大黃提取物對(duì)急性胰腺炎模型大鼠的治療作用及機(jī)制

曹硯杰　李琨琨　靳　莉　吳慧麗

(鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院消化內(nèi)科，河南　鄭州　450007)

大黃是我國(guó)著名特產(chǎn)藥材，其單味或組方常用于治療急性胰腺炎、膽囊炎、結(jié)腸炎、消化道出血、肝炎、急性扁桃體炎及出血癥等。研究發(fā)現(xiàn)，大黃提取物可改變急性胰腺對(duì)其他其器官的炎癥反應(yīng)，減輕肺組織、肝組織的充血、水腫等炎性反應(yīng)〔1〕。體外實(shí)驗(yàn)證明，大黃提取物對(duì)胰腺腺泡細(xì)胞損傷具有一定的保護(hù)效果〔2〕。本實(shí)驗(yàn)采用逆行胰膽管注射牛磺膽酸鈉溶液的方法建立大鼠急性胰腺炎模型，并灌胃不同劑量的大黃提取物，觀察大鼠血清中血淀粉酶(AMS)、白細(xì)胞介素(IL)-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α，胰腺組織中超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)的水平及單核細(xì)胞趨化蛋白(MCP)-1和巨噬細(xì)胞炎性蛋白(MIP)-2的表達(dá)，并觀察胰腺組織病理學(xué)變化。

1　材料和方法

1.1材料、藥品與試劑SPF級(jí)SD大鼠60只，體質(zhì)量220～250 g，購(gòu)于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK(粵)2013-0002，合格證書(shū)號(hào)：2008A056。自由飲水、標(biāo)準(zhǔn)飼料，購(gòu)回后適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。大黃提取物(南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司)；牛磺膽酸鈉(美國(guó)Sigma 公司)；甲磺酸加貝酯(美國(guó) AEMZO 公司)；AMS、IL-6、TNF-α(美國(guó) ADL 公司)；MCP-1、MIP-2(Santa Cruz Biotechnology,Inc)；SOD、MDA(南京建成)；3K18型低溫高速離心機(jī)(美國(guó)Sigma 公司)；VORTEX-GENIUS3 型渦旋振蕩器(德國(guó)IKA 公司)；CH30型光學(xué)顯微鏡(日本Olympus 公司)；GB11240-89型電熱恒溫水浴鍋(北京市醫(yī)療設(shè)備意成公司)；ELX800全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國(guó)伯騰儀器有限公司)。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與模型制作SD大鼠隨機(jī)分為正常組，模型組，陽(yáng)性藥組，大黃提取物低、中、高劑量組，每組10只。除正常組外，采用逆行胰膽管注射 5%?；悄懰徕c溶液(1 ml/kg)建立急性胰腺炎大鼠模型，造模30 min后，大黃提取物低、中、高劑量組分別給予0.25、0.50、1.00 g/kg灌胃，正常組和模型組給予1.0 g·kg-1·d-1生理鹽水灌胃，陽(yáng)性藥組給予腹腔注射甲磺酸加貝酯10 mg/kg。分別于給藥12 h后乙醚麻醉，眼內(nèi)眥取血離心取血清，之后處死大鼠摘取胰腺組織，部分組織置入10%中性甲醛緩沖液固定。其余胰腺組織分裝于離心管中-80℃冰箱保存。

1.3胰腺組織學(xué)觀察取胰腺頭部組織置于10%甲醛溶液中進(jìn)行固定，石蠟包埋、切片，常規(guī)蘇木素-伊紅(HE)染色，置于顯微鏡下觀察組織病理學(xué)變化。

1.4血清中AMS、IL-6、TNF-α含量測(cè)定各組大鼠眼內(nèi)眶取血，低溫條件下5 000 r/min離心10 min，取上層血清，用于測(cè)定AMS、IL-6、TNF-α含量，檢測(cè)方法按照各試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.5胰腺組織SOD及MDA的測(cè)定取部分胰腺組織，沖洗干凈，吸水紙吸干，稱重，置入10 ml離心管內(nèi)，加入適量生理鹽水，勻漿制成10%的組織勻漿，4℃ 3 500 r/min離心10 min，取上清液測(cè)定SOD、MDA 的活性。各指標(biāo)測(cè)定嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.6Western印跡法檢測(cè)胰腺組織中MCP-1和MIP-2蛋白表達(dá)取胰腺組織裂解后，利用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)，采用濕轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)膜方式進(jìn)行電泳，測(cè)定胰腺組織中MCP-1和MIP-2的蛋白表達(dá)。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS17.0軟件行單因素方差分析。

2　結(jié)　果

2.1胰腺組織病理學(xué)檢查正常組大鼠胰腺組織小葉結(jié)構(gòu)完整，邊緣清晰，形態(tài)正常，無(wú)水腫，未見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，腺泡結(jié)構(gòu)完整，輪廓清晰，胞質(zhì)和核仁著色清晰可見(jiàn)。模型組大鼠胰腺組織小葉結(jié)構(gòu)較紊亂不整齊，間隔距離明顯增大，存在大量壞死細(xì)胞，可見(jiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，腺泡水腫及破裂，核仁固縮，出血點(diǎn)較多，有大量紅細(xì)胞滲出。陽(yáng)性藥組胰腺組織小葉結(jié)構(gòu)相對(duì)紊亂，腺泡出現(xiàn)輕微水腫，存在少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，出血點(diǎn)比較少。大黃提取物各劑量組大鼠胰腺組織小葉結(jié)構(gòu)相對(duì)整齊，腺體結(jié)構(gòu)輕微紊亂，腺泡輕微水腫，有少量的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，出血點(diǎn)少，有少量的紅細(xì)胞滲出；與模型組相比，胰腺水腫、炎癥浸潤(rùn)、出血點(diǎn)及充血方面顯著減輕。見(jiàn)圖1。

2.2大黃提取物對(duì)血清中AMS、IL-6、TNF-α活性的影響與正常組相比，模型組血清AMS、IL-6、TNF-α水平顯著升高(P<0.01)；陽(yáng)性藥組血清AMS、IL-6、TNF-α水平均較模型組明顯降低(P<0.01)；與模型組相比，大黃提取物低、中、高劑量組血清中AMS、IL-6、TNF-α水平顯著降低(P<0.01)。見(jiàn)表1。

2.3大黃提取物對(duì)胰腺組織中SOD及MDA含量的影響與正常組相比，模型組胰腺組織SOD含量明顯降低(P<0.01)；與模型組相比，大黃提取物低、中、高劑量組SOD均有明顯升高(P<0.05或P<0.01)，不同的大黃提取物組間有一定的量-效關(guān)系趨勢(shì)，但中劑量與高劑量組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與正常組相比，模型組胰腺組織MDA含量顯著升高(P<0.01)；與模型組相比，大黃提取物低、中、高劑量組MDA均有明顯降低(P<0.01)；與陽(yáng)性藥組相比，低、中劑量組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，高劑量組降低更明顯(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表1　各組血清AMS、IL-6、TNF-α活性比較

與正常組比較:1)P<0.01；與模型組比較:2)P<0.01

2.4大黃提取物對(duì)胰腺組織中MCP-1和MIP-2蛋白表達(dá)的影響與正常組相比，模型組胰腺組織中MCP-1、MIP-2表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，大黃提取物低、中、高劑量組MCP-1、MIP-2表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05)，而正常組和陽(yáng)性藥組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖2。

表2　各組胰腺組織SOD、MDA含量的比較

與正常組比較: 1)P<0.01；與模型組比較: 2)P<0.05,3)P<0.01

1～6：正常組，陽(yáng)性藥組，模型組，提取物低劑量組，提取物中劑量組，提取物高劑量組圖2　胰腺組織中MCP-1、MIP-2蛋白表達(dá)比較

3　討　論

急性胰腺炎是臨床常見(jiàn)的一種急腹癥，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，具有很高的發(fā)病率，其發(fā)病急、病情發(fā)展兇險(xiǎn)，嚴(yán)重者可發(fā)展為重癥急性胰腺炎，甚至多器官衰竭，死亡率高達(dá)5%～13.6%〔3〕。研究表明，多種炎癥因子參與了早期急性胰腺炎的病理發(fā)展過(guò)程。早期急性胰腺炎引發(fā)多種炎癥介質(zhì)釋放入血，引發(fā)急性炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致腸黏膜屏障功能受損，使胰腺及胰腺外壞死組織內(nèi)細(xì)菌和內(nèi)毒素增加，壞死組織被感染，引起多種趨化因子、炎癥因子等大量釋放，過(guò)度激活中性粒細(xì)胞，導(dǎo)致胰腺水腫、出血、壞死，最終發(fā)展成嚴(yán)重的全身炎癥反應(yīng)綜合征〔4〕。大量實(shí)驗(yàn)研究表明〔5～7〕，逆行胰膽管注射?；悄懰徕c法建立急性胰腺炎大鼠模型在研究中應(yīng)用最廣泛，模型反應(yīng)與人類相似，而且操作簡(jiǎn)單易行，重復(fù)性好。本研究結(jié)果也說(shuō)明急性胰腺炎模型復(fù)制成功。AMS是診斷急性胰腺炎常用的生化指標(biāo)，可以反映急性胰腺炎的治療效果。IL-6 和TNF-α是促炎癥細(xì)胞因子，在急性胰腺炎早期，體內(nèi) IL-6、TNF-α等水平明顯升高，其與多種細(xì)胞相互作用，引起胰腺組織損傷〔8〕。SOD是脂質(zhì)氧化過(guò)程中形成的脂質(zhì)過(guò)氧化物，能夠清除氧自由基，過(guò)量的氧自由基會(huì)導(dǎo)致MDA含量升高，二者同樣是檢測(cè)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵指標(biāo)〔9〕。研究證明，機(jī)體分泌適量的TNF-α可發(fā)揮免疫調(diào)控、抗感染等效果，而過(guò)多分泌或分泌失控時(shí)反而會(huì)刺激炎癥細(xì)胞產(chǎn)生多種促炎癥因子和氧自由基，進(jìn)一步引起膿毒血癥和感染〔10，11〕。因此，調(diào)節(jié)促炎性細(xì)胞因子的水平是控制急性胰腺炎病情進(jìn)展的重要手段。本研究結(jié)果說(shuō)明大黃提取物能通過(guò)抑制IL-6和TNF-α等促炎癥因子的釋放，對(duì)急性胰腺炎大鼠炎癥反應(yīng)起到一定程度的緩解作用。

炎癥反應(yīng)過(guò)程會(huì)引起中性粒細(xì)胞在炎癥區(qū)域聚集，期間伴有許多趨化因子，后期修復(fù)過(guò)程中趨化因子起重要的作用。MCP-1屬于趨化因子 CC β亞家族，對(duì)單核巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞能夠高度特異性的趨化和啟動(dòng)，參與機(jī)體免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)；MIP-2是CXC 趨化因子超家族成員〔12～14〕。本實(shí)驗(yàn)說(shuō)明大黃提取物可早期控制炎癥進(jìn)程，避免炎癥反應(yīng)進(jìn)一步發(fā)展。

本研究結(jié)果提示，大黃提取物對(duì)急性胰腺炎大鼠具有一定的治療作用，并能減輕炎性反應(yīng)，降低血清中促炎癥因子IL-6、TNF-α水平和AMS活力，增加胰腺組織中SOD活力，降低組織中MDA含量，同時(shí)下調(diào)MCP-1、MIP-2 蛋白表達(dá)水平，控制早期炎癥進(jìn)程，避免急性胰腺炎進(jìn)一步發(fā)展。

1周黎明.大黃素作用于大鼠重癥急性胰腺炎的分子機(jī)理研究〔D〕.成都:四川大學(xué),2006:6-8.

2張桂信.膽汁酸對(duì)胰腺腺泡細(xì)胞的損傷與大黃素調(diào)節(jié)作用的實(shí)驗(yàn)研究〔D〕.大連：大連醫(yī)科大學(xué)，2009：6-9.

3王春友,楊明.《急性胰腺炎診治指南(2014)》解讀——急性胰腺炎外科診治現(xiàn)狀與進(jìn)展〔J〕.中國(guó)實(shí)用外科雜志,2015;1(1):8-10.

4Staubli SM,Oertli D,Nebiker CA.Laboratory markers predicting severity of acute pancreatitis 〔J〕.Crit Rev Clin Lab Sci,2015;52(6):273-83.

5Voskanyan SE,Kotenko KV,Korsakov IN,etal.Prediction of the acute pancreatitis after surgery on the pancreas〔J〕.Eksp Klin Gastroenterol,2014;(9):61-8.

6劉大晟,吳先林,李接興,等.三種不同造模方法建立大鼠急性胰腺炎模型的對(duì)比〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志,2016;36(10):2315-8.

7張芬,楊柳,王浩,等.急性胰腺炎的研究進(jìn)展〔J〕.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2016;5(15):2983-6.

8Qin Y,Li S,Zhao G,etal.Long-term intravenous administration of carboxylated single-walled carbon nanotubes induces persistent accumulation in the lungs and pulmonary fibrosis via the nuclear factor-kappa B pathway〔J〕.Int J Nanomedicine,2016;30(12):263-77.

9Polimeni M,Gulino GR,Gazzano E,etal.Multi-walled carbon nanotubes directly induce epithelial-mesenchymal transition in human bronchial epithelial cells via the TGF-β-mediated Akt/GSK-3β/SNAIL-1 signalling pathway〔J〕.Part Fibre Toxicol,2016;13(1):27.

10Faustmann G,Tiran B,Maimari T,etal.Circulating leptin and NF-κB activation in peripheral blood mononuclear cells across the menstrual cycle〔J〕.Biofactors,2016;42(4):376-87.

11Turkyilmaz S,Usta A,Cekic AB,etal.N-acetylcysteine amid reduces pancreatic damage in a rat model of acute necrotizing pancreatitis〔J〕.J Surg Res,2016;203(2):383-9.

12Zhao X,Zhang Y,Li J,etal.Tissue pharmacology of Da-Cheng-Qi Decoction in experimental acute pancreatitis in rats〔J〕.Evid Based Complement Alternat Med,2015;2015:283175.

13Liu M,Shi L,Zou X,etal.Caspase inhibitor zVAD-fmk protects against acute pancreatitis-associated lung injury via inhibiting inflammation and apoptosis〔J〕.Pancreatology,2016;16(5):733-8.

14Liang X,Zhang B,Chen Q,etal.The mechanism underlying alpinetin-mediated alleviation of pancreatitis-associated lung injurythrough upregulating aquaporin-1〔J〕.Drug Des Devel Ther,2016;10:841-50.