高效液相色譜法測定水產(chǎn)品中喹乙醇影響因素及消除

韓梅　于盟盟　梁娟　季本安　李淑翠

摘要：對水產(chǎn)品中喹乙醇高效液相色譜-紫外法檢測過程中加標回收率偏低問題進行了分析，找出實驗過程中影響喹乙醇回收率偏低的原因。通過增加無水硫酸鈉及定容液的添加量，延長對旋蒸瓶的震蕩時間，降低影響因素對實驗結(jié)果的影響，并進行討論，方法回收率71%～79%之間，實驗結(jié)果滿足分析實驗的要求。

關鍵詞：高效液相色譜-紫外法；水產(chǎn)品；喹乙醇

喹乙醇（Olaquindox），又稱喹酰胺醇，商品名稱為快育靈、倍育諾，具有良好的廣譜抗菌效果和促生長作用，以前被廣泛用于獸藥及水產(chǎn)品飼料添加劑中。但由于喹乙醇有中度至明顯的蓄積毒性，其通過食物鏈進人人體后對人有潛在的致畸形、致突變、致癌作用，《中國獸藥典》（2005版）明確規(guī)定喹乙醇被禁止用于家禽及水產(chǎn)養(yǎng)殖中。

隨著養(yǎng)殖業(yè)的高速發(fā)展及集約化養(yǎng)殖模式下的不規(guī)范運作，導致病害問題日趨嚴重，加之當今零星的和不完整的疾病知識與技術，疾病一旦發(fā)生，濫用抗生素和化學藥物時有發(fā)生，水產(chǎn)品違禁藥物的使用仍屢禁不止，水產(chǎn)品中喹乙醇超標問題屢有報道，為保障食品安全和廣大人民群眾的身體健康，從源頭上對水產(chǎn)品安全進行把控，對水產(chǎn)品中喹乙醇的檢測刻不容緩。水產(chǎn)品中喹乙醇檢測過程中，由于水產(chǎn)品復雜的成分及喹乙醇自身性質(zhì)等原因，造成一般常用的高效液相色譜一紫外法檢測過程中加標回收率偏低，本文針對造成回收率偏低的影響因素進行討論并消除，盡可能減少實驗的誤差，使檢測結(jié)果準確可靠。

1材料與方法

1.1材料

喹乙醇標準品（Dr.Ehrenstorfer 99.0%），甲醇、乙腈為上海安譜色譜純，實驗樣品為大菱鲆、海參及中國對蝦等多種水產(chǎn)品。

1.2儀器與設備

Agilentl200高效液相色譜儀：紫外檢測器，高速冷凍離心機（STl6R），美國熱電公司；超聲波清洗器；氮吹儀；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。

1.3色譜分析條件

1.3.1分析條件 XDB-C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5um），檢測器波長380 nm，進樣量20gL，柱溫35℃，流動相為甲醇-水（15+85）溶液，流量1.0 mL/min。

1.3.2喹乙醇的提取 稱取5.00 g樣品置于50mL離心管中，加入無水硫酸鈉10 g攪勻，再加入乙腈30 mL，渦旋混合2 min，于振蕩器上振蕩提取15 min，以4 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min，將上清液倒入125 mL棕色旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中，再向離心管中加入乙腈20 mL，重復操作一次，合并上清液。

1.3.3喹乙醇去脂 在40℃水浴下旋轉(zhuǎn)減壓蒸餾至近干，向棕色旋蒸瓶中加入流動相2.00 mL和正己烷（用乙腈飽和）5 mL，充分洗滌溶解殘留物后，倒人10 mL離心管中，以4 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min，下層液體經(jīng)O.45um微孑L濾膜過濾后進行測定。

2結(jié)果與分析

2.1水產(chǎn)品中喹乙醇測定過程中回收率低的影響因素及消除

喹乙醇測定過程中，由于喹乙醇見光分解速度很快，謝小華等證實在直射光條件下，白色瓶中喹乙醇0.75 h后完全被分解，低于儀器的檢出限。實驗過程中應注意避光，盡量在光線較暗的環(huán)境下操作，液相進樣小瓶用棕色材質(zhì)，樣品處理完后應立即上機測試。

喹乙醇旋蒸結(jié)束后，脂肪等雜質(zhì)殘留于旋蒸瓶壁上，導致喹乙醇不易被流動相洗脫出來，加入正己烷和流動相后應充分混合振蕩，在漩渦振蕩器上振蕩5 min，確保旋蒸瓶壁上全部的喹乙醇被溶解在流動相內(nèi)。

實驗過程中提高流動相的加入量，一方面提高喹乙醇提取率，另一方面由于流動相的比例增大，降低旋蒸不干對定量及喹乙醇液相測試出峰時間的影響，對檢測結(jié)果的準確有很大意義。

2.2水產(chǎn)品喹乙醇測定過程中旋蒸不干的影響因素及消除

水產(chǎn)品含有相當比例的水分，喹乙醇提取劑為乙腈，乙腈與水互溶，樣品前處理過程中混雜了水溶性蛋白，如果樣品中水不完全去除，喹乙醇提取液在40℃水浴不易被濃縮蒸干，將旋蒸不干的樣品加入流動相定容上機，會造成流動相被稀釋和流動相量的增加，導致喹乙醇定量的不準確和出峰時間的偏移。提取過程中向樣品中加入無水硫酸鈉，應確保無水硫酸鈉的干燥。無水硫酸鈉在馬弗爐中650℃烘干，置人干燥器內(nèi)冷卻后使用，對于含水率較大的樣品適量增加無水硫酸鈉的用量。

2.3水產(chǎn)品喹乙醇測定過程中流動相配比問題

于慧娟等證實甲醇一水分離體系優(yōu)于乙腈一水，甲醇-水為分離喹乙醇的流動相。流動相中甲醇含量15%，甲醇含量越高（>30%），保留時間就越短；而甲醇含量越低（<10%），保留時間就越長，經(jīng)實驗確定甲醇一水的最佳配比為15：85（體積比）。在此分離條件下，喹乙醇峰形對稱，柱效高，且與樣品本底有良好的分離。

2.4水產(chǎn)品中喹乙醇測定過程中去脂不完全問題

水產(chǎn)品喹乙醇檢測過程中，由于樣品中脂肪含量比較高，易被乙腈提取出來，加入正己烷去脂過程中由于去脂不完全，容易造成有脂肪與定容液分離不完全，導致離心管中下層定容液內(nèi)存在脂肪，實驗過程中，對去脂不完全的樣品，棄去上層已被脂肪飽和的正己烷，繼續(xù)在離心管中添加正己烷，漩渦振蕩，重復去脂，直至下層提取液變清，能夠滿足液相上機檢測的要求。

2.5增加無水硫酸鈉及定容液的添加量、延長雞心瓶的震蕩時間提高回收率

實驗過程中，我們通過將不同品種的水產(chǎn)品添加標準溶液，制成不同濃度的陽性樣品，分別對無水硫酸鈉及定容液的添加量、雞心瓶的震蕩時間進行試驗，以提高加標回收率。常規(guī)方法是無水硫酸鈉的添加量為O.04 g、定容液的添加量為1 mL、雞心瓶的振蕩時間為60 s；方法改進后，無水硫酸鈉的添加量增至為0.05～0.06 g、定容液的添加量增至為1.02～1.03 mL、雞心瓶的振蕩時間增至為90～100 s。

結(jié)果表明，方法改進前回收率在48%～60%（見表1），方法回收率偏低。方法改進后回收率在71%～79%（見表2）。通過實驗證明改進后的實驗結(jié)果能夠滿足分析實驗對檢測結(jié)果準確可靠性的判定要求。

3結(jié)論與討論

喹乙醇凈化過程中適當提高定容液的用量，旋蒸瓶需要長時間振蕩，確保喹乙醇完全被定容液提取出來。

樣品處理完后盡量縮短上機時間，保證樣品盡快測量，降低喹乙醇的自然損失，盡量提高喹乙醇的回收率。

光照對喹乙醇檢測結(jié)果影響較大，檢測過程中應注意嚴格避光（嚴格避光條件下光照強度為0.11x），除了做到用棕色雞心瓶和棕色進樣小瓶，在前處理的過程中，每一步應采取避光措施。

樣品脂肪含量過高，提取液出現(xiàn)乳化現(xiàn)象時，為了防止正己烷去脂肪帶來的待測成分的損失，最佳方法是50～60℃水浴，重新渦旋振蕩并離心。若還存在乳化現(xiàn)象，再采取重復加正己烷去脂的方法，并且重復1～2次即可。