奶牛乳腺上皮細(xì)胞中SCAP和SREBP1蛋白調(diào)控SCD基因表達的作用研究

韓立強，孫　宇，付　彤，廉紅霞，高騰云

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院/農(nóng)業(yè)部動物生化與營養(yǎng)重點實驗室，鄭州 450002)

固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(SREBPs)是調(diào)控細(xì)胞內(nèi)膽固醇和甘油三酯合成，維持脂肪穩(wěn)態(tài)的主要調(diào)控因子[1-2]。固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白裂解激活蛋白(SREBP cleavage activating protein，SCAP)是SREBP的結(jié)合蛋白。哺乳動物SCAP蛋白一般由跨膜螺旋(TM)和羧基(C)末端組成，其中SCAP的TM構(gòu)成了一個固醇敏感結(jié)構(gòu)域，C末端結(jié)構(gòu)域與SREBP前體在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜形成復(fù)合物[3-4]。在細(xì)胞內(nèi)膽固醇減少后，SREBP-SCAP復(fù)合物從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)移到高爾基體，隨后SREBP前體蛋白的N末端發(fā)生蛋白酶水解，生成的SREBP片段進入細(xì)胞核調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄，而SREBP前體蛋白的C末端通過未知機制從SCAP中移除，SCAP蛋白再從高爾基體回到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，然后與新合成的SREBP前體蛋白循環(huán)結(jié)合[5]。

已經(jīng)有多個研究發(fā)現(xiàn)，SCAP-SREBP是調(diào)控固醇和脂肪代謝的關(guān)鍵信號通路[6]，介導(dǎo)了細(xì)胞內(nèi)cAMP等多種分子對機體脂肪代謝的調(diào)節(jié)[7-8]。對反芻動物的研究發(fā)現(xiàn)，奶牛乳腺作為分泌乳脂的主要器官，胰島素及一些信號分子能夠調(diào)控乳腺上皮細(xì)胞的SREBP基因表達[9-10]。本實驗室前期通過構(gòu)建奶牛SREBP表達載體及硬脂酰輔酶A 去飽和酶基因(SCD)啟動子載體發(fā)現(xiàn)，在奶牛乳腺上皮細(xì)胞中SREBP1可以促進SCD基因的轉(zhuǎn)錄[11-12]，但在SCAP作用下對SREBP1調(diào)控SCD基因轉(zhuǎn)錄的影響還不清楚。

本研究通過在奶牛乳腺上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)染SCD啟動子載體，共轉(zhuǎn)染SCAP和SREBP1真核表達載體，分析對SCD啟動子活性及其基因表達的影響，為闡明奶牛乳腺細(xì)胞中SCAP-SREBP1通路對于脂肪代謝基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制打下基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1　試驗材料

奶牛乳腺上皮細(xì)胞由實驗室保存，奶牛SCAP真核表達載體(pcDNA3.1-SCAP)、SREBP1真核表達載體(pcDNA3.1-SREBP1)、奶牛pGL3-SCD2/SCD3啟動子載體為實驗室前期構(gòu)建的SCD基因啟動子熒光素酶報告基因表達載體[11](序列長度分別為381和417 bp，其中奶牛pGL3-SCD3含有SRE元件，結(jié)構(gòu)見圖1) 由實驗室構(gòu)建，熒光定量PCR儀(Eppendorf，德國)，Opti-mem無血清培養(yǎng)基(Gibco，美國)，DMEM培養(yǎng)基(Hyclone)，Lipofectamine3000(Thermo，美國)，雙熒光素酶檢測試劑盒(Promega，美國)，SYBR Green(百泰克)，c-MYC Antibody(9E10)(Santa Cruz，美國)，Alexa Fluor?488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)(Invitrogen,美國)，二氧化碳培養(yǎng)箱(Sanyo，日本)，F(xiàn)luroskan Ascent FL熒光和化學(xué)發(fā)光檢測儀(Thermo，美國)，激光共聚焦顯微鏡(Carl Zeiss LSM 5 PASCAL，德國)。

圖1　奶牛pGL3-SCD2/SCD3啟動子的結(jié)構(gòu)Fig.1　Structure of dairy pGL3-SCD2/SCD3 promoters

1.2　方　法

1.2.1雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測SCD啟動子活性將奶牛乳腺上皮細(xì)胞接種于24孔板培養(yǎng)，放入5% CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。將構(gòu)建好的pGL3-SCD2和pGL3-SCD3啟動子用Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染至細(xì)胞，進行不同的轉(zhuǎn)染處理分組：對照組(轉(zhuǎn)染1.0 μg pcDNA3.1質(zhì)粒)，SCAP組(轉(zhuǎn)染1.0 μg SCAP質(zhì)粒)，SREBP1組(轉(zhuǎn)染1.0 μg SREBP1質(zhì)粒)，SCAP+SREBP1組(轉(zhuǎn)染1.0 μg SCAP+1.0 μg SREBP1質(zhì)粒)，作用24 h后收集細(xì)胞加入裂解液，同時轉(zhuǎn)染內(nèi)參海腎熒光素酶質(zhì)粒，采用熒光和化學(xué)發(fā)光檢測儀檢測熒光素酶活性并進行分析，相對啟動子熒光素酶活性=螢火蟲熒光素酶活性/海腎熒光素酶活性。

1.2.2熒光素酶活性檢測SCAP與SCD啟動子的量效關(guān)系乳腺上皮細(xì)胞接種于24孔板，將pGL3-SCD3質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染細(xì)胞，進行不同的轉(zhuǎn)染處理分組：對照組(2.0 μg pcDNA3.1)，SREBP1組(1.0 μg pcDNA3.1+1.0 μg SREBP1)，SCAP(0.1)組(0.1 μg SCAP+0.9 μg pcDNA3.1+1.0 μg SREBP1)，SCAP(0.5)組(0.5 μg SCAP+0.5 μg pcDNA3.1+1.0 μg SREBP1),SCAP(1.0)組(1.0 μg SCAP+1.0 μg SREBP1質(zhì)粒)，作用24 h后，收集細(xì)胞進行啟動子活性檢測，采用回歸分析檢測SCAP質(zhì)粒含量與SCD基因啟動子活性之間的量效關(guān)系。

1.2.3免疫熒光觀察SREBP1蛋白在細(xì)胞核的表達在24 孔板中加入細(xì)胞爬片后接種培養(yǎng)乳腺上皮細(xì)胞，進行不同的轉(zhuǎn)染處理分組：對照組(Control，轉(zhuǎn)染1.0 μg pcDNA3.1 +1.0 μg SREBP1)，SCAP組(SCAP，轉(zhuǎn)染1.0 μg SCAP+1.0 μg SREBP1質(zhì)粒)，培養(yǎng)12 h后用PBS漂洗3次，多聚甲醛固定后用PBS漂洗，室溫脫脂奶粉封閉2 h后，c-myc(9E10)一抗(1∶500)4 ℃孵育過夜，PBS漂洗后用綠色熒光標(biāo)記的驢抗鼠IgG二抗(1∶1 000)37 ℃孵育1 h， 進行免疫熒光標(biāo)記，PBS漂洗后，DAPI復(fù)染細(xì)胞核，封片后在激光共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞核中SREBP1的熒光表達情況。

1.2.4熒光定量PCR檢測SCD基因mRNA的表達將乳腺上皮細(xì)胞經(jīng)過胰酶消化后分散到12孔板中培養(yǎng)，進行不同的轉(zhuǎn)染處理分組：對照組(轉(zhuǎn)

染1.0 μg pcDNA3.1)，SCAP組(轉(zhuǎn)染1.0 μg SCAP質(zhì)粒)，SREBP1組(轉(zhuǎn)染1.0 μg SREBP1質(zhì)粒)，SCAP+SREBP1組(轉(zhuǎn)染1.0 μg SCAP+1.0 μg SREBP1質(zhì)粒)，培養(yǎng)48 h后Trizol提取RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。在NCBI上搜索奶牛SCD基因序列(NM_173959)，并用Primer3 Plus設(shè)計熒光定量引物(表1)，以cDNA為模板，利用SYBR Green擴增熒光定量PCR檢測SCD基因mRNA的表達。同時以牛UXT基因(NM_001037471)作為內(nèi)參基因，利用相對定量法計算不同處理對SCD基因mRNA表達的倍數(shù)差異。

表1熒光定量PCR引物

Table1Primersusedforquantitativereal-timePCRanalysis

引物Primer序列(5'-3')Sequence產(chǎn)物長度/bpSizeSCD-FCGACGTGGCTTTTTCTTCTC158SCD-RCACAACAACAGGACACCAGGUXT-FCAGCTGGCCAAATACCTTCAA125UXT-RGTGTCTGGGACCACTGTGTCAA

1.2.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計試驗數(shù)據(jù)采用SPSS10.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，Sigmaplot作圖，*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001。

2　結(jié)　果

2.1　奶牛乳腺上皮細(xì)胞中SCAP對SCD啟動子轉(zhuǎn)錄的影響

由圖2可知，在乳腺上皮細(xì)胞中轉(zhuǎn)染 pGL3-SCD2啟動子后，與對照組相比，SREBP1組和SCAP組的SCD2啟動子活性值有所下降，而SCAP+SREBP1組SCD2啟動子活性值顯著下降(P<0.05)。在轉(zhuǎn)染 pGL3-SCD3啟動子的乳腺上皮細(xì)胞中，與對照組相比，SCAP組對啟動子活性無顯著影響，SREBP1組啟動子活性值極顯著升高到114.53 (P<0.01)，SCAP+SREBP1組啟動子活性值極顯著升高到192.81(P<0.001)，并且SCAP+SREBP1組與SREBP1組之間SCD3啟動子活性值也達到極顯著差異(P<0.01)。

圖2　SCAP對SCD基因啟動子活性的影響Fig.2　Effect of SCAP on promoter activity of SCD gene

2.2　奶牛乳腺上皮細(xì)胞中SCAP與SCD啟動子轉(zhuǎn)錄的量效關(guān)系

由圖3可知，與對照組轉(zhuǎn)染pcDNA3.1相比，轉(zhuǎn)染SREBP1組啟動子活性值為55.66 (P<0.01)，隨著SCAP質(zhì)粒含量的增加，SCD基因啟動子活性值從64.41(SCAP= 0.1 μg)增加到169.07(SCAP=1.0 μg)，回歸分析發(fā)現(xiàn)，SCAP質(zhì)粒濃度與SCD基因啟動子活性呈極顯著的量效關(guān)系(P<0.01)。

2.3　SCAP對SREBP1蛋白在奶牛乳腺上皮細(xì)胞核表達的影響

由圖4可知，對照組乳腺上皮細(xì)胞核中只有少量SREBP1表達綠色熒光，與DAPI染的細(xì)胞核藍色融合(Merge)后主要呈現(xiàn)藍色。轉(zhuǎn)染SCAP組細(xì)胞核中SREBP1綠色熒光表達明顯增多，與DAPI重疊后呈現(xiàn)出融合的青光。

2.4　SCAP及SREBP1蛋白對奶牛乳腺上皮細(xì)胞中SCD基因mRNA表達的影響

由圖5可知，與對照組相比，SCAP組細(xì)胞中SCD基因的表達量無明顯變化。SREBP1組顯著上調(diào)1.23倍(P<0.05)，SCAP+SREBP1組顯著上調(diào)1.54倍(P<0.05)，而SREBP1組與SCAP+SREBP1組SCD基因表達相比差異不顯著(P=0.21)。

Control. 2.0 μg pcDNA3.1;SREBP1. 1.0 μg pcDNA3.1+1.0 μg SREBP1;SCAP(0.1). 0.1 μg SCAP+0.9 μg pcDNA3.1+1.0 μg SREBP1；SCAP(0.5). 0.5 μg SCAP+0.5 μg pcDNA3.1+1.0 μg SREBP1；SCAP(1.0). 1.0 μg SCAP+1.0 μg SREBP1圖3　SCAP調(diào)控SCD基因啟動子活性的量效關(guān)系Fig.3　Dose-response relationship between SCAP and SCD promoter activity

SCAP(-) . 1.0 μg pcDNA3.1 +1.0 μg SREBP1;SCAP(+). 1.0 μg SCAP+1.0 μg SREBP1圖4　SCAP對SREBP1核蛋白表達的影響 600×Fig.4　Effect of SCAP on the nuclear SREBP1 expression 600×

圖5　SCAP與SREBP1對乳腺上皮細(xì)胞SCD基因mRNA表達的影響Fig.5　Effects of SCAP and SREBP1 on mRNA expression of SCD in mammary epithelial cells

3　討　論

SREBPs是一種調(diào)控脂代謝的轉(zhuǎn)錄因子，通過包含兩個跨膜序列的中心結(jié)構(gòu)域錨定在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，其N端結(jié)構(gòu)域是堿性環(huán)-螺旋-亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)，能夠結(jié)合靶基因啟動子上的增強子序列以激活轉(zhuǎn)錄，這些增強子序列被稱為固醇應(yīng)答元件(SRE)[13-14]。本研究前期構(gòu)建的SCD基因啟動子序列，SCD3啟動子比SCD2啟動子多的36 bp片段中含有SRE序列(圖1)，轉(zhuǎn)染SREBP1后發(fā)現(xiàn)SCD3啟動子的活性顯著升高，這符合SREBP1能夠結(jié)合在基因啟動子SRE上促進轉(zhuǎn)錄的性質(zhì)，其他研究也發(fā)現(xiàn)過表達SREBP能夠促進SCD基因的轉(zhuǎn)錄[15]。SREBP的蛋白活性受到多種分子的調(diào)控[16]，其中包括SCAP蛋白[17]。研究表明，采用siRNA沉默小鼠SCAP基因后發(fā)現(xiàn)其肝的SREBP信號通路及下游靶基因表達受到抑制[18]。本試驗在轉(zhuǎn)染SCAP+SREBP1質(zhì)粒時發(fā)現(xiàn)，SCD3啟動子的活性比單獨轉(zhuǎn)染SREBP1的活性顯著升高，結(jié)合SCAP質(zhì)粒的濃度與SCD3啟動子活性呈現(xiàn)出的量效關(guān)系，表明SCAP作為SREBP1的結(jié)合蛋白，能夠增強SREBP1促進SCD基因轉(zhuǎn)錄的作用。

SCAP作為SREBP的相互作用蛋白，其調(diào)控作用主要體現(xiàn)在SCAP能夠通過與SREBP結(jié)合轉(zhuǎn)運其到高爾基體進行水解，進一步釋放SREBP進入細(xì)胞核[19-20]。在SCAP基因敲除的MA10細(xì)胞中重新轉(zhuǎn)染SCAP質(zhì)粒，能夠顯著增加核SREBP蛋白的表達[7]。本研究采用免疫熒光觀察發(fā)現(xiàn)，SCAP組的細(xì)胞核內(nèi)有更多的SREBP1蛋白表達(圖4)，表明SCAP增強了SREBP1前體蛋白向核的轉(zhuǎn)運，相應(yīng)的也會增加下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，與本研究中SCD基因啟動子的結(jié)果相互印證(圖2、圖3)。C.M.Cheng等[21]通過免疫熒光發(fā)現(xiàn)，在葡萄糖刺激下增加細(xì)胞SCAP的表達，也能夠提高SREBP在細(xì)胞核的表達。SREBP1作為調(diào)控奶牛乳腺細(xì)胞中脂肪合成的主要轉(zhuǎn)錄因子[22]，在乳腺細(xì)胞中轉(zhuǎn)染SREBP能夠增加脂類基因的表達[23-24]。為進一步驗證SCAP及SREBP對SCD基因表達的作用，本研究在乳腺細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染這兩種質(zhì)粒，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SREBP1能夠顯著上調(diào)乳腺細(xì)胞SCD基因的表達，這與在羊乳腺上皮細(xì)胞中的研究結(jié)果相一致[25]，同時發(fā)現(xiàn)，SCAP+SREBP1組也能夠顯著上調(diào)細(xì)胞中SCD基因的表達，并且其倍數(shù)高于SREBP1組。雖然SCAP+SREBP1與SREBP1組之間統(tǒng)計分析差異不顯著，但這一結(jié)果也佐證了SCAP能夠促進SREBP1對于SCD基因的調(diào)控作用。

X.Gong等[26]采用晶體衍射法發(fā)現(xiàn)，在裂殖酵母SCAP蛋白C端有7個WD重復(fù)序列形成的結(jié)構(gòu)域，在與SREBP的C-端結(jié)合以促進SREBP前體蛋白轉(zhuǎn)運過程中發(fā)揮重要作用，因此進一步研究奶牛等反芻動物SCAP蛋白結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系，對于闡明乳腺細(xì)胞脂肪合成調(diào)控機制具有重要意義。

4　結(jié)　論

本研究發(fā)現(xiàn)，SCAP可以通過增加SREBP1蛋白在細(xì)胞核中的表達，促進對SCD基因的轉(zhuǎn)錄激活作用，為深入闡明奶牛乳腺細(xì)胞中SCAP-SREBP1通路對乳脂肪合成的表達調(diào)控機制提供了理論基礎(chǔ)。

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2.4 兩組患兒瓣膜反流情況 對照組患兒術(shù)后新發(fā)瓣膜反流13例(32.5%)，主動脈瓣反流6例(15.0%)；觀察組術(shù)后新發(fā)瓣膜反流6例(14.6%)，主動脈瓣反流4例(9.8%)。兩組患兒新發(fā)瓣膜反流發(fā)生率對比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=7.933，P<0.05)。

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