靶向于膠原蛋白的血栓抑制劑LERNSTY開發(fā)

張?麟，郝壇義

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靶向于膠原蛋白的血栓抑制劑LERNSTY開發(fā)

張?麟，郝壇義

(天津大學(xué)化工學(xué)院，天津 300350)

通過荷電氨基酸殘基替換LWWNSYY中的疏水性氨基酸殘基W以優(yōu)化其組成，設(shè)計(jì)獲得血栓抑制劑LERNSTY．研究發(fā)現(xiàn)，LERNSTY溶解度好，能夠有效結(jié)合膠原蛋白，Kd為(1.647±0.303)μmol/L，有效半抑制濃度(IC50)為(2.73±0.48)μg/mL，優(yōu)于LWWNSYY．因此，通過荷電氨基酸的引入優(yōu)化獲得有效的血栓抑制劑LERNSTY，將促進(jìn)療效顯著而副作用小的抗血栓藥物開發(fā)．

動(dòng)脈血栓；膠原蛋白；血栓抑制劑；水溶性

動(dòng)脈血栓阻塞動(dòng)脈血流而導(dǎo)致肢體缺血和組織細(xì)胞壞死，造成心肌梗死和中風(fēng)等嚴(yán)重后果[1-3]．血栓性疾病在我國的發(fā)病率和病死率呈逐年上升的趨勢(shì)．2016年國家心血管病中心組織編撰的《中國心血管病報(bào)告2015》顯示，每5例死亡中就有2例死于心血管?。A(yù)計(jì)到2020年，血栓性疾病造成的經(jīng)濟(jì)損失將遠(yuǎn)超6,500億美元．目前，抗血栓藥物，如抗血小板藥物阿司匹林、抗凝藥物和溶栓藥物華爾法林，主要以血液中血小板或凝血因子為靶點(diǎn)，因而難于區(qū)分血栓形成的病理過程和正常凝血的生理功能，可能破壞正常凝血系統(tǒng)平衡而導(dǎo)致出血風(fēng)險(xiǎn)[4-6]．因此，更換作用靶點(diǎn)開發(fā)療效顯著且副作用小的抗血栓藥物，符合當(dāng)今社會(huì)健康可持續(xù)發(fā)展的迫切需求，具有重要研究意義和經(jīng)濟(jì)價(jià)值．

本課題組在前期工作中，避開血液組分而以血管壁暴露的膠原蛋白為靶點(diǎn)，仿生設(shè)計(jì)篩選獲得高效抑制劑LWWNSYY[7-8]，能夠有效覆蓋膠原蛋白，從而有效抑制血小板與膠原蛋白的結(jié)合，抑制動(dòng)脈血栓形成．然而，LWWNSYY富含疏水性氨基酸殘基而導(dǎo)致水溶性差等問題[9]，限制其實(shí)際應(yīng)用，改善其水溶性十分關(guān)鍵．目前已有多種改善藥物溶解度方法的報(bào)道[10-13]，諸如通過改善藥物的整體分子結(jié)構(gòu)使其具有與溶劑分子相似的結(jié)構(gòu)，通過氫鍵改善藥物溶解度，通過有機(jī)弱酸弱堿藥物支撐可溶性鹽以增加溶解度，通過載體改善藥物分子生物利用度[14-15]，通過在難溶性藥物分子中引入親水基團(tuán)增加其溶解度．例如，通過在不溶于水的維生素K3分子中引入????—SO3HNa制成維生素K3亞硫酸鈉可大幅改善其水?溶性．

因此，本文通過LWWNSYY的組成分析并綜合考慮其設(shè)計(jì)原理，嘗試將其中的W替換為谷氨酸(E)、精氨酸(R)、賴氨酸(K)等荷電氨基酸殘基．根據(jù)膠原蛋白作用位點(diǎn)GFOGER[16]的分布形式(見圖1)，選定ER替換原WW，以和膠原蛋白作用位點(diǎn)中的ER靜電匹配，即W2E和W3R．同時(shí)，為避免疏水性降低過多，用T替換原第6位氨基酸殘基Y，即Y6T，構(gòu)建獲得新序列LERNSTY．通過分子對(duì)接檢測(cè)其與膠原蛋白的結(jié)合能力，通過等溫滴定量熱實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其與膠原蛋白結(jié)合的熱力學(xué)參數(shù)[17-19]，通過體外血小板黏附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其對(duì)血小板聚集(膠原蛋白誘導(dǎo))的抑制效果[20-21]．

圖1?LERNSTY序列的設(shè)計(jì)思路示意

1?材料與方法

1.1?材?料

七肽LWWNSYY、LERNSTY購自上海吉爾生化有限公司，純度＞95%,；膠原蛋白片段(GPO)2-GFOGER(GPO)3購自上海強(qiáng)耀生物科技有限公司，純度＞95%,；抗凝羊血購自廣州蕊特生物科技有限公司；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、乙二醇、氯化鈉、氯化鉀和氯化鎂均為分析純，購自天津光復(fù)精細(xì)化工有限公司．

1.2?方?法

1.2.1?分子對(duì)接

分子對(duì)接選用軟件AUTODOCK VINA 1.1.2[22](http：//vina．scripps．edu/)進(jìn)行，抑制劑作為膠原蛋白的配體，受體與配體結(jié)構(gòu)均以pqbqt的格式儲(chǔ)存．對(duì)接結(jié)果中，用打分函數(shù)值(VINA)評(píng)估配基與膠原蛋白間的親和結(jié)合作用強(qiáng)弱．

1.2.2?等溫滴定量熱測(cè)定

通過等溫滴定量熱(isothermal titration calorimeters，ITC)實(shí)驗(yàn)測(cè)量熱力學(xué)結(jié)合參數(shù)以表征抑制劑與膠原蛋白片段(GPO)2GFOGER(GPO)3之間的相互作用，用量熱儀(VP-ITC，MicroCal，北安普頓)進(jìn)行測(cè)量．樣品池(cell)中注入濃度為50,μmol/L的膠原蛋白溶液，注射器(syringe)中加入濃度為0.4,mmol/L的抑制劑．上述樣品均溶于生理鹽水溶液中，加入前經(jīng)過20,min抽氣處理以避免溶液中氣泡對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響．滴定過程為25滴，每滴滴入體積為10,μL，滴定時(shí)間間隔為350,s．參比基線(reference power)設(shè)定為83.68,μJ/s．初始滴的延遲時(shí)間(initial delay)設(shè)定為800,s．?dāng)嚢柁D(zhuǎn)速設(shè)定為307,r/min．樣品池溫度為10,℃．對(duì)照實(shí)驗(yàn)中，通過滴定生理鹽水來測(cè)定多肽的稀釋焓，并在后續(xù)數(shù)據(jù)處理中扣除．滴定結(jié)果通過MicroCal Origin(版本號(hào)7.0)和單一位點(diǎn)結(jié)合模型(single-site binding model)進(jìn)行處理擬合，其公式為

?(1)

式中：為結(jié)合常數(shù)；為滴定滴數(shù)；0是樣品池膠原蛋白溶液體積；c是膠原蛋白濃度；i是抑制劑溶液濃度；為熱量變化值．從而獲得抑制劑與膠原蛋白片段作用的熱力學(xué)參數(shù)，包括解離常數(shù)d、焓變?chǔ)ぁ㈧刈儲(chǔ)ひ约凹妓棺杂赡茏儲(chǔ)ぃ?/p>

1.2.3?抑制劑對(duì)血小板黏附的抑制效果測(cè)定

通過96微孔板(CellBIND-9018，康寧公司，紐約)開展，實(shí)驗(yàn)步驟如下．

(1) 膠原蛋白的固定．配制膠原蛋白100,μg/mL 溶于0.01,mol/L碳酸鹽緩沖液，pH＝9.6．微孔板中每孔滴加100,μL 膠原蛋白溶液，于18,℃下溫浴 4,h，使膠原蛋白吸附固定在微量孔板表面．隨后加入100,μL 溶于TBS(50,mmol/L Tris-HCl，100,mmol/L 氯化鈉，2,mmol/L 氯化鎂，pH＝7.4)，質(zhì)量濃度為10,mg/mL的牛血清白蛋白(BSA)，在18,℃下溫浴2,h，封閉孔板上未吸附的結(jié)合位點(diǎn)．然后用200,μL TBS清洗微孔3遍．

(2) 膠原蛋白封閉．100,μL不同質(zhì)量濃度的抑制劑LWWNSYY或LERNSTY(50、40、30、25、15、10、5、2、1,μg/mL)添加到固定有膠原蛋白的微孔中，18,℃溫浴1,h，隨后用200,μL TBS清洗微孔3遍.

(3) 血小板吸附．將羊全血離心，取沉淀(血小板)，重懸于吸附緩沖液(TBS＋0.1%, BSA＋2,mmol/L氯化鎂，pH＝7.4)中，室溫下活化1,h. 100,μL 血小板重懸液滴加到固定有膠原蛋白的微孔中，18,℃下溫浴1,h后，用200,μL TBS清洗微孔3遍，除去未吸附的血小板．

(4) 顯色檢測(cè)．配制細(xì)胞溶解液：0.1,mol/L 檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH＝5.4)，包含0.1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))Triton X-100，1,mg/mL磷酸對(duì)硝基苯脂(PNPP).在待測(cè)微孔中加入100,μL細(xì)胞裂解液，18,℃下反應(yīng)1,h后，加入50,μL的氫氧化鈉溶液(3,mol/L)終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀(ELX800，BioTek)檢測(cè)405,nm處的吸光值(405)．通過吸光值與血小板數(shù)量間的正比關(guān)系，換算成抑制劑對(duì)血小板黏附的抑制率．

2?結(jié)果與討論

2.1?分子對(duì)接

前期工作已建立AUTODOCK VINA對(duì)接流程進(jìn)行抑制劑與膠原蛋白結(jié)合情況評(píng)估[7-8]．此處通過對(duì)接檢測(cè)抑制劑LERNSTY與膠原蛋白的結(jié)合情況，對(duì)接構(gòu)象如圖2(a)所示．

圖2?抑制劑與膠原蛋白的對(duì)接構(gòu)象圖

對(duì)接構(gòu)象圖顯示LERNSTY能結(jié)合于膠原蛋白表面，結(jié)合位點(diǎn)與整聯(lián)蛋白a2b1[7]以及LWWNSYY[8]的結(jié)合位點(diǎn)一致．LERNSTY的對(duì)接打分函數(shù)VINA＝ -24.3,kJ/mol，其值為負(fù)，說明LERNSTY與膠原蛋白之間的相互作用利于結(jié)合且結(jié)合較強(qiáng)．在序列設(shè)計(jì)過程中，對(duì)比對(duì)接結(jié)果發(fā)現(xiàn)，VINA(LERNSYY，??-23.0,kJ/mol)小于VINA(LERN-STY)，所以用T替換原第6位氨基酸殘基Y，即Y6T，后續(xù)對(duì)LERNSTY開展實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證．為模擬驗(yàn)證設(shè)計(jì)構(gòu)想中抑制劑和膠原蛋白作用位點(diǎn)靜電作用對(duì)匹配(見圖1)的效果，通過對(duì)比對(duì)接結(jié)果發(fā)現(xiàn)，VINA(LERNSTY)＜VINA(LRENSTY)，表明抑制劑中第2、3位置的氨基酸殘基的靜電空間分布對(duì)結(jié)合效果的影響很大．當(dāng)?shù)?、3位置的氨基酸殘基電荷排列為負(fù)、正時(shí)，恰好與膠原蛋白結(jié)合位點(diǎn)GFOGER中ER排列相匹配，促進(jìn)結(jié)合(見圖1)．反之，當(dāng)?shù)?、3位置的氨基酸殘基電荷排列為正、負(fù)時(shí)，與膠原蛋白中ER排列相排斥，則減弱結(jié)合．圖2(b)中所示LRENSTY與膠原蛋白的分子對(duì)接構(gòu)象也顯示，LRENSTY與膠原蛋白距離較遠(yuǎn)，無法很好結(jié)合到膠原蛋白表面．對(duì)接結(jié)果驗(yàn)證了本文所提出的改造設(shè)計(jì)思路的合理性，LERNSTY通過與膠原蛋白之間的序列匹配和靜電吸引促進(jìn)結(jié)合．

2.2?多肽與膠原蛋白的結(jié)合

等溫滴定量熱實(shí)驗(yàn)顯示，生理鹽水溶液中LERNSTY與膠原蛋白作用的解離常數(shù)為(1.647±0.303)μmol/L，結(jié)合自由能為Δ＝－31.301,kJ/mol，說明LERNSTY能夠與膠原蛋白自發(fā)結(jié)合．結(jié)合過程的熱力學(xué)常數(shù)列于表1．其中，焓變?chǔ)ご笥诹悖砻髟摻Y(jié)合為吸熱過程，熵變?chǔ)ご笥诹闱掖笥陟首儲(chǔ)?，說明該過程為疏水相互作用驅(qū)動(dòng)．兩者結(jié)合后，由于靜電吸引和疏水作用等作用力，形成穩(wěn)定復(fù)合物，不易解離．而LWWNSYY得到的滴定曲線無法擬合，印證其因?yàn)樽陨硎杷畧F(tuán)聚而無法和膠原蛋白很好結(jié)合(見圖3)．

表1?抑制劑與膠原蛋白結(jié)合的熱力學(xué)常數(shù)

Tab.1?Thermodynamic binding constants for inhibitors on collagen

2.3?抑制劑對(duì)血小板黏附的抑制效果

利用96孔板和酶標(biāo)儀測(cè)量抑制劑對(duì)膠原蛋白誘導(dǎo)的血小板黏附的抑制效果．通過測(cè)定抑制率隨抑制劑質(zhì)量濃度的變化曲線如圖4所示，利用Hill方程進(jìn)行曲線擬合，計(jì)算式為

???(2)

式中：＝1；代表最大抑制率IRmax；代表有效半抑制濃度IC50；為抑制劑質(zhì)量濃度；為吸附抑制率.

所得待定參數(shù)結(jié)果如圖5所示．結(jié)果顯示，LERNSTY和LWWNSYY均能抑制血小板黏附．隨質(zhì)量濃度升高，抑制率逐漸變大；當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到一定值后，抑制率也達(dá)到上限．圖5顯示，LERNSTY的最大抑制率IRmax為84.69%±4.53%,，低于LWWNSYY的最大抑制率94.76%±3.58%,，表明LWWNSYY和膠原蛋白的作用力更強(qiáng)．然而LWWNSYY的有效半抑制濃度IC50為(3.40±0.28)μg/mL，高于LERNSTY的(2.73±0.48)μg/mL，表明LERNSTY具有更好的抑制效果．對(duì)比分析表明，LWWNSYY和膠原蛋白的結(jié)合作用力較強(qiáng)，但是水溶性差、分散性差等原因?qū)е缕湫纬删奂w而無法與膠原蛋白有效結(jié)合，因而無法有效抑制血小板在膠原蛋白的黏附，導(dǎo)致較高的有效半抑制濃度．通過引入帶電基團(tuán)，LERNSTY有更好的水溶性和分散性，能夠結(jié)合于膠原蛋白的多肽單體濃度高，因而表現(xiàn)出較低的IC50，在血液環(huán)境中的抑制效果優(yōu)于LWWNSYY．

圖4 抑制劑對(duì)血小板固相吸附的抑制率隨質(zhì)量濃度變化曲線

圖5 抑制劑抑制膠原蛋白誘導(dǎo)的血小板黏附效果

3?結(jié)?語

通過膠原蛋白作用位點(diǎn)分析，引入帶電基團(tuán)序列ER，構(gòu)建新型血栓抑制劑LERNSTY，其良好的水溶性增強(qiáng)其生物利用度．相比于LWWNSYY，LERNSTY能夠通過靜電作用的匹配優(yōu)化與膠原蛋白的結(jié)合，其解離常數(shù)d值為1.647,μmol/L．血小板黏附抑制實(shí)驗(yàn)也表明，LERNSTY對(duì)血小板黏附的抑制效率(IC50)相比于LWWNSYY提高19.71%,，抑制效果顯著．因此，本文基于結(jié)合位點(diǎn)及結(jié)合作用分析，提出通過靜電作用對(duì)的匹配對(duì)血栓抑制劑進(jìn)行改造的方法，在改善水溶性的同時(shí)也能夠改善其結(jié)合性能和后續(xù)抑制效果，獲得新型血栓抑制劑LERNSTY，為血栓抑制劑開發(fā)奠定基礎(chǔ)．

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(責(zé)任編輯：田?軍)

Development of Thrombus Inhibitor LERNSTY Targeted at Collagen

Zhang Lin，Hao Tanyi

(School of Chemical Engineering and Technology，Tianjin University，Tianjin 300350，China)

A thrombus inhibitor LERNSTY was designed based on the optimization of LWWNSYY by replacing the hydrophobic amino acid residue W with charged amino acid residues. LERNSTY was found to have good solubility. It could effectively bind with collagen with a Kd of (1.647±0.303) μmol/L. An effective half inhibitory concentration (IC50) of (2.73±0.48) μg/mL was obtained, which was better than that of LWWNSYY. Therefore, an effective thrombus inhibitor LERNSTY was obtained through the introduction of charged amino acid residues, which would facilitate the development of curative antithrombotic drugs with fewer side effects.

arterial thrombosis；collagen；thrombus inhibitor；solubility

10.11784/tdxbz201704012

TQ464.7

A

0493-2137(2018)04-0401-05

2017-04-05；

2017-05-05.

張?麟（1981—??），男，博士，教授.Email：m_bigm@tju.edu.cn

張?麟，linzhang@tju.edu.cn.

2017-05-17.

http://kns.cnki.net/kcms/detail/12.1127.N.20170517.1127.004.html．

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(91534119)；天津大學(xué)自主創(chuàng)新基金資助項(xiàng)目.

the National Natural Science Foundation of China(No.,91534119)and the Innovation Foundation of Tianjin University.