傳統(tǒng)推拿“束悗療法”對(duì)糖尿病周?chē)窠?jīng)病變大鼠坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度、超氧化物歧化酶、丙二醛表達(dá)的影響

尚　坤　劉明軍　陳飛騰　李　波　王　蕾　陳林青　李躍宗　張　欣

(長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林　長(zhǎng)春　130117)

“束悗療法”的記載首見(jiàn)于《內(nèi)經(jīng)》，是一種中醫(yī)傳統(tǒng)推拿操作手法〔1〕。該手法選取四肢大血管或大神經(jīng)干走行線路為施術(shù)部位，以手指或手掌按壓局部并停留一定時(shí)間為主要操作手法，然后采用“緩按快放”或“快按緩放”的方式放開(kāi)按壓部位以推動(dòng)局部氣血運(yùn)行，達(dá)到疏通經(jīng)絡(luò)、活血止痛的治療目的。課題組曾在臨床上以“束悗療法”輔助治療糖尿病性周?chē)窠?jīng)病變(DPN)取得滿意療效〔1〕。本研究以傳統(tǒng)推拿“束悗療法”為主要干預(yù)手段，通過(guò)觀察DPN模型大鼠坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度(SNCV)、坐骨神經(jīng)中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)表達(dá)的改善情況開(kāi)展相關(guān)機(jī)制研究。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組選取雄性Wistar大鼠80只，鼠齡8 w，由長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。分籠飼養(yǎng)，每籠10只，食用標(biāo)準(zhǔn)顆粒鼠糧。按完全隨機(jī)設(shè)計(jì)法(隨機(jī)數(shù)字表)將大鼠分為對(duì)照組、模型組、推拿組、藥物組，每組20只。

1.2實(shí)驗(yàn)藥品與試劑鏈脲佐菌素(美國(guó)Sigma公司，1 g/瓶)；彌可保(甲鈷胺注射液，衛(wèi)材中國(guó)藥業(yè)有限公司，500 μg/支)；MDA、SOD試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.3實(shí)驗(yàn)儀器推拿手法測(cè)定儀(TAP-Ⅱ型，上海益聯(lián)醫(yī)學(xué)發(fā)展有限公司)；Medlab-u/4cs生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)(南京美易科技有限公司)；光學(xué)顯微鏡及圖像分析系統(tǒng)(德國(guó)Leica公司)；酶標(biāo)儀(Bio-rad,美國(guó))。

1.4方法

1.4.1動(dòng)物模型的制備取實(shí)驗(yàn)大鼠60只，將鏈脲佐菌素臨用前用pH值4.2～4.5的0.1 mol/L檸檬酸鈉-檸檬酸緩沖液避光條件下配成1%濃度溶液，按劑量50 mg/kg于實(shí)驗(yàn)大鼠左下腹腔內(nèi)單次注射，72 h后取尾血測(cè)血糖，凡血糖>16.7 mmol/L作為糖尿病大鼠。血糖未達(dá)標(biāo)的造模大鼠，補(bǔ)打30 mg/kg 0.1%鏈脲佐菌素，72 h后測(cè)血糖，不足要求則棄去。如此在1 w后血糖仍>16.7 mmol/L，且從形態(tài)上有周?chē)窠?jīng)病變出現(xiàn)，SNCV明顯降低時(shí)，即制成周?chē)窠?jīng)病變模型大鼠。另取實(shí)驗(yàn)大鼠20只，用0.1 mol/L檸檬酸鈉-檸檬酸緩沖液(pH4.2、4℃)按同體積左下腹腔內(nèi)單次注射，72 h后取尾血測(cè)血糖，作為對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)中的模型組、藥物組各死亡2只，推拿組死亡1只。

1.4.2干預(yù)方法①推拿組:將實(shí)驗(yàn)大鼠仰臥，固定其頭部與上肢。施術(shù)者以左手牽拉大鼠一側(cè)下肢，使下肢伸直呈水平位，以右手拇指指腹緩慢按壓于大鼠腹股溝處，力量經(jīng)推拿手法測(cè)試儀測(cè)定約為1 kg，持續(xù)30 s左右，然后突然抬手，停止按壓，即“緩按快放”；間隔60 s左右，再次以右手拇指指腹快速按壓于大鼠腹股溝處，力量經(jīng)推拿手法測(cè)試儀測(cè)定約為1 kg，持續(xù)30 s左右，然后緩慢抬手，停止按壓，即“快按緩放”。如此操作3次。以上治療方法每日早晚操作2次，共治療8 w。②藥物組：將實(shí)驗(yàn)大鼠仰臥，捆綁固定，每日1次，每次10 min。根據(jù)人與動(dòng)物體表面積計(jì)算法換算注射彌可保，大鼠用藥量為50 μg/kg，隔日注射于下肢肌肉，左右腿交替注射，以利于吸收，共治療8 w。③對(duì)照組和模型組:將實(shí)驗(yàn)大鼠仰臥，捆綁固定，每日1次，每次10 min，共8 w。

1.4.3檢測(cè)指標(biāo)及方法將實(shí)驗(yàn)大鼠治療8 w后尾靜脈取血以檢測(cè)血糖。以電子秤稱取每只大鼠體重后，腹腔注射10%水合氯醛(350 mg/kg)進(jìn)行麻醉，將大鼠俯臥固定于固定架上，暴露出坐骨神經(jīng)，用無(wú)菌玻璃剝離器輕輕剝離坐骨神經(jīng)并游離下來(lái)，應(yīng)用生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)，測(cè)得SNCV，然后迅速將坐骨神經(jīng)放入液氮中，放入-70℃冰箱中存放，以備勻漿。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS17.0軟件進(jìn)行方差分析、秩和檢驗(yàn)。

2　結(jié)　果

2.1各組SNCV比較與對(duì)照組SNCV〔(35.47±2.65)m/s〕比較、模型組SNCV明顯降低〔(25.66±2.84)m/s〕(P<0.01)，證明實(shí)驗(yàn)造模成功。與模型組比較，推拿組SNCV明顯增加〔(33.82±2.29)m/s〕(P<0.01)，藥物組也明顯增加〔(32.17±2.73)m/s〕(P<0.01)，提示推拿“束悗療法”和藥物療法能夠有效改善DPN大鼠SNCV；推拿組與藥物組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2各組坐骨神經(jīng)SOD、MDA水平比較與對(duì)照組比較，坐骨神經(jīng)SOD水平顯著降低、MDA水平顯著增高(P<0.01)，證明實(shí)驗(yàn)造模成功。與模型組比較，推拿組坐骨神經(jīng)SOD水平顯著增加、MDA水平顯著降低(P<0.01)，與模型組比較，藥物組坐骨神經(jīng)SOD、MDA水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1　各組坐骨神經(jīng)SOD、MDA表達(dá)比較

與對(duì)照組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與模型組比較：3)P<0.01

3　討　論

“束悗療法”是一種中醫(yī)傳統(tǒng)推拿操作手法〔1〕，其最早記載見(jiàn)于《內(nèi)經(jīng)》。在《靈樞·雜病篇》中記載：“痿厥為四末束悗，乃疾解之，日二，不仁者，十日而知，無(wú)休。病已止?！敝饕囊馑际窃谥委燄糌拾Y病人時(shí)，將患者四肢捆綁起來(lái)，待其產(chǎn)生憋悶脹痛感覺(jué)后，迅速解開(kāi)，每天治療2次，原本四肢沒(méi)有知覺(jué)的患者在治療10 d之后就會(huì)產(chǎn)生知覺(jué)，這種治療方法不要停止，直到患者痊愈為止?？梢?jiàn)，“束悗療法”中的“束”，意為約束，束縛；“悗”，《辭海》解釋為“煩悶”，《靈樞·五亂》中記載有“清濁相干，亂于胸中，是謂大悗”。由此引申束悗具有約束阻滯之意?！鹅`樞集注》中曾批注“夫按之束之，皆導(dǎo)引之法，猶尺蠖之欲伸而先屈也”。可見(jiàn)，在治療氣機(jī)不暢、麻痹不仁的病癥時(shí)，可以在四肢脈位運(yùn)用束悗按抑的手法，達(dá)到通郁開(kāi)閉、導(dǎo)氣通達(dá)的治療目的。然而，現(xiàn)代推拿臨床中，源于中醫(yī)傳統(tǒng)古籍的束悗療法卻鮮有應(yīng)用，僅散見(jiàn)于個(gè)別理論性的文獻(xiàn)探討中〔2〕。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，DPN的病理表現(xiàn)一是營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)的血管出現(xiàn)病變，表現(xiàn)為毛細(xì)血管的內(nèi)皮細(xì)胞增生或基底膜增厚；二是神經(jīng)本身出現(xiàn)病變，主要表現(xiàn)為神經(jīng)纖維軸索的損傷或構(gòu)成髓鞘或神經(jīng)內(nèi)膜的施萬(wàn)細(xì)胞的變性壞死〔3，4〕。中醫(yī)則認(rèn)為，DPN屬于“痹證”、“痿證”之范疇，多由于氣虛失運(yùn)、血虛不榮、痰瘀阻滯或風(fēng)濕痹阻等原因?qū)е戮植垦骶徛?，瘀阻脈道，皮肉經(jīng)脈失去氣血濡養(yǎng)而痿廢不用〔5，6〕。這與DPN所表現(xiàn)出來(lái)的臨床癥狀是相吻合的。課題組在也曾在臨床上以“束悗療法”輔助治療DPN并取得滿意療效〔1〕。

鏈脲佐菌素是一種廣譜抗菌素，不但具有抗菌、抗腫瘤的功效，還由于其對(duì)胰島β細(xì)胞高度選擇性的毒性作用而具有致糖尿病的副作用〔7～9〕。同時(shí)，由于鏈脲佐菌素對(duì)組織毒性相對(duì)較小，動(dòng)物存活率高，是國(guó)內(nèi)外經(jīng)常使用的制備糖尿病動(dòng)物模型的成熟方法。神經(jīng)電生理檢查是早期診斷DPN的敏感指標(biāo)，神經(jīng)傳導(dǎo)速度減慢是糖尿病出現(xiàn)神經(jīng)病變的一個(gè)先兆，常常用于評(píng)價(jià)臨床療效與預(yù)后情況。

有研究表明，當(dāng)機(jī)體出現(xiàn)高血糖后，高糖引起線粒體中的超氧陰離子增多，誘發(fā)周?chē)?xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激，最終造成糖尿病的各種慢性并發(fā)癥〔10〕。自由基是反映機(jī)體氧化應(yīng)激的直接指標(biāo)，但是自由基具有短瞬即逝的特性，實(shí)驗(yàn)中難以測(cè)定。但是一些蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和DNA自由基損傷的終產(chǎn)物作為反映氧化應(yīng)激的可靠指標(biāo)和間接指標(biāo)則能夠檢測(cè)到。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化的最終產(chǎn)物，其在坐骨神經(jīng)中表達(dá)的高低能夠反映出脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的程度，也反映出機(jī)體細(xì)胞受到自由基攻擊的嚴(yán)重程度；SOD是機(jī)體細(xì)胞內(nèi)部重要的自由基清除酶，其表達(dá)的高低直接反映了機(jī)體清除自由基的能力〔11，12〕。因此，神經(jīng)組織內(nèi)MDA、SOD表達(dá)的高低能夠直接反映神經(jīng)組織損傷及修復(fù)狀態(tài)。

本研究發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)推拿“束悗療法”能夠有效改善DPN大鼠模型下肢SNVC，表明對(duì)周?chē)窠?jīng)功能恢復(fù)具有有效的促進(jìn)作用；同時(shí)“束悗療法”能夠提高坐骨神經(jīng)中SOD的表達(dá)，降低MDA的表達(dá)，表明具有抗氧化的作用從而發(fā)揮保護(hù)坐骨神經(jīng)形態(tài)功能的療效。

1劉鵬,張燕,李躍宗.“束悗療法”治療糖尿病性周?chē)窠?jīng)病變〔J〕.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2013;29(5):880-1.

2曠時(shí)恩,曠晉.束悗療法在傷病治療的臨床應(yīng)用〔J〕.中華推拿療法雜志,2004;2(4):15-6.

3沈薇,董繼宏,汪聽(tīng).糖尿病周?chē)窠?jīng)病的發(fā)病機(jī)制及治療展望〔J〕.中國(guó)臨床神經(jīng)科學(xué),2008;16(2):204-7.

4Laybutt DR,Kaneto H,Hasenkam PW,etal.Increased expression of antioxidant and antiapoptotic genes in islets that may contribute top-cell survival during chronic hyperglycemia〔J〕.Diabetes,2002;51(2):413-23.

5逄紫千,謝占峰,閻慧.針刺對(duì)糖尿病周?chē)窠?jīng)病變大鼠尾神經(jīng)超微結(jié)構(gòu)的影響〔J〕.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2011;27(4):523-5.

6逄紫千,閻慧,解占峰.針刺對(duì)糖尿病周?chē)窠?jīng)病變大鼠坐骨神經(jīng)組織病理學(xué)的影響〔J〕.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2012;28(4):594-6.

7Raekietan N,Raekietan ML,Nadkarni MR.Studies on diabetogenic action of Stre-Ptozotoein(NSC-37917)〔J〕.Cancer Chemother Rep,1963;29:91-8.

8于德民,吳銳,尹雑,等.實(shí)驗(yàn)性鏈脲佐菌素糖尿病動(dòng)物模型的研究〔J〕.中國(guó)糖尿病雜志,1995;3(2):105-9.

9黃繼漢,黃曉陣,陳志揚(yáng),等.藥理試驗(yàn)中動(dòng)物間和動(dòng)物與人體間的等效劑量換算〔J〕.中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué),2004;9(9):1069-72.

10Brownlee M.The pathobiology of diabetic complieations:a unifying methanism〔J〕.Diabeties,2005;54(6):1615-25.

11Ceriello A,Bortolotti N,Falleti E,etal.Total radicaltrapping antioxidant parameter in NIDDM,patients〔J〕.Diabetes Care,1997;20:194-7.

12Blaszczak R,Klljawski K,Kedziora-Kornatowska K,etal.The total antioxidant capacity and low-molecular antioxidant concentration in plasma of type-2 diabetes patients with different stage of metabolic compensation and concomitant diabetic nephropathy〔J〕.Pol Merkuriusz Lek,2005;18(103):29-32.