鹽芥ThPHT1;8基因的克隆和功能分析

楊少輝，李?爽，寇瑩瑩，王潔華，宋英今，關(guān)春峰

?

鹽芥ThPHT1;8基因的克隆和功能分析

楊少輝，李?爽，寇瑩瑩，王潔華，宋英今，關(guān)春峰

(天津大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300350)

磷(P)是植物生長發(fā)育過程中重要的礦質(zhì)營養(yǎng)元素之一，PHT1磷酸轉(zhuǎn)運蛋白家族負(fù)責(zé)調(diào)控植物從土壤中吸收磷以及細(xì)胞間無機(jī)磷(Pi)的轉(zhuǎn)運．本文以鹽芥幼苗根cDNA為材料，克隆到鹽芥磷酸轉(zhuǎn)運蛋白ThPHT1;8基因．生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，ThPHT1;8蛋白編碼525個氨基酸殘基，蛋白分子質(zhì)量為58.1,ku，等電點6.33，是一個定位在細(xì)胞膜上的疏水、無信號肽的非分泌性蛋白，含有高親和力磷酸轉(zhuǎn)運蛋白典型的跨膜結(jié)構(gòu)．實時定量PCR結(jié)果顯示，低磷脅迫能促進(jìn)ThPHT1;8基因在鹽芥根部的表達(dá)，而且不同磷濃度處理下ThPHT1;8基因表達(dá)的模式不同．ThPHT1;8基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥中的生物學(xué)功能研究表明，不同濃度低磷脅迫處理下，與野生型擬南芥相比，35S：ThPHT1;8轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗的主根根長顯著增加、側(cè)根密度顯著降低，葉綠素含量、無機(jī)磷和總磷含量提高，花青素含量降低．上述結(jié)果表明，鹽芥ThPHT1;8基因確實參與低磷脅迫時植物的應(yīng)答，能夠提高轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐低磷能力，為土壤磷高效利用提供了一種有潛力的候選功能基因．

鹽芥；磷酸轉(zhuǎn)運蛋白；生物信息學(xué)；ThPHT1;8基因

磷是構(gòu)成許多生命大分子物質(zhì)(如核酸、磷脂，ATP等)的重要結(jié)構(gòu)組分，是植物生長發(fā)育過程中不可缺少的礦物元素，在酶促反應(yīng)、能量轉(zhuǎn)移、物質(zhì)代謝等多個過程中起著重要作用[1]．近年來，地球上的磷礦資源逐年減少，而且磷在土壤中的存在形式大多為難溶性磷和有機(jī)態(tài)磷[2]，可被植物吸收利用的有效磷濃度很低．農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，磷肥的過度使用不僅造成土壤中難溶性磷的進(jìn)一步積累，且土壤磷流入水體后導(dǎo)致水體富營養(yǎng)化，帶來一系列生態(tài)環(huán)境問題[3].因此，挖掘促進(jìn)磷高效吸收的基因資源，探討植物高效吸收磷素的分子機(jī)制，提高低磷條件下植物吸收磷素的能力，具有重要的生態(tài)和經(jīng)濟(jì)價值．

磷酸轉(zhuǎn)運蛋白是植物吸收磷的主要介質(zhì)，植物通過磷酸轉(zhuǎn)運蛋白將外界無機(jī)形式的磷轉(zhuǎn)為能夠被植物吸收和利用的有效磷．近年來，國內(nèi)外學(xué)者開展了一系列關(guān)于磷酸轉(zhuǎn)運蛋白基因的克隆和表達(dá)調(diào)控的研究，為了解植物體內(nèi)磷的吸收和轉(zhuǎn)運過程奠定了分子基礎(chǔ)[4]．在生物體中，磷酸轉(zhuǎn)運蛋白可被分為PHT和PHO兩大類，PHO是PHT的突變體[5]．自1996年，Muchhal等首次以酵母的磷酸轉(zhuǎn)運蛋白基因為探針，在擬南芥中克隆到兩個磷酸轉(zhuǎn)運蛋白基因以來，數(shù)十個編碼磷酸轉(zhuǎn)運蛋白的基因家族成員陸續(xù)從番茄、煙草、水稻等多種植物中克隆得到[6-9].根據(jù)環(huán)境等介質(zhì)中磷濃度的不同，磷酸轉(zhuǎn)運蛋白被分為低親和力系統(tǒng)、高親和力系統(tǒng)兩大類，其中PHT1家族為高親和力轉(zhuǎn)運蛋白，PHT2家族為低親和力轉(zhuǎn)運蛋白．基因家族中的很多成員，如擬南芥、、、油菜和水稻等，在植物體內(nèi)的表達(dá)模式及其對植物磷吸收的影響已被報道[10-13]．

鹽芥()，雙子葉綱、十字花科草本，擬南芥的近緣植物，具有株型小、生活周期短、基因組小、cDNA序列與擬南芥相似程度高等優(yōu)點．又由于其具有很強(qiáng)的耐鹽、耐旱性，并且對冷害、低氮、低磷等逆境脅迫也有較高的耐受能力[14]，因此已逐漸成為研究非生物脅迫響應(yīng)的模式植物．目前，對鹽芥耐低磷的研究還很少，主要涉及低磷脅迫下植株的生理響應(yīng)及耐低磷相關(guān)基因的表達(dá)模式[15-17]，而對鹽芥磷轉(zhuǎn)運蛋白基因家族的研究鮮見報道．本研究從鹽芥中克隆了一個與擬南芥高親和力磷酸轉(zhuǎn)運蛋白基因同源性最高磷酸轉(zhuǎn)運蛋白基因，命名為，利用生物信息學(xué)方法對ThPHT1；8蛋白的理化性質(zhì)、疏水性及跨膜結(jié)構(gòu)等方面進(jìn)行了預(yù)測與分析，通過實時定量PCR和轉(zhuǎn)基因擬南芥，進(jìn)一步研究鹽芥基因在低磷脅迫下的表達(dá)模式及對轉(zhuǎn)基因植物磷吸收能力的調(diào)控作用．

1?材料與方法

1.1?材料

大腸桿菌()DH5α、根瘤農(nóng)桿菌()C58、載體pBI121由本實驗室保存．CloneJET PCR Cloning Kit購自Thermo公司，ClonExpress? II One Step Cloning Kit購自Vazyme公司，其他分子生物學(xué)試劑均購自Takara公司，組織無機(jī)磷和總磷含量測定試劑盒購自索萊寶公司，引物合成及DNA測序均由華大生物公司完成．

鹽芥和擬南芥()Col-0由本實驗室保存．培養(yǎng)條件為溫度(22±2)℃，光周期為16,h光照/8,h黑暗，光強(qiáng)6,000,lx．

參照Feng等[13]的方法，以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，配制磷濃度為0,μmol/L、50,μmol/L和500,μmol/L的1/2MS培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中減少的鉀離子由K2SO4補(bǔ)充．

1.2?基因的克隆與過表達(dá)載體構(gòu)建

在Phytozome v 11數(shù)據(jù)庫(https：//phytozome. Jgi. Doe. gov/pz/portal．html)中獲得基因的序列，利用Primer 5.0軟件設(shè)計基因的克隆引物1,F/1,R．利用RNA試劑盒提取鹽芥幼苗根的總RNA，Nanodrop和瓊脂糖凝膠電泳測定RNA濃度和質(zhì)量．以O(shè)ligo(dT)為引物，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，并以此為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增．20,μL反應(yīng)體系包括：-1,F和-1,R各0.8,μL，2×Taq Master Mix 10,μL，H2O 6.4,μL，DNA 2,μL．反應(yīng)程序：95,℃預(yù)變性5,min，95,℃變性30,s，58,℃退火30,s，72,℃延伸2.5,min，變性-退火-延伸為1個循環(huán)，連續(xù)35個循環(huán)，然后在72,℃延伸10,min．

擴(kuò)增產(chǎn)物純化回收后，利用CloneJET PCR Cloning Kit獲得克隆載體pJet1.2-Thpht1；8，測序正確后，利用ClonExpress? II One Step Cloning Kit，參照產(chǎn)品說明書，將基因片段與pBI121載體片段進(jìn)行重組連接．連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5a，經(jīng)抗生素篩選和菌落PCR驗證，最終獲得由35,S啟動子驅(qū)動的植物過量表達(dá)載體pBI121-ThPHT1；8．

1.3?生物信息學(xué)分析

利用克隆得到的ThPHT1；8蛋白序列，在NCBI數(shù)據(jù)庫中搜索與其相似度較高的磷酸轉(zhuǎn)運蛋白序列，利用CLUSTAL X 2.1軟件和MEGA 6.0軟件進(jìn)行多重比對并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，對得到的系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行2,000次抽樣的自展法(Bootstrap)校正[18-19]．利用ProtParam程序(http//expasy.org/tools/protparam.html)分析ThPHT1；8蛋白的理化性質(zhì)[20-21]，利用SignalP 4.1(http://www.Cbs.dtu.dk/services/SignalP/)和TMHMM v.2.0(http：//www.Cbs.Dtu.dk/services/TMHMM/)在線分析信號肽序列和跨膜區(qū)域[22-23]，利用WoLF PSORT (http://wolfpsort.seq.cbrc.jp)和PHYRE 2(http://www. sbg.bio.ic.ac.uk/phyre)服務(wù)器分別進(jìn)行ThPHT1；8蛋白的亞細(xì)胞定位和3級結(jié)構(gòu)預(yù)測[24]．

1.4?ThPHT1；8基因在不同磷濃度處理下的表達(dá)分析

鹽芥種子消毒后置于4,℃冰箱中春化15,d，然后點在1/2,MS(磷濃度為625,μmol/L)固體培養(yǎng)基上，光照培養(yǎng)箱中垂直培養(yǎng)6,d．選取長勢相同的幼苗，分別移到磷濃度為0,μmol/L、50,μmol/L、500,μmol/L的磷處理培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)．分別在處理12,h、24,h、48,h、3,d和7,d時，提取鹽芥根部RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA．

以作為內(nèi)參基因，進(jìn)行實時定量PCR分析．的定量引物2,F/2,R，的定量引物3,F/3,R．10,μL反應(yīng)體系包括：上下游引物各0.3,μL，2×SYBR Green Real Master Mix 5,μL，H2O 2.4,μL，cDNA 2,μL．在PikoReal software軟件中設(shè)置反應(yīng)程序為：95,℃，3,min；45個循環(huán)(95,℃，20,s；58,℃，20,s；72,℃，30,s)；72,℃，30,s．

表1?引物序列

Tab.1?Primersequence

1.5?擬南芥的轉(zhuǎn)化及陽性苗的鑒定

構(gòu)建好的表達(dá)載體pBI121-ThPHT1；8通過電擊法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌C58感受態(tài)細(xì)胞，菌落PCR鑒定為陽性的農(nóng)桿菌通過浸花法轉(zhuǎn)化擬南芥．T1代轉(zhuǎn)基因擬南芥的種子在含50,μmol/L卡那霉素的1/2,MS固體培養(yǎng)基上進(jìn)行抗性篩選，提取抗性苗的基因組DNA，利用克隆引物1,F/1,R進(jìn)行PCR鑒定．收獲T1代PCR陽性苗的種子，經(jīng)T2代繁殖及抗性篩選最終得到轉(zhuǎn)基因的T3代純合體．

1.6?過量表達(dá)ThPHT1;8對擬南芥的影響

轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生型對種子消毒后，4,℃春化3～4,d，平鋪在1/2,MS(磷濃度為625,μmol/L)平板上，光照培養(yǎng)箱中垂直培養(yǎng)5,d．選取長勢相同的幼苗，分別移到磷濃度為0,μmol/L、50,μmol/L、500,μmol/L的磷處理培養(yǎng)基和1/2,MS對照培養(yǎng)基上垂直培養(yǎng)．5,d后取不同處理的植物葉片，參照Carter等[25]的方法進(jìn)行葉綠素含量的測定，花青素含量的測定方法參照胡可等[26]的方法，葉片總磷、無機(jī)磷和有機(jī)磷含量的測定參照試劑盒說明書操作．

2?結(jié)果與分析

2.1?鹽芥磷酸轉(zhuǎn)運蛋白基因的克隆

根據(jù)Phytozome v 11數(shù)據(jù)庫的查詢結(jié)果可知，鹽芥基因的基因組DNA序列全長為2,544,bp，在686,bp后有1個966,bp的內(nèi)含子序列，CDS序列全長1,578,bp．以鹽芥幼苗根的cDNA為模板，-1,F和-1,R為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增．瓊脂糖凝膠電泳顯示，獲得清晰、單一、大小約為1,600,bp左右的條帶(見圖1(a))．PCR產(chǎn)物構(gòu)建克隆載體pJet1.2-ThPHT1；8后，DNA測序結(jié)果顯示，擴(kuò)增產(chǎn)物長1,578,bp，編碼525個氨基酸殘基，與數(shù)據(jù)庫中基因的CDS序列一致.經(jīng)比對，該序列與擬南芥高親和力磷酸轉(zhuǎn)運蛋白基因同源性最高(80.78%,)．因此，確定克隆得到鹽芥的磷酸轉(zhuǎn)運蛋白基因，命名為.

圖1 ThPHT1；8基因的克隆和pBI121-ThPHT1；8表達(dá)載體的鑒定

利用ClonExpress? II One Step Cloning Kit，將基因片段與pBI121載體片段進(jìn)行重組，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5a，經(jīng)抗生素篩選和菌落PCR驗證(見圖1(b))，最終獲得植物表達(dá)載體pBI121-ThPHT1；8．

2.2?生物信息學(xué)分析

為了研究鹽芥ThPHT1；8與其他物種磷酸轉(zhuǎn)運蛋白的進(jìn)化關(guān)系，對ThPHT1；8蛋白與相似度較高的序列進(jìn)行了系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建，由圖2(a)可以看出，ThPHT1；8蛋白與油菜()、蘿卜()和蕪菁()的高親和力磷酸轉(zhuǎn)運蛋白PHT1；8親緣關(guān)系最近；與擬南芥、天藍(lán)遏藍(lán)菜()和亞麻薺()的高親和力磷酸轉(zhuǎn)運蛋白PHT1；8同源性也較近．利用ProtParam程序?qū)}芥基因所編碼的蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)分析，結(jié)果表明，ThPHT1；8蛋白分子質(zhì)量為58.1,ku，等電點為6.33；該蛋白質(zhì)由525個氨基酸殘基組成，其中正電荷氨基酸殘基數(shù)45個，遠(yuǎn)大于負(fù)電荷氨基酸殘基數(shù)，不穩(wěn)定系數(shù)為39.78，總平均親水指數(shù)GRAVY為0.348(GRAVY大于0表明蛋白為疏水蛋白)，表明ThPHT1；8蛋白是一種較穩(wěn)定的疏水性蛋白質(zhì)．

信號肽可以引導(dǎo)分泌性蛋白進(jìn)入其他細(xì)胞并使功能，對蛋白質(zhì)分泌過程非常重要．SignalP 4.1,Server分析的結(jié)果(見圖2(b))表明，ThPHT1；8蛋白不具有信號肽序列，是非分泌蛋白．利用TMHMM Server v.2.0對ThPHT1；8蛋白進(jìn)行跨膜區(qū)域預(yù)測分析，該基因編碼525個氨基酸序列，共含有12個跨膜螺旋區(qū)(見圖2(c))，在第6個和第7個跨膜區(qū)之間有一個親水性電荷區(qū)，該預(yù)測結(jié)果與已報道的其他物種PHT1蛋白家族跨膜結(jié)構(gòu)一致[27]，因此推斷鹽芥ThPHT1；8是高親和力磷酸轉(zhuǎn)運蛋白．通過在線軟件WoLF PSORT進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測，發(fā)現(xiàn)ThPHT1；8蛋白質(zhì)位于細(xì)胞質(zhì)膜上．為了進(jìn)一步了解ThPHT1；8蛋白的特征，利用PHYRE2服務(wù)器，以人類葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白家族(glucose transport protein family)的c5c65A為模板預(yù)測了蛋白的3級結(jié)構(gòu)(見圖2(d))，結(jié)果表明基因所編碼的525個氨基酸中有446氨基酸序列與模型的匹配性高達(dá)100%,，在第1～525位氨基酸建模，模型覆蓋率85%,．鹽芥ThPHT1；8蛋白與其他植物的磷轉(zhuǎn)運蛋白PHT1家族成員具有極其相似的折疊和空間構(gòu)形，這也暗示該蛋白與其他植物PHT1蛋白具有類似的活性和功能．

圖2?ThPHT1；8蛋白的生物信息學(xué)分析

2.3?不同磷濃度處理下ThPHT1;8基因的表達(dá)分析

為了分析低磷脅迫下基因的表達(dá)模式，分別提取在不同磷濃度(0,μmol/L、50,μmol/L、500,μmol/L和對照組1/2,MS(625,mmol/L))培養(yǎng)基中處理不同時間(12,h、24,h、48,h、3,d、7,d)的鹽芥幼苗根部的RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，利用實時定量PCR技術(shù)，分別以1/2,MS上處理不同時間的鹽芥幼苗根部的RNA為對照，檢測不同的磷濃度和脅迫時間下基因在鹽芥根部的表達(dá)模式．

由圖3可知，基因經(jīng)不同濃度磷脅迫處理后，均能被誘導(dǎo)表達(dá)并達(dá)到峰值，之后隨著時間的持續(xù)，表達(dá)量呈現(xiàn)下降再升高的趨勢；不同濃度磷處理下，基因的最高表達(dá)量不同，達(dá)到峰值的誘導(dǎo)時間也不同．其中，0,μmol/L磷濃度處理中，處理12,h時相對表達(dá)量達(dá)到峰值，是對照的2.5倍，與對照差異顯著；50,μmol/L和500,μmol/L磷濃度處理中，基因在磷處理12,h前表達(dá)水平降低，之后持續(xù)受到誘導(dǎo)，48,h時相對表達(dá)量達(dá)到峰值，分別達(dá)到對照的1.70倍和1.55倍．在低磷脅迫48,h之前，0,μmol/L處理下基因的相對表達(dá)量隨處理時間的增加而降低，50,μmol/L和500,μmol/L處理中的相對表達(dá)量隨低磷脅迫時間的增加不斷升高，48,h時達(dá)到峰值；脅迫處理3,d時，3種磷濃度處理中基因的表達(dá)均降低，500,μmol/L磷濃度處理的表達(dá)量下降較大；脅迫處理7,d時，3種磷濃度處理中基因的表達(dá)升高，其中0,μmol/L磷濃度處理的表達(dá)量較高，與對照比較有差異．這表明基因確實參與鹽芥低磷脅迫時的應(yīng)答響應(yīng)，受低磷誘導(dǎo)，而且對于不同磷濃度脅迫有不同的響應(yīng)機(jī)制．

圖3 不同磷濃度處理不同時間后鹽芥根部ThPHT1;8基因的實時定量分析

2.4?過量表達(dá)ThPHT1;8對擬南芥根系的影響

由系統(tǒng)進(jìn)化樹和實時定量PCR結(jié)果可知，屬于高親和力磷酸轉(zhuǎn)運蛋白基因家族的成員．為了進(jìn)一步明確鹽芥在植物體內(nèi)的磷酸轉(zhuǎn)運功能，構(gòu)建過表達(dá)載體pBI121-ThPHT1；8，并通過浸花法轉(zhuǎn)化擬南芥，經(jīng)卡那霉素抗性篩選和基因組PCR鑒定，獲得轉(zhuǎn)基因的T3代轉(zhuǎn)基因擬南芥純合體．以1/2,MS培養(yǎng)基(625,μmol/L)為對照，分析不同磷濃度(0,μmol/L、50,μmol/L、500,μmol/L)處理5,d對轉(zhuǎn)基因擬南芥根系的影響，如圖4所示．

圖4?不同磷濃度處理5,d后35S：ThPHT1;8轉(zhuǎn)基因擬南芥根系結(jié)構(gòu)分析

圖4結(jié)果表明，在正常磷處理(1/2,MS，625,mmol/L)中，轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗根系的生長情況與野生型基本相同．由圖4(a)和(b)可以看出，在3種磷脅迫處理中，轉(zhuǎn)基因擬南芥的主根長度均明顯大于野生型(WT)，隨著磷濃度的提高，野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的主根長度均逐漸增加．其中，0,μmol/L和50,μmol/L磷處理時，轉(zhuǎn)基因擬南芥的平均主根長度分別比野生型長7%,和10%,，差異顯著；500,μmol/L磷處理時，轉(zhuǎn)基因擬南芥比野生型的平均主根長高22%，差異極顯著(見圖4(b))．由圖4(c)可以看出，在3種磷脅迫處理中，轉(zhuǎn)基因擬南芥的側(cè)根密度均小于野生型的側(cè)根密度，而且隨著磷濃度的降低，不僅轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生型的側(cè)根密度逐漸增加，而且兩者的差異越來越大．正常磷處理(對照組1/2,MS)時，轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生型幼苗的側(cè)根密度無顯著差異；而0,μmol/L處理時，野生型的側(cè)根密度比轉(zhuǎn)基因擬南芥的側(cè)根密度高12.7%，差異極顯著．上述結(jié)果表明，為了適應(yīng)低磷脅迫下磷的有效利用，轉(zhuǎn)基因植株根系的生長和形態(tài)建成都發(fā)生了變化．

2.5?過量表達(dá)ThPHT1;8對擬南芥生理指標(biāo)的影響

逆境脅迫下植物體內(nèi)葉綠素含量發(fā)生變化．分析轉(zhuǎn)基因擬南芥與野生型植株在不同磷濃度處理下的葉綠素含量，結(jié)果(見圖5(a))發(fā)現(xiàn)，相同磷濃度處理時，轉(zhuǎn)基因擬南芥的葉綠素含量較野生型均有增加．其中，50,μmol/L和500,μmol/L低磷脅迫下，轉(zhuǎn)基因擬南芥葉綠素含量比野生型分別提高了27.3 %,和18.8 %,，差異極顯著．

花青素積累造成植物莖稈或葉片顏色加深，是植物最明顯的缺磷癥狀．相同磷濃度處理條件下，轉(zhuǎn)基因擬南芥的花青素含量較野生型均有降低．其中，50,μmol/L低磷脅迫下，轉(zhuǎn)基因擬南芥花青素含量比野生型降低了9.9%,，差異顯著．上述結(jié)果表明，在擬南芥中過量表達(dá)基因能顯著降低擬南芥受低磷脅迫的影響．

同時發(fā)現(xiàn)，隨著培養(yǎng)基中磷濃度的降低，轉(zhuǎn)基因擬南芥與野生型中無機(jī)磷、有機(jī)磷、總磷的含量雖都有降低，但是轉(zhuǎn)基因擬南芥中磷含量較野生型高．0,μmol/L缺磷處理時，轉(zhuǎn)基因擬南芥中總磷、無機(jī)磷和有機(jī)磷含量較野生型差異均不明顯；50,μmol/L和500,μmol/L低磷處理時，轉(zhuǎn)基因擬南芥中總磷、無機(jī)磷和有機(jī)磷含量均顯著高于野生型，差異極顯著．這些結(jié)果表明，基因提高了擬南芥在低磷環(huán)境中對基質(zhì)中磷的吸收和利用能力，從而改善了植株的磷營養(yǎng)狀況．

圖5?不同磷濃度處理5,d后35S：ThPHT1;8轉(zhuǎn)基因擬南芥生理指標(biāo)分析

3?討?論

磷酸轉(zhuǎn)運蛋白是植物吸收磷素的主要介質(zhì)，植物通過磷酸轉(zhuǎn)運蛋白將外界無機(jī)磷轉(zhuǎn)化為能夠被植物吸收和利用的有效磷[4]．低磷條件下，植物從土壤中吸收磷以及植物體內(nèi)磷的轉(zhuǎn)運均主要依靠定位于細(xì)胞膜上的高親和力磷酸轉(zhuǎn)運蛋白基因家族調(diào)節(jié)[4].

比較基因組學(xué)是在基因組圖譜和序列分析的基礎(chǔ)上，對已知基因和基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)新基因并預(yù)測其功能、表達(dá)調(diào)控機(jī)制及物種間進(jìn)化關(guān)系的學(xué)科．近年來，在模式植物全基因組測序的基礎(chǔ)上，利用比較基因組學(xué)的方法，國內(nèi)外學(xué)者已鑒定出數(shù)十個編碼磷轉(zhuǎn)運蛋白基因家族成員，并對其功能及表達(dá)模式進(jìn)行了探討[5]．?dāng)M南芥基因家族含9個成員，除了基因在花內(nèi)大量表達(dá)外[28]，其余8個基因不僅在根部表達(dá)，而且在受低磷脅迫時增加轉(zhuǎn)錄水平[28-30]．Mudge等[28]通過對和兩個基因的啟動子分析，發(fā)現(xiàn)這兩個基因不僅負(fù)責(zé)調(diào)控植物根系從土壤溶液中吸收磷，并且調(diào)節(jié)植物體內(nèi)磷素向維管組織轉(zhuǎn)運的基本過程，、、和在從磷源到植物組織的磷酸轉(zhuǎn)運過程中也都起了重要作用[9-10,12,31]．植物家族成員通過復(fù)雜的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)來調(diào)控磷酸轉(zhuǎn)運蛋白的表達(dá)[4]，受低磷脅迫后，高親和力磷酸轉(zhuǎn)運蛋白基因被誘導(dǎo)并優(yōu)先在植物根部表達(dá)，正常磷條件下，高親和力磷酸轉(zhuǎn)運蛋白表達(dá)遲緩．這表明基因可以在低磷條件下發(fā)揮積極的作用，在響應(yīng)環(huán)境脅迫和維持體內(nèi)磷動態(tài)中起重要作用．

前人研究結(jié)果表明，PHT1家族成員是高親和力磷酸轉(zhuǎn)運蛋白[4-19]．已克隆PHT1家族成員的生物信息學(xué)研究表明，PHT1各家族成員之間保守性很強(qiáng)，蛋白分子質(zhì)量58,ku左右，含有520～550個氨基酸殘基，大多數(shù)含12個疏水的跨膜結(jié)構(gòu)域，而且第6個和第7個跨膜域之間被一個親水大環(huán)分隔成2組[4,8].本研究利用生物信息學(xué)手段和比較基因組學(xué)的方法，從鹽芥中克隆了一個與擬南芥基因高度同源的磷酸轉(zhuǎn)運蛋白基因，命名為ThPHT1;8蛋白含有525個氨基酸殘基，蛋白分子質(zhì)量為58.1,ku，等電點6.33，是一個定位在細(xì)胞膜上疏水性、無信號肽的非分泌性蛋白，含有高親和力磷酸轉(zhuǎn)運蛋白典型的12個跨膜域和一個大親水環(huán)的跨膜結(jié)構(gòu)．實時定量PCR結(jié)果表明，低磷脅迫能顯著促進(jìn)基因在鹽芥根部的表達(dá)，不同磷濃度處理下基因的表達(dá)水平不同，說明鹽芥基因不僅參與鹽芥對低磷脅迫的應(yīng)答，而且對不同磷濃度脅迫有不同的應(yīng)答機(jī)制．

根系是植物吸收、利用土壤磷的主要器官．研究發(fā)現(xiàn)，植物能夠根據(jù)土壤中磷的分布及有效磷含量來調(diào)控根系形態(tài)[1]．在低磷情況下，植物將能量向根系轉(zhuǎn)移，促進(jìn)根系生長，側(cè)根密度均會有顯著增加[2-3].現(xiàn)有的研究結(jié)果表明，大多數(shù)基因家族成員主要在根部表達(dá)，且受低磷誘導(dǎo)增強(qiáng)表達(dá)，如擬南芥根部檢測到8個基因的表達(dá)，其中，、和在根表皮細(xì)胞和根毛細(xì)胞中高水平表達(dá)[28-30]，說明基因家族成員在植物根系吸收和轉(zhuǎn)運磷的過程中可能具有重要作用．本研究中，將鹽芥基因在擬南芥中過量表達(dá)，分析不同濃度低磷脅迫處理下轉(zhuǎn)基因擬南芥的根系形態(tài)，發(fā)現(xiàn)與野生型相比，轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗的主根根長有顯著提高，側(cè)根密度下降，這與他人的研究結(jié)果一致．

磷元素是植物生長發(fā)育所必需的礦質(zhì)元素之一，幾乎影響植物所有的生理生化過程．低磷條件下，植物除了在根系形態(tài)方面產(chǎn)生適應(yīng)外，體內(nèi)一些生理生化過程也會發(fā)生變化．葉綠素是與植物光合作用密切相關(guān)的色素，逆境脅迫下植物光合作用減弱，體內(nèi)葉綠素含量降低．花青素是一種廣泛存在于植物中的水溶性色素，花青素積累造成植物莖稈或葉片顏色加深，是植物最明顯的缺磷癥狀之一．因此，葉綠素和花青素含量的變化在一定程度上可以反映植物抗低磷脅迫的能力．本研究中，分析不同濃度磷處理下轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片的葉綠素含量，發(fā)現(xiàn)在相同低磷條件下，轉(zhuǎn)基因擬南芥的葉綠素含量均高于野生型，花青素含量較野生型均有降低．這說明鹽芥基因轉(zhuǎn)化擬南芥后，提高了擬南芥植株在低磷脅迫下的適應(yīng)性，降低了擬南芥受低磷脅迫的影響，可能是由于提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥對基質(zhì)中磷的吸收和利用能力，從而改善了植株的磷營養(yǎng)狀況．本研究中，50,μmol/L和500,μmol/L低磷處理時，轉(zhuǎn)基因擬南芥中總磷和無機(jī)磷含量較野生型增加20%,左右，差異極顯著．上述結(jié)果表明，鹽芥基因能夠提高轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐低磷能力，為土壤磷高效利用型植物分子育種提供了一種有潛力的候選功能基因．

4?結(jié)?語

本文以鹽芥幼苗根部所提取的RNA為材料，克隆到鹽芥磷酸轉(zhuǎn)運蛋白基因．生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，ThPHT1；8蛋白共525個氨基酸殘基，蛋白分子質(zhì)量為58.1,ku，等電點6.33，屬于疏水、無信號肽的非分泌蛋白，定位在細(xì)胞膜上，含高親和力磷酸轉(zhuǎn)運蛋白典型的12個跨膜域和一個大親水環(huán)．實時定量PCR結(jié)果表明，低磷脅迫能顯著促進(jìn)基因在鹽芥根部的表達(dá)，而且對不同磷濃度脅迫有不同的應(yīng)答反應(yīng)．基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥中的研究表明，不同濃度低磷脅迫處理下，與野生型相比，轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗的主根根長增加，側(cè)根密度降低，葉綠素含量、無機(jī)磷和總磷含量提高，花青素含量降低．上述結(jié)果表明，鹽芥基因能夠提高轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐低磷能力，為高效利用土壤磷提供了一種有潛力的候選功能基因．

［1］ Schachtman D P，Reid R J，Ayling S M. Phosphorus uptake by plants：From soil to cell[J].，1998，116(2)：447-453.

［2］ Shen J，Yuan L，Zhang J，et al. Phosphorus dynamics：From soil to plant[J].，2011，156(3)：997-1005.

［3］ Cordell D，Drangert J O，White S. The story of phosphorus：Global food security and food for thought[J].，2009，19(2)：292-305.

［4］ Nussaume L，Kanno S，Javot H，et al. Phosphate import in plants：Focus on the PHT1 transporters[J].，2011，2(83)：1-12.

［5］ M?odzińska E，Zboińska M. Phosphate uptake and allocation—A closer look at. and[J].，2016，7：doi：10. 3389/fpls. 2016. 01198.

［6］ Daram P，Brunner S，Persson B L，et al. Functional analysis and cell specific expression of a phosphate transporter from tomato[J].，1998，206(2)：225-233.

［7］ Sun S，Gu M，Cao Y，et al. A constitutive expressed phosphate transporter，OsPht1；1，modulates phosphate uptake and translocation in Pi-replete rice[J].，2012，159(4)：1571-1581.

［8］ Liu F，Chang X J，Ye Y，et al. Comprehensive sequence and whole-life-cycle expression profile analysis of the phosphate transporter gene family in rice[J].，2011，4(6)：1105-1122.

［9］ Remy E，Cabrito T R，Batista R A，et al. The PHT1；9 and PHT1；8 transporters mediate inorganic phosphate acquisition by theroot during phosphorus starvation[J].，2012，195(2)：356-371.

［10］ Shin H，Shin H S，Dewbre G R，et al. Phosphate transport in：PHT1；1 and PHT1；4 play a major role in phosphate acquisition from both low and high-phosphate environments[J].，2004，39(4)：629-642.

［11］ Jia H，Ren H，Gu M，et al. The phosphate transporter geneis involved in phosphate homeostasis in rice[J].，2011，156(3)：1164-1175.

［12］ Lapis-Gaza H R，Jost R，F(xiàn)innegan P MPHOSPHATE TRANSPORTER1 genesandare involved in root-to-shoot translocation of orthophosphate[J].，2014，14：334.

［13］ Feng Ren，Zhao Caizhi，Liu Chunsen，et al. APHT1 phosphate transporter，BnPht1；4，promotes phosphate uptake and affects roots architecture of transgenic[J].，2014，86(6)：595-607.

［14］ 高亞平. 鹽芥磷高效利用的生理以及分子機(jī)制[D]. 濟(jì)南：山東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，2008.

Gao Yaping. Physiological and Molecular Mechanism of the High Phosphorous Utility Efficiency in[D]. Jinan：College of Life Science，Shandong Normal University，2008(in Chinese).

［15］ 謝全喜. 鹽芥在低磷脅迫下的基礎(chǔ)生理研究[D]. 濟(jì)南：山東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，2009.

Xie Quanxi. Research on Basic Physiology ofUnder Low-Phosphate Stress[D]. Jinan：College of Life Science，Shandong Normal University，2009(in Chinese).

［16］ 王榮春. 鹽芥鈉磷轉(zhuǎn)運體基因在轉(zhuǎn)基因煙草中的功能鑒定[D]. 濟(jì)南：山東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，2008.

Wang Rongchun. Functional Analysis of Na+/Pi Transporter Gene fromin Transgenic Tobacco [D]. Jinan：College of Life Science，Shandong Normal University，2008(in Chinese).

［17］ 高?強(qiáng). 鹽芥轉(zhuǎn)運體基因的功能鑒定和FMO基因的克隆及功能分析[D]. 濟(jì)南：山東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，2009.

Gao Qiang. Function Identity of a Na+/Pi Transporter Gene(ThNPT)and Cloing and Function Analysis of Flavin-Containing Monooxygenase(FMO)Genes from[D]. Jinan：College of Life Science，Shandong Normal University，2009(in Chinese).

［18］ Tamura K，Dudley J，Nei M，et al. Molecular evolutionary genetics analysis(MEGA) software version 4.0[J].，2007，24(8)：1596-1599.

［19］ Kumar S，Nei M，Dudley J，et al. MEGA：A biologist-centric software for evolutionary analysis of DNA and protein sequences[J].，2008，9(4)：299-306.

［20］ Finn R D，Tate J，Mistry J，et al. The Pfam protein families database[J].，2010，38：211-222.

［21］ 李?磊，羅?杰，李?紅，等. 毛果楊全基因組銨轉(zhuǎn)運蛋白家族成員及其序列分析[J]. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2011，39(2)：133-142.

Li Lei，Luo Jie，Li Hong，et al. Genome-wide analysis of the ammonium transporter gene family in[J].：，2011，39(2)：133-142(in Chinese).

［22］ 劉?妍，孟志剛，孫國清，等. 陸地棉1基因的克隆和功能分析[J]. 生物技術(shù)通報，2016，32(2)：90-99.

Liu Yan，Meng Zhigang，Sun Guoqing，et al. Cloning and function analysis gene[J].，2016，32(2)：90-99(in Chinese).

［23］ 張宇航，李永光，王雪松，等. 大豆10基因的克隆及生物信息學(xué)分析[J]. 大豆科學(xué)，2016，35(3)：388-393.

Zhang Yuhang，Li Yongguang，Wang Xuesong，et al. Cloning and bioinformatics analysis ofsoybean[J].，2016，35(3)：388-393(in Chinese).

［24］ 趙?樂，馬利剛，韓杜菀，等. 獨行菜基因的克隆與生物信息學(xué)分析及原核表達(dá)[J]. 北方園藝，2016(6)：92-99.

Zhao Le，Ma Ligang，Han Duwan，et al. Clone and bioinformatic analysis and prokaryotic expression ofgene from[J].，2016(6)：92-99(in Chinese).

［25］ Carter G A，Knapp A K. Leaf optical properties in higher plants：Linking spectral characteristics to stress and chlorophyll concentration[J].，2001，88(4)：677-684.

［26］ 胡?可，韓科廳，戴思蘭. 環(huán)境因子調(diào)控花青素苷合成及呈色的機(jī)理[J]. 植物學(xué)報，2010，45(3)：307-317.

Hu Ke，Han Keting，Dai Silan. Regulation of plant anthocyanin synthesis and pigmentation by environmental factors[J].，2010，45(3)：307-317(in Chinese).

［27］ Raghothama K G，Karthikeyan A S. Phosphate acquisition[J].，2005，274(1/2)：37-49.

［28］ Mudge S R，Rae A L，Diatloff E，et al. Expression analysis suggests novel roles for members of PHT1 family of phosphate transporters in[J].，2002，31(3)：341-353.

［29］ Misson J，Raghothama K G，Jain A，et al. A genome-wide transcriptional analysis usingaffymetrix gene chips determined plant responses to phosphate deprivation[J].，2005，102(33)：11934-11939.

［30］ Morcuende R，Bari R，Gibon Y，et al. Genome-wide reprogramming of metabolism and regulatory networks ofin response to phosphorus[J].，2007，30(1)：85-112.

［31］ Nagarajan V K，Jain A，Poling M D，et al.PHT1；5 mobilizes phosphate between source and sink organs，and influences the interaction between phosphate homeostasis and ethylene signaling[J].，2011，156(3)：1149-1163.

(責(zé)任編輯：田?軍)

Cloning and Function Analysis of ThPHT1;8,Gene inThellungiella Salsuginea

Yang Shaohui，Li Shuang，Kou Yingying，Wang Jiehua，Song Yingjin，Guan Chunfeng

(School of Environmental Science and Engineering，Tianjin University，Tianjin 300350，China)

Phosphorus(P) is one of the most limiting mineral nutrients for plant growth and development. In plants，the uptake from soil and intercellular transport of inorganic phosphate(Pi) are mediated by the PHT1 family. In this work，we obtained the ThPHT1;8 gene through cloning from cDNA of Thellungiella salsuginea seedings roots. Bioinformatics analysis indicated that ThPHT1;8 protein had 525 amino acid residues. The molecular weight of the protein was 58.1 ku and the isoelectric point was 6.33. It was a hydrophobic and non-secreted protein with no signal peptide. ThPHT1;8 possessed the major characteristics of high-affinity phosphate transporters，such as transmembrane structure. Real-time quantitative PCR showed that the expression of ThPHT1;8 was strongly enhanced by low phosphorus stress in roots of Thellungiella salsuginea and the patterns of expression were different under different phosphorus stresses. The biological function of ThPHT1;8 gene indicated that 35S：ThPHT1;8 transgenic Arabidopsis had longer primary roots and less lateral root density than wild-type Arabidopsis under deficient phosphorus conditions. The contents of inorganic phosphorus，total phosphorus and chlorophyll increased in the 35S：ThPHT1;8 transgenic Arabidopsis，but the content of anthocyanin decreased. To conclude，ThPHT1;8 could enhance the tolerance of plants to low environmental phosphorus and improve transgenic Arabidopsis resistance to low phosphorus capacity. The study offers a functional candidate gene for efficient utilization of soil phosphorus.

Thellungiella salsuginea；phosphate transporters；bioinformatics；ThPHT1;8 gene

10.11784/tdxbz201704023

Q785

A

0493-2137(2018)04-0380-09

2017-04-10；

2017-05-08.

楊少輝（1992—），女，博士，副教授，shaohuiyang77@tju.edu.cn.Email：m_bigm@tju.edu.cn

李?爽，lish1128@163.com.

2017-06-14.

http://kns.cnki.net/kcms/detail/12.1127.N.20170614.0909.002.html.

轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(2014ZX0800404B)；天津市應(yīng)用基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計劃資助項目(15JCQNJC14700)．

the National Transgenic Major Project of China(No.,2014ZX0800404B)and the Tianjin Research Program of Application Foundation and Advanced Technology(No.,15JCQNJC14700).