，在油菜 (BrassicanapusL.)中有46個WRKY轉(zhuǎn)錄因子成員[3]，黃瓜(Cucumissativus)中有57個[4]，麻風(fēng)樹(Jatrophacurcas)中有58個[5]，蓖麻(RicinuscommunisL.)中有58個[6]，擬南芥(Arabidopsisthaliana)中有72個[7]，白梨(Pyrusbretschneideri)中有103個[8]，白楊(Populustrichocarpa)中有105個[9]，谷子(Setariaitalica)中有105個[10]，水稻(Oryzasativa)中有109個[11]，在棉花(Gossypium)中有109～112個[12]，玉米(ZeamayL.)中有136個[13]，大豆(Glycinemax)中有197個[14]。

WRKY蛋白在結(jié)構(gòu)上有一個顯著特點：都包含一個或者兩個WRKY結(jié)構(gòu)域，包括N-端高度保守的WRKYGQK七肽及C-端的鋅指結(jié)構(gòu)(Cx4-7Cx22-23HxH/C)。根據(jù)WRKY結(jié)構(gòu)域的數(shù)目及鋅指結(jié)構(gòu)的特點，可將WRKY蛋白劃分為3個主要類型。第Ⅰ類有兩個WRKY結(jié)構(gòu)域，鋅指結(jié)構(gòu)類型為C2H2。第Ⅱ和Ⅲ類只含有一個WRKY結(jié)構(gòu)域。其中，第Ⅲ類成員的鋅指結(jié)構(gòu)類型為C2HC，而第Ⅱ類為C2H2。根據(jù)進化關(guān)系及WRKY結(jié)構(gòu)域中某些氨基酸基序不同，第Ⅱ類WRKY轉(zhuǎn)錄因子又可細分為5個小類(a～e)[15]。研究表明，WRKY轉(zhuǎn)錄因子參與植物多種生理生化過程，如應(yīng)對生物和非生物脅迫，參與葉片衰老，發(fā)育和次生代謝等[16]。在擬南芥中，AtWRKY25和AtWRKY33受鹽的促進表達，且異源表達這兩個基因，增強植物對NaCl的耐性[17-18]。 AtWRKY70既可以激活SA介導(dǎo)的抗病信號途徑，同時也能抑制JA介導(dǎo)的信號途徑，從而實現(xiàn)對擬南芥抗病反應(yīng)的調(diào)控[19]。在水稻中，過表達 OsWRKY45促進擬南芥對干旱的耐性， OsWRKY8異源表達促進擬南芥對滲透的耐性， OsWRKY72的異源表達則會影響根的生長和逆境耐性[20]。另外， OsWRKY89的過表達促進植株對紫外線的抵御[21]，過表達 OsWRKY11增強轉(zhuǎn)基因植株對高溫的耐性[18]。在白梨的103 WRKY基因中，44個PbWRKY在干旱處理下呈上調(diào)表達[8]。高粱(PanicummiliaceumL.)中，10個PmWRKY基因的表達受到干旱脅迫誘導(dǎo)，16個PmWRKY基因的表達受到低溫脅迫誘導(dǎo)[22]。玉米(ZeamaysL.)是當(dāng)今世界重要的糧食作物之一,亦是重要的飼料和工業(yè)原料作物, 在世界糧食總產(chǎn)量中處于第一位[23]。中國作為世界第二大玉米生產(chǎn)國,近30多年來,玉米生產(chǎn)發(fā)展非常迅速，總產(chǎn)量也呈逐年上升趨勢。世界糧農(nóng)組織統(tǒng)計數(shù)據(jù)庫(FAOSTAT)顯示在2012 年，玉米產(chǎn)量超過稻谷產(chǎn)量，成為中國第一大糧食作物[24]。2014年,中國玉米常年種植面積達3 715.04 萬hm2,總產(chǎn)量約2.16 億t,占同年中國糧食總產(chǎn)量(6.07億t)的1/3。但在實際生產(chǎn)中，玉米常因受到諸多不利環(huán)境因素的影響而大面積減產(chǎn)，比如干旱、鹽脅迫和低溫等。目前，已有關(guān)于WRKY家族基因的研究文章[13]，但還沒有關(guān)于 ZmWRKY1-like、 ZmWRKY4-like、 ZmWRKY21-like基因在植物響應(yīng)非生物脅迫中作用的報道。本研究采用生物信息學(xué)技術(shù)從玉米的基因組發(fā)現(xiàn)3個WRKY家族基因： ZmWRKY1-like、 ZmWRKY4-like、 ZmWRKY21-like。利用熒光定量PCR技術(shù)，探討這3個基因在玉米不同組織、干旱、鹽脅迫及低溫脅迫的表達模式。該研究可以為挖掘玉米抗逆基因及豐富WRKY轉(zhuǎn)錄因子在不同作物中的功能研究提供一定的理論和試驗依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　試驗材料及處理

玉米自交系B73種子保存于南亞熱帶作物所。玉米組織根(root)、莖(stem)、葉(leaf)、穗(tassel)、幼果(young seed)和穗絲(silk)取自大田種植的玉米自交系B73植株，采樣時期為乳熟期。所用植物RNA提取試劑盒購自北京華越洋生物公司(Huayueyang Bio Co., Ltd, Beijing, China)；反轉(zhuǎn)錄試劑及Realtime PCR試劑盒購自大連寶生物工程有限公司(TaKaRa Bio, Inc., Dalian, China)；引物由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成；其他試劑購自上海生物工程有限公司。逆境處理所用材料為B73種子萌發(fā)而來的幼苗，種子萌發(fā)后，轉(zhuǎn)入1/2 Hoagland 培養(yǎng)液，在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，生長條件為(28±2) ℃,14 h光照，10 h黑暗。3周后，選擇長勢均一的幼苗進行下步試驗。每個處理具體方法如下：①鹽脅迫處理，將幼苗放入含200 mol/L NaCl的1/2 Hoagland培養(yǎng)液中培養(yǎng)，按0、1、6和24 h時間點取樣；②干旱脅迫處理，將幼苗放入含200 g/L PEG6000的1/2 Hoagland培養(yǎng)液中培養(yǎng)，按0、1、6和24 h時間點取樣；③低溫脅迫處理，將幼苗放入溫度設(shè)置為4 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，按0、1、6和24 h時間點取樣。設(shè)3次重復(fù)，取樣部位為葉片。所有取樣剪成2 cm左右的小段，立即放入液氮速凍并轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱中保存，備用。

1.2　試驗方法

1.2.1 ZmWRKY1-like、 ZmWRKY4-like和 ZmWRKY21-like序列的獲得及分析 ZmWRKY1-like、 ZmWRKY4-like和 ZmWRKY21-like3個基因序列從Phytozome (http://bioinformatics.psb.ugent.be/plaza/versions/plaza/)數(shù)據(jù)庫中獲得，并在玉米基因組數(shù)據(jù)庫(MaizeGDB, http://www. maizegdb.org/)中進行驗證。3個基因的ORF、氨基酸長度和染色體定位信息從Phytozome數(shù)據(jù)庫獲得。應(yīng)用在線軟件SMART (http://smart.emblheidelberg.de/)預(yù)測3個蛋白的結(jié)構(gòu)域；通過ExPASy (http://expasy.org/tools/)分析3個蛋白的等電點和分子質(zhì)量；通過Plant-mPLoc (http://www.csbio.sjtu.edu.cn/cgibin/ PlantmPLoc.cgi)預(yù)測3個蛋白的亞細胞定位情況；采用Gene Structure Display Server (GSDS) (http://gsds.cbi.pku.edu. cn/)分析3個基因的外顯子和內(nèi)含子結(jié)構(gòu)；用Clustal X進行不同序列的多重序列對比，同時利用MEGA 6軟件進行氨基酸序列同源性分析及系統(tǒng)發(fā)育分析，構(gòu)建Neighbor-Joining進化樹，1 000 次重復(fù)，其他均為默認設(shè)置。

1.2.2植物總RNA提取及Realtime PCR分析用北京華越洋生物公司的植物RNA提取試劑盒提取玉米不同組織材料的RNA，然后用TaKaRa公司的PrimeScript RT試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA后作為模板，具體操作步驟參照說明書。根據(jù)玉米基因組中 ZmWRKY1-like、 ZmWRKY4-like和 ZmWRKY21-like3個基因的CDS序列設(shè)計Realtime PCR引物，并以玉米的 Actin 2(NM_001154731)基因作為內(nèi)參基因，具體引物序列見表1。

表1　ZmWRKY基因定量PCR所用引物Table 1　Primers used in quantitative RT-PCR of ZmWRKY gene

Realtime PCR反應(yīng)在Roche的LightCycler480儀器中進行，PCR反應(yīng)酶為TaKaRa公司的SYBR Green Master Mix。反應(yīng)體系為20 mL，其中模板cDNA 40 ng，上、下游引物各250 nmol/L，SYBR Green Master Mix 10 μL，用ddH2O 補齊。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 10 s，59 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，40 個循環(huán)后作熔解曲線(95 → 65 ℃，0.1 ℃/s)。利用2-ΔΔCt計算基因的相對表達量。所有樣品進行3次重復(fù)，均設(shè)陰性對照。在分析基因的表達時，上調(diào)或者下調(diào)大于2倍時才認為存在差異。

2　結(jié)果與分析

2.1　 ZmWRKY1-like、 ZmWRKY4-like和 ZmWRKY21-like3個基因的獲得及生物信息學(xué)分析

以WRKY轉(zhuǎn)錄因子保守區(qū)氨基酸序列在Phytozome和MaizeGDB進行BLASTP搜索，通過分析獲得3個玉米同源性較高的WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族基因，分別為 ZmWRKY1-like、 ZmWRKY4-like和 ZmWRKY21-like。3個基因的基因id、locus、染色體定位等信息見表2和圖1。其中， ZmWRKY1-like基因序列開放閱讀框為1 194 bp，編碼的蛋白具有397個氨基酸，其分子質(zhì)量為42.80 ku，理論等電點為9.98，位于玉米第Ⅰ號染色體； ZmWRKY4-like基因序列開放閱讀框為1 701 bp，編碼的蛋白具有566個氨基酸，其分子質(zhì)量為61.71 ku，理論等電點為6.20，位于玉米第Ⅳ號染色體； ZmWRKY21-like基因序列開放閱讀框為1 065 bp，編碼的蛋白具有354個氨基酸，其分子質(zhì)量為38.04 ku，理論等電點為9.81，位于玉米第Ⅰ號染色體。預(yù)測表明3個基因都位于細胞核。對3個基因的氨基酸序列進行分析，發(fā)現(xiàn) ZmWRKY4-like含有兩個WRKY結(jié)構(gòu)域，根據(jù)WRKY轉(zhuǎn)錄因子分類原則，歸為第Ⅰ類。 ZmWRKY1-like和 ZmWRKY21-like都含有1個WRKY結(jié)構(gòu)域，鋅指結(jié)構(gòu)同為C-X5-C-X23-H-X1-H型，屬于第Ⅱd類WRKY轉(zhuǎn)錄因子。

表2　ZmWRKY基因信息Table 2　Information of ZmWRKY genes

2.2　ZmWRKY1-like、ZmWRKY4-like和ZmWRKY21-like的系統(tǒng)進化分析

采用MEGA 6軟件將玉米ZmWRKY1-like、ZmWRKY4-like和ZmWRKY21-like蛋白序列與擬南芥、水稻、小米、小麥的部分WRKY蛋白序列進行分析并構(gòu)建進化樹(圖 2)，發(fā)現(xiàn)ZmWRKY1-like和ZmWRKY21-like都聚到Ⅱd分支中，與小米的SiWRKY1及小麥的TaWRKY16同源性最高，與同分支擬南芥及水稻的WRKY蛋白同源性稍低。ZmWRKY4-like屬于Ⅰ分支，與同分支中小麥的TaWRKY45同源性最高，與擬南芥的AtWRKY25、AtWRKY26、AtWRKY33，水稻的OsWRKY24、OsWRKY53、OsWRKY70同源性較低(圖 2)。

A.保守結(jié)構(gòu)域蛋白序列對比，黑框中為WRKY結(jié)構(gòu)Alignment of conserved motifs of ZmWRKYS.The WRKY conserved motifis are bordered(black rectangles)；B.基因結(jié)構(gòu)，藍色為外顯子，黑色為內(nèi)含子Gene structure of ZmWRKYs is presented by blue exons and gray intron between the blue box

圖1ZmWRKY1-like、ZmWRKY4-like和ZmWRKY21-like保守結(jié)構(gòu)域蛋白序列對比及基因結(jié)構(gòu)
Fig.1AlignmentofconservedmotifsandgenestructureofZmWRKYs

2.3　玉米不同組織 ZmWRKY1-like、 ZmWRKY4-like和 ZmWRKY21-like的表達分析

以大田種植的B73植株為材料，采樣時期為乳熟期。用Realtime PCR技術(shù)分析 ZmWRKY1-like、 ZmWRKY4-like和 ZmWRKY21-like3個基因在玉米幼苗的根(root)、莖(stem)、葉(leaf)、穗(tassel)、幼果(young seed)和穗絲(silk)中的表達情況。圖3結(jié)果顯示，3個基因在玉米不同組織中都表達，但存在差異。其中， ZmWRKY1-like和 ZmWRKY21-like基因在穗絲中的表達量最低， ZmWRKY4-like基因在根中的表達量最低。3個基因在幼果中的表達量都顯著高于在其他組織， ZmWRKY1-like和 ZmWRKY21-like在幼果中的表達量分別是根的65和13倍； ZmWRKY4-like在幼果中的表達量是穗絲的27倍。說明 ZmWRKY1-like、 ZmWRKY4-like和 ZmWRKY21-like這3個基因可能參與玉米植株不同組織器官的發(fā)育過程，特別是玉米籽粒的發(fā)育過程。

2.4　不同非生物逆境脅迫下 ZmWRKY1-like、 ZmWRKY4-like和 ZmWRKY21-like的表達分析

以3周苗齡的B73玉米幼苗為材料，用Realtime PCR技術(shù)分析 ZmWRKY1-like、 ZmWRKY4-like和 ZmWRKY21-like3個基因在鹽、干旱和低溫處理下表達情況。如圖4、5、6所示，鹽脅迫下， ZmWRKY1-like基因在6 h時出現(xiàn)下調(diào)表達，為對照的0.43倍，在24 h時恢復(fù)到對照水平； ZmWRKY4-like基因的表達在檢測時間內(nèi)未出現(xiàn)變化； ZmWRKY21-like基因在24 h時呈現(xiàn)上調(diào)表達，為對照的2.2倍。干旱脅迫下， ZmWRKY1-like基因在6和24 h出現(xiàn)下調(diào)表達，分別為對照的0.3和0.4倍； ZmWRKY4-like基因的表達在檢測時間內(nèi)未出現(xiàn)變化； ZmWRKY21-like基因在6 h時出現(xiàn)下調(diào)表達，為對照的0.4倍，在24 h時恢復(fù)到對照水平。低溫脅迫下，3個基因的表達都沒有出現(xiàn)顯著變化。上述結(jié)果表明， ZmWRKY1-like和 ZmWRKY21-like基因可能分別參與植物對干旱和鹽脅迫的響應(yīng)。

○玉米　Zea mays;▲擬南芥　Arabidopsis thaliane; ● 小米　Setaria italica;◆水稻　Oryza sativa ;■小麥　Triticum aestivum

圖3　 ZmWRKY1-like、ZmWRKY4-like和ZmWRKY21-like基因在玉米不同組織中的表達水平Fig.3　Expression level of ZmWRKY1-like, ZmWRKY4-like and ZmWRKY21-like gene in different maize tissues

圖4　玉米 ZmWRKY1-like基因的逆境表達分析Fig.4　Stress expression analysis of ZmWRKY1-like gene

圖5　玉米 ZmWRKY4-like基因的逆境表達分析Fig.5　Stress expression analysis of ZmWRKY4-like gene

圖6　玉米 ZmWRKY21-like基因的逆境表達分析Fig.6　Stress expression analysis of ZmWRKY21-like gene

3　結(jié)論與討論

WRKY是植物中一類重要的轉(zhuǎn)錄因子家族，也是植物轉(zhuǎn)錄因子中最大的家族之一[25]。本研究從Phytozome和MaizeGDB數(shù)據(jù)庫中得到3個玉米WRKY家族基因： ZmWRKY1-like、 ZmWRKY4-like和 ZmWRKY21-like。對3個基因的序列特征和進化關(guān)系進行分析，并采用熒光定量PCR檢測這3個基因在玉米不同組織和不同逆境脅迫處理下的表達情況。

分析表明ZmWRKY1-like、ZmWRKY4-like和ZmWRKY21-like都具有WRKY保守結(jié)構(gòu)域和鋅指結(jié)構(gòu)，分別為第Ⅱd、Ⅰ和Ⅱd類WRKY轉(zhuǎn)錄因子。石紅梅等[26]的研究表明，PsWRKY基因主要在牡丹的葉片和心皮中表達，在其他器官中的表達量非常低。煙草的164個WRKY基因中，大部分在根、莖、葉中都有表達，但不同基因間的表達模式存在差異。比如： NtWRKY7、NtWRKY11、NtWRKY32、NtWRKY82、NtWRKY92、NtWRKY105和 NtWRKY147在根、莖、葉中不表達或表達量較低； NtWRKY26和 NtWRKY78在根中表達量最高； NtWRKY21和 NtWRKY114在莖中表達量最高； NtWRKY28、 NtWRKY81、 NtWRKY163在葉片中表達量最高[27]。與這些研究結(jié)果類似，本研究中 ZmWRKY1-like、 ZmWRKY4-like和 ZmWRKY21-like3個基因在檢測的玉米組織中都有表達，呈多種表達模式。其中， ZmWRKY1-like和 ZmWRKY21-like基因在穗絲中的表達量最低， ZmWRKY4-like基因在根中的表達量最低。3個基因在幼果中的表達量都顯著高于在其他組織中的表達量，特別是 ZmWRKY1-like在幼果中的表達量達到根中表達量的65倍。該結(jié)果說明這3個基因可能參與玉米植株不同組織器官的發(fā)育過程，特別是玉米籽粒的發(fā)育過程。

大量研究表明，WRKY蛋白參與植物對逆境脅迫的響應(yīng)過程[16]。比如在擬南芥中，有近2 000 個干旱響應(yīng)基因，其中就包含不少WRKY基因[28]。干旱和高鹽處理時， AtWRKY25和 AtWRKY33 的表達量會提高，而它們的異源表達增強轉(zhuǎn)基因植株對NaCl耐性[29]。高溫脅迫誘導(dǎo) AtWRKY25和 AtWRKY26的表達，而抑制 AtWRKY33 的表達[30]。過表達 OsWRKY45可以增強轉(zhuǎn)基因植株對鹽和干旱的耐受性[31]。過表達 GmWRKY21可以增強轉(zhuǎn)基因擬南芥植株對低溫的耐受性[32]。在本研究中，高鹽處理下， ZmWRKY55-like基因出現(xiàn)上調(diào)表達，24 h為對照的2.2倍。 ZmWRKY1-like基因在干旱脅迫處理的24 h時表達量下調(diào)為對照的0.4倍。該結(jié)果表明， ZmWRKY1-like和 ZmWRKY21-like基因可能分別參與玉米植株對干旱和鹽脅迫的響應(yīng)。但具體的分子機制仍需要進一步研究分析。

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